Méthodes pour permettre la transcriptomique spatiale des tissus osseux

Résumé

Nous décrivons ici une méthode qui permet de décalcifier les tissus osseux fraîchement obtenus et de préserver l’ARN de haute qualité. Une méthode est également illustrée pour sectionner des échantillons d’os non déminéralisés contenant de la paraffine fixe au formol (FFPE) afin d’obtenir des résultats de bonne qualité si les tissus frais ne sont pas disponibles ou ne peuvent pas être recueillis.

Résumé

Comprendre la relation entre les cellules et leur emplacement dans chaque tissu est essentiel pour découvrir les processus biologiques associés au développement normal et à la pathologie de la maladie. La transcriptomique spatiale est une méthode puissante qui permet d’analyser l’ensemble du transcriptome dans des échantillons de tissus, fournissant ainsi des informations sur l’expression des gènes cellulaires et le contexte histologique dans lequel les cellules résident. Bien que cette méthode ait été largement utilisée pour de nombreux tissus mous, son application pour l’analyse des tissus durs tels que les os a été difficile. Le principal défi réside dans l’incapacité à préserver une bonne qualité de l’ARN et la morphologie des tissus lors du traitement des échantillons de tissus durs pour la section. Par conséquent, une méthode est décrite ici pour traiter des échantillons de tissu osseux fraîchement obtenus afin de générer efficacement des données transcriptomiques spatiales. La méthode permet de décalcifier les échantillons, ce qui permet d’obtenir des coupes de tissus avec des détails morphologiques préservés tout en évitant la dégradation de l’ARN. De plus, des lignes directrices détaillées sont fournies pour les échantillons qui étaient auparavant intégrés à la paraffine, sans déminéralisation, tels que les échantillons prélevés dans des banques de tissus. À l’aide de ces directives, des données transcriptomiques spatiales de haute qualité générées à partir d’échantillons de banques de tissus de tumeurs primaires et de métastases pulmonaires d’ostéosarcome osseux sont présentées.

Introduction

L’os est un tissu conjonctif spécialisé composé principalement de fibres de collagène de type 1 et de sels inorganiques¹. En conséquence, l’os est incroyablement solide et rigide tout en étant léger et résistant aux traumatismes. La grande force de l’os provient de sa teneur en minéraux. En fait, pour une augmentation donnée du pourcentage de teneur en minéraux, la rigidité est multipliée^{par cinq} 2. Par conséquent, les chercheurs sont confrontés à des problèmes importants lorsqu’ils analysent, au moyen d’une coupe histologique, la biologie d’un échantillon osseux.

L’histologie osseuse non décalcifiée est réalisable et parfois nécessaire, selon le type d’investigation (par exemple, pour étudier la micro-architecture de l’os) ; C’est cependant très difficile, surtout si les spécimens sont grands. Dans ces cas, le traitement des tissus à des fins histologiques nécessite plusieurs modifications des protocoles et techniques standard³. En général, pour effectuer des évaluations histologiques courantes, les tissus osseux sont décalcifiés juste après la fixation, un processus qui peut prendre de quelques jours à plusieurs semaines, selon la taille du tissu et l’agent décalcifiant utilisé⁴. Les coupes décalcifiées sont souvent utilisées pour l’examen de la moelle osseuse, le diagnostic des tumeurs, etc. Il existe trois principaux types d’agents décalcifiants : les acides forts (par exemple, l’acide nitrique, l’acide chlorhydrique), les acides faibles (par exemple, l’acide formique) et les agents chélateurs (par exemple, l’acide éthylènediaminetétracetique ou EDTA)⁵. Les acides forts peuvent décalcifier les os très rapidement, mais ils peuvent endommager les tissus ; les acides faibles sont très courants et conviennent aux procédures de diagnostic ; Les agents chélateurs sont de loin les plus utilisés et les plus appropriés pour la recherche car, dans ce cas, le processus de déminéralisation est lent et doux, ce qui permet de conserver une morphologie de haute qualité et de préserver l’information sur les gènes et les protéines, comme l’exigent de nombreuses procédures (par exemple, hybridation in situ , immunomarquage). Cependant, lorsque l’ensemble du transcriptome doit être préservé, comme pour les analyses d’expression génique, même une déminéralisation lente et douce peut être préjudiciable. Par conséquent, de meilleures approches et méthodes sont nécessaires lorsque l’analyse morphologique des tissus doit être associée à des analyses de l’expression génique des cellules.

Grâce aux récentes améliorations du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) et de la transcriptomique spatiale, il est désormais possible d’étudier l’expression génique d’un échantillon de tissu, même lorsque l’enrobage de paraffine de fixation au formol (FFPE) a été utilisé pour stocker^{les échantillons de tissus.} Cette opportunité a permis d’accéder à un plus grand nombre d’échantillons, tels que ceux stockés dans des banques de tissus du monde entier. Si le scRNA-seq doit être utilisé, l’intégrité de l’ARN est l’exigence la plus importante ; cependant, dans le cas de la transcriptomique spatiale des échantillons FFPE, des coupes de tissus de haute qualité et de l’ARN de haute qualité sont nécessaires pour visualiser l’expression génique dans le contexte histologique de chaque section de tissu. Bien que cela ait été facilement réalisé avec les tissus mous, on ne peut pas en dire autant des tissus durs comme les os. En effet, à notre connaissance, aucune étude utilisant la transcriptomique spatiale n’a jamais été réalisée sur des échantillons osseux FFPE. Cela est dû à l’absence de protocoles capables de traiter efficacement les tissus osseux FFPE tout en préservant leur contenu en ARN. Ici, une méthode pour traiter et décalcifier des échantillons de tissu osseux fraîchement obtenus tout en évitant la dégradation de l’ARN est d’abord fournie. Ensuite, reconnaissant la nécessité d’une analyse transcriptomique des échantillons FFPE collectés dans les banques de tissus du monde entier, des directives élaborées pour manipuler correctement les échantillons FFPE d’os non déminéralisés sont également présentées.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux décrites ci-dessous ont été approuvées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’École de médecine dentaire de l’Université de Pittsburgh.

1. Méthode de préparation de blocs FFPE d’échantillons de tissu osseux nécessitant une déminéralisation

1. Préparation des réactifs et des matériaux
   1. Préparez l’EDTA 20% pH 8.0. Pour 1 L, dissoudre 200 g d’EDTA dans 800 mL d’eau ultrapure, ajuster le pH à 8,0 avec de l’hydroxyde de sodium 10 N et enfin porter le volume à 1L avec de l’eau ultrapure. Conserver à température ambiante.
      REMARQUE : Utilisez toujours de l’EDTA 20% pH 8,0 fraîchement préparé. L’hydroxyde de sodium (NaOH) 10 N est préparé en dissolvant 400 g de NaOH dans 1 L d’eau ultrapure.
   2. Préparez du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans une hotte en utilisant 1 fois PBS sans calcium ni magnésium.
      REMARQUE : Désignez une zone dans une hotte pour travailler avec des solutions concentrées de paraformaldéhyde ou des solides de paraformaldéhyde et étiquetez-la comme telle. Pour éviter l’exposition, gardez les contenants fermés autant que possible. Utiliser dans les plus petites quantités pratiques nécessaires à l’expérience réalisée. Si le pesage de la poudre de paraformaldéhyde et la balance ne peuvent pas être utilisés dans une hotte, prenez d’abord un récipient, puis ajoutez de la poudre PFA dans la hotte et le couvercle avant de retourner à la balance pour peser la poudre. Utilisez toujours 4% de PFA fraîchement préparé.
   3. Utilisez un récipient adapté à chaque échantillon.
      REMARQUE : Par exemple, pour 1 mg de tissu osseux, utilisez un récipient qui permet d’entrer en contact avec l’os à au moins 1 ml de n’importe quelle solution.
   4. Stérilisez tout le matériel chirurgical nécessaire à la dissection.
   5. Nettoyez toutes les zones avec une solution décontaminante pour éliminer les RNases.
   6. Collectez les matériaux expérimentaux restants, y compris des récipients de glace, un spray d’éthanol à 70 %, et ayez accès à un agitateur orbital.
2. Isolement d’échantillons de tissu osseux de souris
   1. Euthanasier la souris par exposition au CO₂ , puis effectuer une luxation cervicale et la coucher sur le dos. Vaporisez la peau de la souris avec de l’éthanol à 70%.
   2. À l’aide de ciseaux de dissection stériles, ouvrez la peau et exposez le muscle de la jambe. Coupez le muscle le long de la jambe pour obtenir une vue claire de la position de l’os, et désarticulez doucement l’os pour le retirer sans l’endommager.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’enlever entièrement tout le muscle attaché à l’os. Essayez d’être le plus rapide possible pour limiter la dégradation de l’ARN.
   3. Placez immédiatement l’échantillon d’os dans un tube contenant 4 % de PFA et placez le tube sur de la glace.
   4. Répétez la procédure pour prélever d’autres échantillons d’os si vous le souhaitez.
   5. Placez les échantillons contenant 4 % de PFA en agitation sur un agitateur orbital à 140 tr/min à 4 °C pendant au moins 24 h pour permettre une bonne fixation.
3. Décalcification d’échantillons de tissu osseux
   1. Récupérez le tissu osseux de l’agitateur orbital après la fixation.
   2. Laver le tissu osseux 2 fois avec 1x PBS pendant 3 min sur un agitateur orbital à 140 tr/min pour éliminer tout PFA restant.
   3. À l’aide de ciseaux de dissection stériles, retirez tous les muscles restants encore attachés à l’os.
   4. Lavez le tissu osseux une fois de plus avec 1x PBS pendant 3 min.
   5. Placez le tissu osseux dans un nouveau récipient avec 20% d’EDTA pH 8,0. Ensuite, placez le récipient sur un agitateur orbital à 140 tr/min pendant 30 min à température ambiante (RT).
   6. Jetez la solution, ajoutez de l’EDTA frais à 20 % pH 8,0 dans le récipient et placez-la sur un agitateur orbital à 140 tr/min pendant 30 min à RT.
   7. Répétez l’étape 1.3.6 10 fois.
   8. Jetez la solution, ajoutez de l’EDTA frais à 20 % pH 8,0 dans le récipient et placez-la à 4 °C dans une chambre froide sur un agitateur orbital à 140 tr/min pendant la nuit.
4. Déshydratation d’échantillons de tissu osseux
   1. Récupérez l’échantillon de tissu osseux du contenant.
   2. Inspectez le tissu et vérifiez l’efficacité de la décalcification en tournant et en tordant doucement l’os. Vous pouvez également effectuer une radiographie de l’os à l’aide d’un appareil à rayons X.
      REMARQUE : Si l’échantillon fléchit facilement, un bon degré de décalcification a été atteint. Si ce n’est pas le cas, les paramètres de détartrage (temps, vitesse d’agitation, volume de 20% EDTA pH 8,0. utilisé, etc.) doivent être augmentés.
   3. Lavez le tissu osseux 2 fois avec 1x PBS pendant 3 min pour éliminer les résidus d’EDTA.
   4. Placez le tissu osseux dans un nouveau récipient et commencez la déshydratation avec de l’éthanol à 70 %. Incuber pendant 15 min à 140 tr/min.
   5. Jetez la solution d’éthanol à 70 %, placez l’échantillon dans une solution d’éthanol à 90 % et incubez pendant 15 min à 140 tr/min.
   6. Jetez la solution d’éthanol à 90 %, mettez l’échantillon dans de l’éthanol à 100 % et incubez pendant 15 min à 140 tr/min.
   7. Jetez l’éthanol à 100 %, mettez l’échantillon dans un nouvel éthanol à 100 % et incubez pendant 15 min à 140 tr/min.
   8. Jetez l’éthanol à 100 %, mettez l’échantillon dans un nouvel éthanol à 100 % et incubez pendant 15 min à 140 tr/min.
   9. Jetez l’éthanol à 100 %, mettez l’échantillon dans un nouvel éthanol à 100 % et incubez pendant 30 min à 140 tr/min.
   10. Jetez l’éthanol à 100 %, mettez l’échantillon dans un nouvel éthanol à 100 % et incubez pendant 45 min à 140 tr/min.
       REMARQUE : La déshydratation peut également être effectuée à l’aide d’un processeur automatique. Dans ce cas, configurez le programme avec les mêmes conditions que celles signalées pour la déshydratation manuelle. Les conditions rapportées concernent des échantillons d’une épaisseur maximale de 4 mm (c.-à-d. des échantillons de tissu osseux provenant de souris). Pour les échantillons de plus de 4 mm d’épaisseur, le moment de la déshydratation doit être déterminé expérimentalement.
5. Clarification d’échantillons de tissu osseux
   1. Placez l’échantillon de tissu osseux dans un nouveau récipient et lancez le processus de nettoyage à l’aide de xylène. Incuber pendant 20 min à 140 tr/min.
   2. Jetez le xylène usagé, ajoutez du nouveau xylène et incubez pendant 20 minutes supplémentaires à 140 tr/min.
   3. Jetez le xylène utilisé, ajoutez du nouveau xylène et incubez pendant 45 min à 140 tr/min.
      REMARQUE : Le nettoyage peut également être effectué à l’aide d’un processeur automatique. Dans ce cas, configurez le programme avec les mêmes conditions que celles signalées pour le nettoyage manuel. Les conditions rapportées concernent des échantillons d’une épaisseur maximale de 4 mm (c.-à-d. des échantillons de tissu osseux provenant de souris). Pour les éprouvettes de plus de 4 mm d’épaisseur, le moment doit être déterminé expérimentalement.
6. Infiltration et enrobage d’échantillons de tissu osseux
   1. Récupérez l’échantillon de tissu osseux à partir de l’agitateur orbital/processeur automatique après l’élimination.
   2. Placez l’échantillon de tissu osseux dans une cassette d’enrobage et amorcez l’infiltration avec de la cire (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à 60 °C.
   3. Jetez la cire utilisée, ajoutez une nouvelle cire et incubez pendant 30 min à 60 °C.
   4. Jetez la cire usagée, ajoutez une nouvelle cire et incubez pendant 45 min à 60 °C.
   5. Placez soigneusement l’échantillon de tissu osseux dans un moule avec l’orientation souhaitée.
   6. Laissez le bloc d’échantillon se solidifier sur une surface froide.
   7. Conservez le FFPE obtenu à 4 °C jusqu’au moment de commencer le sectionnement.
      REMARQUE : Le bloc FFPE peut être stocké pendant de nombreuses années avant d’être effectué pour le sectionnement.

