Методы обеспечения пространственной транскриптомики костных тканей

Резюме

В этой статье мы опишем метод, который позволяет провести декальцификацию свежеполученных костных тканей и сохранить высококачественную РНК. Также проиллюстрирован метод среза образцов недеминерализованной кости с фиксированным парафином формалином (FFPE) для получения результатов хорошего качества, если свежие ткани недоступны или не могут быть собраны.

Аннотация

Понимание взаимосвязи между клетками и их расположения в каждой ткани имеет решающее значение для раскрытия биологических процессов, связанных с нормальным развитием и патологией заболевания. Пространственная транскриптомика является мощным методом, который позволяет анализировать весь транскриптом в образцах тканей, тем самым предоставляя информацию об экспрессии клеточных генов и гистологическом контексте, в котором находятся клетки. В то время как этот метод широко используется для многих мягких тканей, его применение для анализа твердых тканей, таких как кости, было сложной задачей. Основная проблема заключается в невозможности сохранить РНК и морфологию тканей хорошего качества при обработке образцов твердых тканей для среза. Таким образом, здесь описан метод обработки свежеполученных образцов костной ткани для эффективного получения пространственных транскриптомных данных. Этот метод позволяет проводить декальцификацию образцов, обеспечивая успешные срезы тканей с сохраненными морфологическими деталями, избегая при этом деградации РНК. Кроме того, приведены подробные рекомендации для образцов, которые ранее были залиты парафином, без деминерализации, таких как образцы, собранные из банков тканей. С использованием этих рекомендаций представлены высококачественные данные пространственной транскриптомики, полученные из образцов банка тканей первичной опухоли и метастазирования в легкие остеосаркомы костей.

Введение

Кость – это специализированная соединительная ткань, состоящая в основном из волокон коллагена 1 типа и неорганических солей¹. В результате кость получается невероятно прочной и жесткой, в то же время легкой и травмостойкой. Большая прочность кости обусловлена содержанием в ней минералов. Фактически, при любом заданном увеличении процентного содержания минералов жесткость увеличивается в пять^раз2. Следовательно, исследователи сталкиваются со значительными проблемами при анализе биологии костного образца с помощью гистологического среза.

Гистология недекальцинированной кости возможна, а иногда и необходима, в зависимости от типа исследования (например, для изучения микроархитектуры кости); Тем не менее, это очень сложная задача, особенно если экземпляры крупные. В этих случаях обработка тканей в гистологических целях требует нескольких модификаций стандартных протоколов и методик³. Как правило, для проведения общих гистологических оценок костные ткани декальцифицируются сразу после фиксации, что может занять от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от размера ткани и используемого декальцифицирующего агента^. Декальцинированные срезы часто используются для обследования костного мозга, диагностики опухолей и т.д. Существует три основных типа декальцинирующих агентов: сильные кислоты (например, азотная кислота, соляная кислота), слабые кислоты (например, муравьиная кислота) и хелатирующие агенты (например, этилендиаминэтрицензиновая кислота или ЭДТА)⁵. Сильные кислоты могут очень быстро декальцинировать кость, но они могут повредить ткани; слабые кислоты очень распространены и подходят для диагностических процедур; Хелатирующие агенты на сегодняшний день являются наиболее используемыми и подходящими для исследовательского применения, поскольку в этом случае процесс деминерализации является медленным и щадящим, что позволяет сохранить высококачественную морфологию и сохранить информацию о генах и белках, как того требуют многие процедуры (например, гибридизация in situ , иммуноокрашивание). Однако, когда необходимо сохранить весь транскриптом, например, для анализа экспрессии генов, даже медленная и щадящая деминерализация может быть вредной. Следовательно, необходимы более совершенные подходы и методы, когда морфологический анализ тканей должен сочетаться с анализом экспрессии генов клеток.

Благодаря недавним усовершенствованиям в секвенировании РНК одиночных клеток (scRNA-seq) и пространственной транскриптомике, теперь стало возможным изучать экспрессию генов образца ткани даже в тех случаях, когда для хранения образцов тканей использовалось парафиновложение фиксации формалина (FFPE) ^6,7,8. Эта возможность открыла доступ к большему количеству образцов, например, хранящихся в банках тканей по всему миру. Если необходимо использовать scRNA-seq, наиболее важным требованием является целостность РНК; однако в случае пространственной транскриптомики образцов FFPE для визуализации экспрессии гена в гистологическом контексте каждого среза ткани необходимы как высококачественные срезы ткани, так и высококачественные РНК. В то время как это было легко достигнуто с помощью мягких тканей, этого нельзя сказать о твердых тканях, таких как кости. На самом деле, насколько нам известно, ни одно исследование с использованием пространственной транскриптомики никогда не проводилось на образцах костей FFPE. Это связано с отсутствием протоколов, которые могли бы эффективно обрабатывать костные ткани FFPE с сохранением содержания в них РНК. В этом случае сначала предлагается метод обработки и декальцинации свежеполученных образцов костной ткани, избегая деградации РНК. Затем, признавая необходимость транскриптомного анализа образцов FFPE, собранных в банках тканей по всему миру, также представлены разработанные рекомендации по надлежащему обращению с образцами FFPE недеминерализованных костей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все описанные ниже процедуры на животных были одобрены в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию в Школе стоматологической медицины Университета Питтсбурга.

1. Способ получения блоков FFPE образцов костной ткани, требующих деминерализации

1. Подготовка реагентов и материалов
   1. Приготовьте ЭДТА 20% pH 8,0. Для 1 л растворите 200 г ЭДТА в 800 мл сверхчистой воды, отрегулируйте pH до 8,0 с помощью гидроксида натрия 10 N и, наконец, доведите объем до 1 л с помощью сверхчистой воды. Хранить при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежеприготовленный EDTA 20% pH 8,0. Гидроксид натрия (NaOH) 10 N получают путем растворения 400 г NaOH в 1 л сверхчистой воды.
   2. Приготовьте параформальдегид (PFA) 4% в вытяжном шкафу, используя 1x PBS без кальция и магния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обозначьте область в вытяжном шкафу для работы с концентрированными растворами параформальдегида или твердыми веществами параформальдегида и обозначьте ее соответствующим образом. Чтобы избежать воздействия, держите контейнеры как можно более закрытыми. Используйте в наименьших практических количествах, необходимых для проведения проводимого эксперимента. Если в вытяжном шкафу нельзя использовать порошок параформальдегида для взвешивания и весы, сначала возьмите контейнер, затем добавьте порошок PFA в колпак и крышку, прежде чем вернуться к весам для взвешивания порошка. Всегда используйте свежеприготовленный 4% PFA.
   3. Используйте подходящую емкость для каждого экземпляра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для 1 мг костной ткани используйте контейнер, который позволяет контактировать с костью не менее 1 мл любого раствора.
   4. Простерилизуйте все хирургическое оборудование, необходимое для вскрытия.
   5. Очистите все участки обеззараживающим раствором для удаления РНКазы.
   6. Соберите оставшиеся экспериментальные материалы, включая контейнеры со льдом, 70% этанол в аэрозоле, и получите доступ к орбитальному шейкеру.
2. Выделение образцов костной ткани у мышей
   1. Усыпьте мышь путем воздействия CO₂ , затем выполните шейный вывих и положите ее на спину. Сбрызните кожу мыши 70% этанолом.
   2. С помощью стерильных ножниц для рассечения вскройте кожу и обнажите мышцу ноги. Разрежьте мышцу вдоль ноги, чтобы получить четкое представление о положении кости, и аккуратно расчлените кость, чтобы удалить ее без повреждений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости полностью удалять всю мышцу, прикрепленную к кости. Старайтесь действовать как можно быстрее, чтобы ограничить деградацию РНК.
   3. Немедленно поместите образец кости в пробирку, содержащую 4% ПФА, и положите пробирку на лед.
   4. Повторите процедуру, чтобы собрать другие образцы кости по желанию.
   5. Поместите образцы с 4% PFA в перемешанном состоянии на орбитальный шейкер при 140 об/мин при 4 °C не менее чем на 24 часа, чтобы обеспечить надлежащую фиксацию.
3. Декальцинация образцов костной ткани
   1. Извлеките костную ткань из орбитального шейкера после фиксации.
   2. Промойте костную ткань 2 раза с помощью 1x PBS в течение 3 минут на орбитальном шейкере при 140 об/мин, чтобы удалить остатки PFA.
   3. С помощью стерильных ножниц для препарирования удалите все оставшиеся мышцы, все еще прикрепленные к кости.
   4. Промойте костную ткань еще раз 1x PBS в течение 3 минут.
   5. Поместите костную ткань в новый контейнер с 20% ЭДТА pH 8,0. Затем поместите контейнер на орбитальный шейкер со скоростью 140 об/мин на 30 минут при комнатной температуре (RT).
   6. Выбросьте раствор, добавьте свежий 20% EDTA pH 8,0 в контейнер и поместите его на орбитальный шейкер при 140 об/мин на 30 минут при RT.
   7. Повторите шаг 1.3.6 10 раз.
   8. Выбросьте раствор, добавьте свежий 20% ЭДТА pH 8,0 в контейнер и поместите его при температуре 4 °C в холодное помещение на орбитальный шейкер при 140 об/мин на ночь.
4. Обезвоживание образцов костной ткани
   1. Извлеките образец костной ткани из контейнера.
   2. Осмотрите ткань и убедитесь в эффективности декальциноза, аккуратно поворачивая и скручивая кость. В качестве альтернативы можно провести рентгенографию кости с помощью рентгеновского аппарата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец легко изгибается, то достигается хорошая степень декальцинации. Если нет, то следует увеличить параметры декальцинации (время, скорость перемешивания, используемый объем 20% ЭДТА pH 8,0 и т.д.).
   3. Промойте костную ткань 2 раза 1x PBS в течение 3 минут, чтобы удалить остатки ЭДТА.
   4. Поместите костную ткань в новый контейнер и инициируйте обезвоживание с помощью 70% этанола. Инкубировать в течение 15 минут при 140 об/мин.
   5. Выбросьте 70% раствор этанола, поместите образец в 90% раствор этанола и инкубируйте в течение 15 минут при 140 оборотах в минуту.
   6. Выбросьте 90% раствор этанола, поместите образец в 100% этанол и инкубируйте в течение 15 минут при 140 оборотах в минуту.
   7. Выбросьте 100% этанол, поместите образец в новый 100% этанол и инкубируйте в течение 15 минут при 140 оборотах в минуту.
   8. Выбросьте 100% этанол, поместите образец в новый 100% этанол и инкубируйте в течение 15 минут при 140 оборотах в минуту.
   9. Выбросьте 100% этанол, поместите образец в новый 100% этанол и инкубируйте в течение 30 минут при 140 оборотах в минуту.
   10. Выбросьте 100% этанол, поместите образец в новый 100% этанол и инкубируйте в течение 45 минут при 140 об/мин.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоживание также может быть выполнено с помощью автоматического процессора. В этом случае настройте программу с теми же условиями, которые сообщаются для ручного обезвоживания. Заявленные условия относятся к образцам толщиной не более 4 мм (т.е. образцам костной ткани, полученным от мышей). Для образцов толщиной более 4 мм время обезвоживания должно быть определено экспериментально.
5. Очистка образцов костной ткани
   1. Поместите образец костной ткани в новый контейнер и начните процесс очищения с помощью ксилола. Инкубировать в течение 20 минут при 140 об/мин.
   2. Выбросьте использованный ксилол, добавьте новый ксилол и инкубируйте еще 20 минут при 140 об/мин.
   3. Выбросьте использованный ксилол, добавьте новый ксилол и инкубируйте в течение 45 минут при 140 оборотах в минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка также может быть выполнена с помощью автоматического процессора. В этом случае настройте программу с теми же условиями, которые сообщаются для ручной очистки. Заявленные условия относятся к образцам толщиной не более 4 мм (т.е. образцам костной ткани, полученным от мышей). Для образцов толще 4 мм сроки необходимо определять экспериментально.
6. Инфильтрация и внедрение образцов костной ткани
   1. После очистки возьмите образец костной ткани из орбитального шейкера/автоматического процессора.
   2. Поместите образец костной ткани в закладную кассету и начните инфильтрацию воском (см. Таблицу материалов). Выдерживать в течение 30 минут при температуре 60 °C.
   3. Выбросьте использованный воск, добавьте новый воск и выдерживайте в течение 30 минут при температуре 60 °C.
   4. Выбросьте использованный воск, добавьте новый воск и выдерживайте в течение 45 минут при температуре 60 °C.
   5. Аккуратно поместите образец костной ткани в форму с нужной ориентацией.
   6. Дайте блоку застыть на холодной поверхности.
   7. Полученный FFPE хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока не будет готов к началу секционирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блок FFPE может храниться в течение многих лет до проведения секционирования.

2. Методические рекомендации по секционированию недеминерализованных проб FFPE

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие рекомендации содержат ценные советы и инструкции, полезные для значительного улучшения качества участков ткани при одновременном предотвращении деградации РНК, особенно в случаях небольших образцов кости без декальцинации. Эти рекомендации также могут быть применены к образцам декальцинированной кости, если таковые имеются. Для более крупных образцов костной ткани следует проводить деминерализацию для получения срезов лучшего качества; В таких случаях следует следовать описанному выше методу, а параметры (сроки, объемы растворов и т.д.) должны быть соответствующим образом скорректированы. Следующие рекомендации подходят либо в том случае, если костные ткани FFPE уже были обработаны (например, блок FFPE, собранный в банках тканей или других лабораториях), либо когда собранные срезы будут использоваться для выполнения любого типа анализа, требующего хорошего качества РНК, высококачественных срезов тканей или того и другого.

