Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этой статье мы опишем метод, который позволяет провести декальцификацию свежеполученных костных тканей и сохранить высококачественную РНК. Также проиллюстрирован метод среза образцов недеминерализованной кости с фиксированным парафином формалином (FFPE) для получения результатов хорошего качества, если свежие ткани недоступны или не могут быть собраны.
Понимание взаимосвязи между клетками и их расположения в каждой ткани имеет решающее значение для раскрытия биологических процессов, связанных с нормальным развитием и патологией заболевания. Пространственная транскриптомика является мощным методом, который позволяет анализировать весь транскриптом в образцах тканей, тем самым предоставляя информацию об экспрессии клеточных генов и гистологическом контексте, в котором находятся клетки. В то время как этот метод широко используется для многих мягких тканей, его применение для анализа твердых тканей, таких как кости, было сложной задачей. Основная проблема заключается в невозможности сохранить РНК и морфологию тканей хорошего качества при обработке образцов твердых тканей для среза. Таким образом, здесь описан метод обработки свежеполученных образцов костной ткани для эффективного получения пространственных транскриптомных данных. Этот метод позволяет проводить декальцификацию образцов, обеспечивая успешные срезы тканей с сохраненными морфологическими деталями, избегая при этом деградации РНК. Кроме того, приведены подробные рекомендации для образцов, которые ранее были залиты парафином, без деминерализации, таких как образцы, собранные из банков тканей. С использованием этих рекомендаций представлены высококачественные данные пространственной транскриптомики, полученные из образцов банка тканей первичной опухоли и метастазирования в легкие остеосаркомы костей.
Кость – это специализированная соединительная ткань, состоящая в основном из волокон коллагена 1 типа и неорганических солей1. В результате кость получается невероятно прочной и жесткой, в то же время легкой и травмостойкой. Большая прочность кости обусловлена содержанием в ней минералов. Фактически, при любом заданном увеличении процентного содержания минералов жесткость увеличивается в пятьраз2. Следовательно, исследователи сталкиваются со значительными проблемами при анализе биологии костного образца с помощью гистологического среза.
Гистология недекальцинированной кости возможна, а иногда ....
Все описанные ниже процедуры на животных были одобрены в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию в Школе стоматологической медицины Университета Питтсбурга.
1. Способ получения блоков FFPE образцов костной ткани, требующих деминерализации
Представленный здесь метод описывает, как обрабатывать свежевыделенные кости для получения деминерализованных образцов FFPE, которые можно легко разрезать с помощью микротома с сохранением целостности РНК (рис. 1). Этот метод был успешно применен на бедренных костях мыш?.......
В данном случае подробно описан способ получения блоков FFPE из декальцинированных костей и сохранения целостности РНК для секвенирования (т.е. секвенирования нового поколения (NGS)) или для других методов, связанных с РНК (т.е. гибридизация in situ , количественная полимеразная цепная ре?.......
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Эта работа была поддержана фондами Питтсбургского центра лечения саркомы (PCS) и Института остеосаркомы (OSI).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены