Methoden zur Ermöglichung der räumlichen Transkriptomik von Knochengewebe

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode, die die Entkalkung von frisch gewonnenem Knochengewebe und den Erhalt hochwertiger RNA ermöglicht. Es wird auch ein Verfahren zum Schneiden von FFPE-Proben (Formalin Fixed Paraffin Embedded) von nicht demineralisierten Knochen vorgestellt, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erhalten, wenn frisches Gewebe nicht verfügbar ist oder nicht entnommen werden kann.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Beziehung zwischen den Zellen und ihrer Position in jedem Gewebe ist entscheidend, um die biologischen Prozesse aufzudecken, die mit der normalen Entwicklung und der Krankheitspathologie verbunden sind. Die räumliche Transkriptomik ist eine leistungsfähige Methode, die es ermöglicht, das gesamte Transkriptom innerhalb von Gewebeproben zu analysieren und so Informationen über die zelluläre Genexpression und den histologischen Kontext, in dem sich die Zellen befinden, zu liefern. Während diese Methode in großem Umfang für viele Weichgewebe eingesetzt wurde, war ihre Anwendung für die Analyse von Hartgeweben wie Knochen eine Herausforderung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass es nicht möglich ist, bei der Verarbeitung der Hartgewebeproben für die Sektion eine qualitativ hochwertige RNA und Gewebemorphologie zu erhalten. Daher wird hier ein Verfahren beschrieben, um frisch gewonnene Knochengewebeproben zu verarbeiten, um effektiv räumliche Transkriptomik-Daten zu generieren. Die Methode ermöglicht die Entkalkung der Proben, wodurch erfolgreiche Gewebeschnitte mit erhaltenen morphologischen Details möglich sind und gleichzeitig ein RNA-Abbau vermieden wird. Darüber hinaus werden detaillierte Richtlinien für Proben bereitgestellt, die zuvor in Paraffin eingebettet waren, ohne Demineralisierung, wie z. B. Proben, die aus Gewebebanken entnommen wurden. Unter Verwendung dieser Leitlinien werden qualitativ hochwertige räumliche Transkriptomik-Daten gezeigt, die aus Gewebebankproben von Primärtumor- und Lungenmetastasen von Knochenosteosarkomen generiert wurden.

Einleitung

Knochen ist ein spezialisiertes Bindegewebe, das hauptsächlich aus Fasern des Kollagens Typ 1 und anorganischen Salzen¹ besteht. Dadurch ist der Knochen unglaublich stark und steif und gleichzeitig leicht und traumaresistent. Die große Festigkeit des Knochens beruht auf seinem mineralischen Gehalt. Tatsächlich erhöht sich die Steifigkeit bei jeder Erhöhung des prozentualen Anteils an Mineralien um das Fünffache². Folglich stehen Forscher vor erheblichen Problemen, wenn sie mittels histologischer Schnitte die Biologie einer Knochenprobe analysieren.

Eine nicht entkalkte Knochenhistologie ist ma....

Protokoll

Alle unten beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der University of Pittsburgh School of Dental Medicine zugelassen.

1. Verfahren zur Herstellung von FFPE-Blöcken aus Knochengewebeproben, die demineralisiert werden müssen

1. Aufbereitung von Reagenzien und Materialien
   1. Bereiten Sie EDTA 20% pH 8,0 vor. Für 1 l lösen Sie 200 g EDTA in 800 mL Reinstwasser, stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid 10 N auf 8,0 ein und bringen Sie schließlich das Volumen mit Reinstwasser auf 1 l. Bei Raumtemperatur lagern.
      HINWEIS: Verwenden Sie ....

Diskussion

Hier wird eine detaillierte Methode zur Präparation von FFPE-Blöcken entkalkter Knochen und zur Erhaltung der RNA-Integrität für die Sequenzierung (d. h. Next-Generation-Sequencing (NGS)) oder für andere RNA-bezogene Techniken (z. B. In-situ-Hybridisierung , quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) usw.) bereitgestellt.

Bei der Methode wird EDTA verwendet, um Knochengewebeproben zu entkalken. Die EDTA-Inkubation ermöglicht eine langsame, aber feine .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.