1. Подготовка оборудования
   1. Опрыскайте все рабочие поверхности и инструменты обеззараживающими растворами для удаления РНКазы.
   2. Приготовьте водяную баню с двойной дистиллированной водой и установите температуру 42 °C.
   3. Возьмите лезвие микротома, распылите на него 70% этанола для удаления остатков масла, затем распылите на него обеззараживающие растворы для удаления РНКазы.
   4. Закрепите лезвие на микротоме. Убедитесь, что угол зазора установлен на 10°.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте новые лезвия для резки.
   5. Приготовьте два ведра льда.
   6. Возьмите пинцет, щетки и зонды, распылите на них обеззараживающие растворы для удаления РНКаз и поместите их в одно из двух ведер со льдом.
   7. Приготовьте ледяную баню, добавив в другое ведро со льдом двойную дистиллированную воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: блок FFPE не должен плавать в добавляемой воде; Поэтому количество добавленной воды в ведро со льдом должно быть достаточным для того, чтобы образец был влажным, не всплывая.
2. Секционирование
   1. Извлеките блок FFPE из хранилища при температуре 4 °C и поместите его на микротом. Установите команду на Обрезать или на 14 μм толщины прокрутки и начните обрезать образец до тех пор, пока ткань не обнажится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если блок FFPE уже был обрезан и ткань уже обнажена, пропустите шаг 2.2.1. Убедитесь, что в блоке нет отверстий и трещин. Если это так, переходите непосредственно к шагу 2.2.2. Если нет, разрежьте несколько участков, чтобы выровнять поверхность и избежать отверстий и трещин, а затем перейдите к шагу 2.2.2.
   2. Поместите блок FFPE на ледяную баню, чтобы увлажнить образец. Время гидратации необходимо определить опытным путем.
      1. Начните с 2 минут и увеличьте время, если гидратации недостаточно. Не превышайте 10 минут. Увлажнение расширит ткани и уменьшит образование «венецианских жалюзи» и линий. Более длительное время гидратации может привести к появлению трещин в парафиновом блоке и, возможно, отслоению тканей.
      2. Если 10 минут недостаточно для гидратации образца, то выполните циклы гидратации не дольше 10 минут и повторите попытку срезов.
      3. Если поверхность блока не является гладкой и чистой из-за трещин или порезов, рассмотрите возможность повторного встраивания образца. Процесс повторного встраивания не повлияет на качество РНК.
   3. Поместите образец в зажим для образцов микротома, совместите его с лезвием и начните секционирование. Установите толщину шнека на 5 мкм.
   4. Соберите срез и поместите его на водяную баню при температуре 42 °C с помощью холодного пинцета и щеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если будет выполняться выделение РНК срезов тканей, соберите срезы в центрифужную пробирку и следуйте производственным спецификациям для получения РНК (см. Таблицу материалов).
   5. Инкубируйте участок на водяной бане, чтобы растянуть ткани и устранить любые остаточные морщины и складки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время плавания в водяной бане для каждой секции должно быть определено экспериментально. Подумайте о том, чтобы оставить участки кости на дополнительную минуту, если возникают проблемы с отслоением тканей. Не оставляйте участок плавающим слишком долго, так как длительное время плавания может повредить ткань.
   6. Поместите секцию на предметное стекло, затем инкубируйте ее в течение 3 часов при температуре 42 °C.
   7. Поместите предметное стекло в эксикатор или духовку на ночь при RT для правильной сушки.
   8. Храните предметное стекло с прикрепленной секцией в RT в коробке для слайдов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут храниться в RT в течение многих лет. Если будет проводиться пространственная транскриптомия, вместо предметного стекла поместите участок на предметное стекло для пространственной экспрессии генов, предоставленное производителем, и следуйте приведенным рекомендациям (см. Таблицу материалов).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Представленный здесь метод описывает, как обрабатывать свежевыделенные кости для получения деминерализованных образцов FFPE, которые можно легко разрезать с помощью микротома с сохранением целостности РНК (рис. 1). Этот метод был успешно применен на бедренных костях мыш?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В данном случае подробно описан способ получения блоков FFPE из декальцинированных костей и сохранения целостности РНК для секвенирования (т.е. секвенирования нового поколения (NGS)) или для других методов, связанных с РНК (т.е. гибридизация in situ , количественная полимеразная цепная ре?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.