Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы опишем метод, который позволяет провести декальцификацию свежеполученных костных тканей и сохранить высококачественную РНК. Также проиллюстрирован метод среза образцов недеминерализованной кости с фиксированным парафином формалином (FFPE) для получения результатов хорошего качества, если свежие ткани недоступны или не могут быть собраны.

Аннотация

Понимание взаимосвязи между клетками и их расположения в каждой ткани имеет решающее значение для раскрытия биологических процессов, связанных с нормальным развитием и патологией заболевания. Пространственная транскриптомика является мощным методом, который позволяет анализировать весь транскриптом в образцах тканей, тем самым предоставляя информацию об экспрессии клеточных генов и гистологическом контексте, в котором находятся клетки. В то время как этот метод широко используется для многих мягких тканей, его применение для анализа твердых тканей, таких как кости, было сложной задачей. Основная проблема заключается в невозможности сохранить РНК и морфологию тканей хорошего качества при обработке образцов твердых тканей для среза. Таким образом, здесь описан метод обработки свежеполученных образцов костной ткани для эффективного получения пространственных транскриптомных данных. Этот метод позволяет проводить декальцификацию образцов, обеспечивая успешные срезы тканей с сохраненными морфологическими деталями, избегая при этом деградации РНК. Кроме того, приведены подробные рекомендации для образцов, которые ранее были залиты парафином, без деминерализации, таких как образцы, собранные из банков тканей. С использованием этих рекомендаций представлены высококачественные данные пространственной транскриптомики, полученные из образцов банка тканей первичной опухоли и метастазирования в легкие остеосаркомы костей.

Введение

Кость – это специализированная соединительная ткань, состоящая в основном из волокон коллагена 1 типа и неорганических солей1. В результате кость получается невероятно прочной и жесткой, в то же время легкой и травмостойкой. Большая прочность кости обусловлена содержанием в ней минералов. Фактически, при любом заданном увеличении процентного содержания минералов жесткость увеличивается в пятьраз2. Следовательно, исследователи сталкиваются со значительными проблемами при анализе биологии костного образца с помощью гистологического среза.

Гистология недекальцинированной кости возможна, а иногда ....

протокол

Все описанные ниже процедуры на животных были одобрены в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию в Школе стоматологической медицины Университета Питтсбурга.

1. Способ получения блоков FFPE образцов костной ткани, требующих деминерализации

  1. Подготовка реагентов и материалов
    1. Приготовьте ЭДТА 20% pH 8,0. Для 1 л растворите 200 г ЭДТА в 800 мл сверхчистой воды, отрегулируйте pH до 8,0 с помощью гидроксида натрия 10 N и, наконец, доведите объем до 1 л с помощью сверхчистой воды. Хранить при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежеприготовленный EDTA....

Результаты

Представленный здесь метод описывает, как обрабатывать свежевыделенные кости для получения деминерализованных образцов FFPE, которые можно легко разрезать с помощью микротома с сохранением целостности РНК (рис. 1). Этот метод был успешно применен на бедренных костях мыш?.......

Обсуждение

В данном случае подробно описан способ получения блоков FFPE из декальцинированных костей и сохранения целостности РНК для секвенирования (т.е. секвенирования нового поколения (NGS)) или для других методов, связанных с РНК (т.е. гибридизация in situ , количественная полимеразная цепная ре?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана фондами Питтсбургского центра лечения саркомы (PCS) и Института остеосаркомы (OSI).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced orbital shakerVWR76683-470Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair BrushesTed Pella11859Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns10X GenomicsPN-1000251Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 ProofDecon Labs Inc2701Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)Thermo Fisher ScientificS312-500Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. 
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose ForcepsFisher Scientific16-100-110Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision ProbeFisher Scientific12-000-153Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome bladesCL SturkeyD554DDUse to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PENovogeneN/ASequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM GradeElectron Microscopy Sciences15714-SDilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-049Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath Fisher ScientificA84600061Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface DecontaminantThermo Fisher Scientific7002Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE KitQiagen73604Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsRM2245Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxideMillipore SigmaS8045-500Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger10X Genomics2.0.1Use to process sequencing data output .
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit10X GenomicsPN-1000194Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small 10X GenomicsPN-1000363Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns 10X GenomicsPN-1000188Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
XyleneLeica Biosystems3803665Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.

Ссылки

  1. Baig, M. A., Bacha, D. . Histology. Bone. , (2024).
  2. Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
  3. Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены