ניטור פעילות חוזרת עשירה בלאוצין המכילה 8 ערוצים (LRRC8/VRAC) באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster עם פליטה רגישה (SE-FRET)

Summary

אלקטרופיזיולוגיה היא תקן הזהב לחקר פעילות תעלות היונים. עם זאת, ישנן גישות חלופיות רבות, כולל שיטות אופטיות. במאמר זה אנו מתארים שיטה לניטור הפעילות של תעלות אניון עשירות בלאוצין המכילות 8 ערוצי אניון (LRRC8) באמצעות שיטה מבוססת העברת אנרגיית תהודה בין תת-יחידות Förster (FRET).

Abstract

חברי משפחת החלבונים LRRC8 יוצרים תעלות יון ואוסמוליטים הטרומריות בעלות תפקידים בתהליכים פיזיולוגיים רבים. כתעלות אניון מווסתות נפח (VRACs) / תעלות תיקון חיצוניות רגישות לנפח (VSORs), הן מופעלות על התנפחות תאים אוסמוטית ומתווכות את האקסטרוזיה של כלוריד ואוסמוליטים אורגניים, מה שמוביל לזרם המים ומכאן להתכווצות התא. מעבר לתפקידם בוויסות נפח אוסמוטי, VRACs היו מעורבים בתהליכים תאיים כגון התמיינות, הגירה ואפופטוזיס. באמצעות השפעתן על פוטנציאל הממברנה והעברתן של מולקולות איתות שונות, תעלות חוזרות עשירות בלאוצין המכילות 8 (LRRC8) ממלאות תפקידים בתקשורת נוירון-גליה, הפרשת אינסולין ותגובה חיסונית. מנגנון ההפעלה נותר חמקמק. תעלות LRRC8, כמו תעלות יונים אחרות, נחקרות בדרך כלל בשיטות אלקטרופיזיולוגיות. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי שפעול ערוץ LRRC8 על ידי מדידת העברת אנרגיית תהודה של Förster (SE-FRET) בין חלבונים פלואורסצנטיים המאוחים לתחומים חוזרים עשירים בלאוצין במסוף C של תת-יחידות LRRC8. שיטה זו מציעה את האפשרות לחקור הפעלת ערוץ באתרו ללא חילופי הסביבה הציטוסולית ובמהלך תהליכים כגון התמיינות תאים ואפופטוזיס.

Introduction

תעלות יונים המורכבות מהטרומרים של חלבונים חוזרים עשירים בלאוצין המכילים 8 (LRRC8) חלבונים ממשפחת בעלי החוליות נמצאות בכל תאי חולייתנים, ומשתתפות במגוון רחב של תפקודים פיזיולוגיים ^1,2. ערוצי LRRC8 אלה, שזוהו לראשונה כערוצי אניון מווסתים עוצמת קול (VRACs) או ערוצי תיקון חיצוניים רגישים לעוצמת הקול (VSOR), ממלאים תפקיד מכריע בהפחתת נפח הבקרה התאית ^3,4. הם מאפשרים גירוש של יוני כלוריד ואוסמוליטים אורגניים, אשר ואחריו זרם מים בתגובה לנפיחות אוסמוטית. מעבר לתפקידם בתגובת עקה אוסמוטית, תפקידם בוויסות נפח התא נקשר להתרבות ונדידת תאים, אפופטוזיס, ספרמיוגנזה ושלמות אפיתל ^5,6,7. שינוי פוטנציאל הממברנה בעת הפעלת LRRC8/VRAC הוכח כתורם להתמיינות מיוצינור⁸ ולהפרשת אינסולין על ידי תאי β הלבלב ^9,10,11. יתר על כן, תעלות LRRC8 מוליכות מגוון אוסמוליטים אורגניים כגון מולקולות איתות פורינרגיות ATP ו-cGAMP או חומצת האמינו המעוררת גלוטמט, וממקמות תעלות אלה בתקשורת תא-תא במערכת החיסון או באינטראקציה גליה-נוירון 12,13,14,15,16,17,18,19,20,^21,22. אפילו קסנוביוטים, כגון הצבע פלואורסצאין, האנטיביוטיקה בלסטיצידין S או התרופה האנטי-סרטנית ציספלטין, מבוצעים על ידי תעלות LRRC8 23,24,25.

ישנם דיווחים רבים על העברת האות המוביל להפעלת LRRC8/VRAC 26,27,28. עם זאת, המנגנון עדיין אינו ברור, והספרות מציגה מגוון רחב של מנגנונים אפשריים שעשויים להיות תלויים בתהליך הפיזיולוגי הספציפי. אלה כוללים שינויים בחוזק היונים הציטוסוליים, אינטראקציה עם השלד הציטוסולי, הרכב הממברנה, חלבוני G, מצב החיזור ומפל הזרחן 2,27,29,30,31.

ערוצי LRRC8/VRAC מכילים את LRRC8A כתת-יחידה חיונית ^3,4 שחייבת להתמזג עם לפחות אחד מהפרלוגים שלה, LRRC8B-E, כדי ליצור ערוצים פונקציונליים פיזיולוגית ^4,14,32. הרכב תת-היחידות קובע תכונות ביופיזיקליות של התעלה, כגון אי-הפעלה תלוית תיקון ודפולריזציה 4,29,32,33,34, ספציפיות המצע 15,17,20,21,24,35, וכמה מסלולי הפעלה^36,37. מבני מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryo-EM) מראים כי הומומרים LRRC8A, כמו גם הטרומרים, מתאספים כהקסמרים^38,39,40, בעוד שכימרות LRRC8A/LRRC8C היוצרות תעלות פונקציונליות הן הפטמרים⁴¹. החלק N-terminal של כל חלבוני LRRC8 מורכב מארבעה סלילים טרנסממברנליים, והחלק C-terminal מכיל תחום עם חזרות עשירות בלאוצין (LRRD). המבנים המורכבים הזמינים של LRRC8 מספקים ראיות לכך שה-LRRDs, המשתרעים לתוך הציטוזול ^3,4,23, עשויים לעבור סידורים מחדש קונפורמטיביים במהלך תעלות 34,42,43. רעיון זה מאושש על ידי הממצא כי היתוך C-terminal של חלבונים פלואורסצנטיים גורם לפעילות תעלת הבסיס¹⁴ וכי קשירה של ננו-גופים לתחומים יכולה לווסת את פעילות הערוץ⁴⁴. יתר על כן, שינויים קונפורמטיביים של C-termini הודגמו על ידי העברת אנרגיית תהודה תוך מורכבת של Förster (FRET)⁴⁵.

השיטה הנפוצה ביותר לחקר פעילות תעלות היונים היא מדידות אלקטרופיזיולוגיות⁴⁶, אשר יושמו בהרחבה בחקר VRACs לפני זיהויים המולקולרי⁴⁷. עם זאת, ישנן דרכים שונות נוספות לנטר את פעילות VRAC באופן עקיף, כולל מדידת המצע המוליך שלו - יוני הליד או אוסמוליטים אורגניים - או השפעתו על נפח התא⁴⁸. למעשה, הזיהוי של חלבוני LRRC8 כ-VRAC הסתמך על בדיקה המבוססת על מרווה של חלבון פלואורסצנטי רגיש להליד⁴⁹ על ידי כניסת יודיד לתא דרך VRACs^{מופעלים 3,4}. שיטה נוספת לניטור פעילות ערוץ LRRC8/VRAC עושה שימוש בתנועה של התחומים הציטוסוליים שניתן לראות, כמו בתעלות יונים אחרות 50,51,52,53, על ידי שינויים ב-FRET ⁴⁵. לשם כך, חלבונים פלואורסצנטיים המשמשים כזוגות FET, כגון חלבון ציאן-פלואורסצנטי (CFP)/mCerulean3 כתורם וחלבון צהוב-פלואורסצנטי (YFP)/mVenus כמקבל, אוחדו ל-C-termini של חלבוני LRRC8 (איור 1). FRET תוך-מורכב בין תת-יחידות LRRC8 הוכח בניסויי פוטו-הלבנה⁴⁵. הימנעות משיטת ההלבנה ההרסנית, שינויי FRET לאורך זמן נוטרו על ידי FRET (SE-FRET), כאשר בעצם נמדדת הפליטה הרגישה של המקבל בעת עירור התורם עקב חפיפה של ספקטרום הפליטה של התורם עם ספקטרום העירור של המקבל. יישום היפוטוניות חוץ-תאית, גירוי להפעלת LRRC8/VRAC, הביא לירידה הפיכה בעוצמת SE-FRET⁴⁵. חשוב לציין, מדידות סימולטניות של מהדק טלאי על תאים שלמים וניטור FRET במהלך טיפול היפוטוני הראו כי ירידה זו ב- FRET אכן שיקפה את הפעלת LRRC8/VRAC⁴⁵. שיטה זו, המונעת שיבוש קרום הפלזמה או שינוי הסביבה התוך-תאית על ידי תמיסת פיפטה, מציעה חלופה לניטור פעילות LRRC8/VRAC. הוא שימושי במיוחד בסביבות פיזיולוגיות שבהן שמירה על הציטוזול המקומי היא חיונית, יש צורך ברזולוציה תת-תאית, או נדרשת תצפית ממושכת על פעילות הערוץ.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר LRRC8/VRAC עם קריאה מבוססת FRET. הפרוטוקול מתאר כיצד לטפל ולהדביק תאים, לרכוש תמונות דגימה ובקרה, לנתח את הנתונים ולחשב ערכי FRET (SE-FRET) של פליטה רגישה.