2. Lignes directrices pour la coupe d’échantillons FFPE non déminéralisés

REMARQUE : Les directives suivantes fournissent des conseils et des instructions précieux utiles pour améliorer considérablement la qualité des coupes de tissus tout en évitant la dégradation de l’ARN, en particulier dans le cas de petits échantillons d’os non décalcifiés. Ces lignes directrices peuvent également être appliquées aux échantillons d’os décalcifiés lorsqu’ils sont disponibles. Pour les échantillons de tissu osseux plus volumineux, une déminéralisation doit être effectuée pour obtenir des coupes de meilleure qualité ; Dans ce cas, la méthode décrite ci-dessus doit être suivie et les paramètres (temps, volumes de solutions, etc.) doivent être ajustés en conséquence. Les lignes directrices suivantes conviennent soit lorsque les tissus osseux FFPE ont déjà été traités (par exemple, bloc FFPE collecté dans des banques de tissus ou d’autres laboratoires), soit lorsque les sections collectées seront utilisées pour effectuer tout type d’analyse nécessitant un ARN de bonne qualité, des coupes de tissus de haute qualité, ou les deux.

1. Préparation de l’équipement
   1. Vaporisez toutes les surfaces de travail et tous les instruments avec des solutions décontaminantes pour éliminer les RNases.
   2. Préparez un bain-marie avec de l’eau distillée deux fois et réglez la température à 42 °C.
   3. Prenez une lame de microtome, vaporisez-la avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer les résidus d’huile, puis vaporisez-la avec des solutions décontaminantes pour éliminer les RNases.
   4. Fixez la lame sur le microtome. Assurez-vous que l’angle de dégagement est réglé sur 10°.
      REMARQUE : Utilisez toujours des lames neuves pour sectionner.
   5. Préparez deux seaux de glace.
   6. Prenez des pinces à épiler, des brosses et des sondes, vaporisez-les de solutions décontaminantes pour éliminer les RNases, et placez-les dans l’un des deux seaux à glace.
   7. Préparez un bain de glace en ajoutant de l’eau distillée deux fois dans l’autre seau à glace.
      REMARQUE : le bloc FFPE ne doit pas flotter dans l’eau ajoutée ; Par conséquent, la quantité d’eau ajoutée dans le seau à glace doit être juste suffisante pour permettre à l’échantillon d’être mouillé sans flotter.
2. Sectionnement
   1. Récupérez le bloc FFPE de son stockage à 4 °C et placez-le sur le microtome. Réglez la commande sur Trim ou sur 14 μm d’épaisseur de spirale, et commencez à couper l’échantillon jusqu’à ce que le tissu soit exposé.
      REMARQUE : Si le bloc FFPE a déjà été coupé et que le tissu est déjà exposé, sautez l’étape 2.2.1. Vérifiez que le bloc est sans trous ni fissures. Si c’est le cas, passez directement à l’étape 2.2.2. Sinon, coupez quelques sections pour aplatir la surface et éviter les trous et les fissures, puis passez à l’étape 2.2.2.
   2. Placez le bloc FFPE sur le bain de glace pour hydrater l’échantillon. Le temps d’hydratation doit être déterminé expérimentalement.
      1. Commencez par 2 min et augmentez le temps si l’hydratation ne suffit pas. Ne pas dépasser 10 min. L’hydratation dilatera les tissus et réduira la formation de « stores vénitiens » et de lignes. Des temps d’hydratation plus longs pourraient provoquer des fissures dans le bloc de paraffine et, éventuellement, un décollement des tissus.
      2. Si 10 minutes sont insuffisantes pour hydrater l’échantillon, effectuez des cycles d’hydratation ne dépassant pas 10 minutes et essayez à nouveau de sectionner.
      3. Si la surface du bloc n’est pas lisse et propre en raison de fissures ou de coupures, envisagez de réintégrer l’échantillon. La qualité de l’ARN ne sera pas affectée par le processus de réencastrement.
   3. Placez l’échantillon dans la pince à échantillon du microtome, alignez-le avec la lame et commencez à sectionner. Réglez l’épaisseur de la spirale sur 5 μm.
   4. Prélevez la section et placez-la dans le bain-marie à 42 °C à l’aide d’une pince à épiler et d’une brosse froide.
      REMARQUE : Alternativement, si l’isolement de l’ARN de sections de tissu doit être effectué, prélevez les sections dans un tube à centrifuger et suivez les spécifications de fabrication pour la préparation de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
   5. Incuber la section dans le bain-marie pour étirer les tissus et éliminer les rides et plis résiduels.
      REMARQUE : Le temps de flottaison dans le bain-marie pour chaque section doit être déterminé expérimentalement. Envisagez de laisser les sections osseuses une minute de plus si des problèmes de décollement de tissus se produisent. Ne laissez pas la section flotter trop longtemps car de longs temps de flottaison pourraient endommager les tissus.
   6. Placez la section sur une lame de verre, puis incubez-la pendant 3 h à 42 °C.
   7. Placez la lame de verre dans un dessiccateur ou un four pendant la nuit à RT pour un séchage correct.
   8. Rangez la diapositive en verre avec la section attachée à RT dans une boîte à diapositives.
      REMARQUE : Les diapositives peuvent être stockées pendant de nombreuses années chez RT. Si la transcriptomique spatiale doit être effectuée, au lieu d’une lame de verre, placez la section sur la lame d’expression génique spatiale fournie par le fabricant et suivez les recommandations rapportées (voir le tableau des matériaux).

Résultats

La méthode présentée ici décrit comment traiter des os fraîchement isolés pour obtenir des échantillons FFPE déminéralisés qui peuvent être facilement sectionnés avec un microtome tout en préservant l’intégrité de l’ARN (Figure 1). La méthode a été utilisée avec succès sur des fémurs murins, mais elle peut être suivie pour d’autres échantillons de tissu osseux de dimensions similaires, ou elle peut être adaptée à des échantillons osseux plus grands (par exemp...

Discussion

Ici, une méthode détaillée est fournie pour préparer des blocs FFPE d’os décalcifiés et préserver l’intégrité de l’ARN pour le séquençage (c’est-à-dire le séquençage de nouvelle génération (NGS)) ou pour d’autres techniques liées à l’ARN (c’est-à-dire l’hybridation in situ , la réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative (qRT-PCR), etc.).

La méthode utilise l’EDTA pour décalcifier les échantillons de tissu osseux ;...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.