איור 1: סכמה של מערכת הזוג LRRC8 FET. mCerulean3 מוצג בציאן, ו-mVenus מוצג בצהוב. לאחר פתיחת VRAC, המרחק (ו / או הכיוון המרחבי) בין הפלואורופורים משתנה, וכתוצאה מכך העברת אנרגיה מופחתת בין תורם (דון) ומקבל (Acc), ובתורו, מורידה את FRET שנצפה. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. הכנת חיץ וריאגנטים

1. הכינו מאגרים בינוניים ואיזוטוניים, היפוטוניים והיפרטוניים ומדדו את האוסמולריות של המאגרים בעזרת אוסמומטר כדי להבטיח שהאוסמולריות (Osm) נמצאת בטווח הצפוי עם סטייה מקובלת בלבד.
   1. מדיה לתרביות תאים: הכינו את מדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין
   2. מאגר הדמיה איזוטוני (~ 340 mOsm): הכן את מאגר ההדמיה האיזוטוני על ידי ערבוב 150 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.5 mM CaCl₂, 10 mM D(+)-גלוקוז ו- 10 mM 4-(2-Hydroxy Ethyl)-1-Piperazine Ethane Sulfonic acid (HEPES).
   3. מאגר הדמיה היפוטוני (~ 250 mOsm): הכן את מאגר ההדמיה ההיפוטוני על ידי ערבוב 105 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.5 mM CaCl₂, 10 mM D(+)-גלוקוז ו- 10 mM HEPES.
   4. מאגר הדמיה היפרטוני (~ 500 mOsm): הכן את מאגר ההדמיה ההיפרטונית על ידי ערבוב 160 mM D(-)-Mannitol, 150 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.5 mM CaCl₂, 10 mM D(+)-גלוקוז ו- 10 mM HEPES.
      הערה: ניתן להוסיף למאגרים תרופות ספציפיות בהתאם למה שייחקר.

2. צמיחה של תאים דבקים על צלחות תחתית זכוכית

1. הכינו לפחות מנה אחת להעברה רק עם חלבון העניין (POI) המאוחה לתורם או לפלואורופור המקבל ולפחות מנה אחת להעברה עם זוג התורם והמקבל (טבלה 1 ואיור 2). השתמשו בכלים עם תחתית זכוכית כדי לאפשר מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בהתאם לסוג התא, לטפל פני השטח על ידי ניקוי מיוחד או ציפוי אותו עם פוליליזין.
   הערה: כאן, תורם FRET mCerulean3 (mCer)⁵⁴ ומקבל FRET mVenus (mVen)⁵⁵ משמשים כזוג FET, אך שילובים אחרים של פלואורופורים ישימים גם כן. דגימות המבטאות את נקודת העניין המאוחה לתורם או למקבל בלבד משמשות לקביעת גורמי התיקון β ו-γ (טבלה 1) הדרושים לתיקון דימום של תורם בערוץ המקבל ועירור צולב של המקבל על ידי אורך גל העירור של התורם (איור 2Ac, Bf).
2. יום לפני ההדבקה, זרע 1 x 10⁵ תאי HeLa ב 2 מ"ל של מדיה תרבית תאים על צלחות 35 מ"מ עם תחתית זכוכית המתאימה למיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאי תרבית לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ באטמוספירה באינקובטור של תרביות תאים.
   הערה: ניתן להתאים נפחים של ריאגנטים לשטח הפנים של צלחות/בקבוקים אחרים של תרביות תאים בגודל שונה. ניתן להתאים את מספר התא לצפיפות המתאימה לקווי תאים שונים ולגישות ניסיוניות.
   1. שאפו את תרבית התא משכבה חד-שכבתית של תאים דבקים שגודלו בתרבית על צלוחיות תרבית תאי T75 באמצעות משאבת ואקום.
   2. שטפו את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS) לבקבוק תרבית התאים ושאיפה של התמיסה לאחר מכן עם משאבת ואקום.
   3. כסו את התאים לחלוטין ב-1 מ"ל של 0,05% טריפסין-EDTA ודגרו על התאים במשך 2 דקות ב-37°C ו-5%_CO2 אטמוספירה באינקובטור תרביות תאים.
   4. הוסף 9 מ"ל של מדיה תרבית תאים להשעות את התאים על ידי pipetting.
   5. העבר את מתלה התא לתוך צינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   6. שאפו את הסופרנאטנט עם משאבת ואקום והשהו מחדש את גלולת התא ב -10 מ"ל של מדיה של תרבית תאים.
   7. ערבבו נפחים שווים של תרחיף תאים ו-0.4% טריפאן כחול בצינור והוסיפו 10 μL לשקופית ספירה. מקם את השקופית במונה התאים האוטומטי והתחל לספור באמצעות התוכנית המתאימה לספירת תאים.
   8. כדי לחשב את נפח תרחיף התאים הדרוש לכל מנה, חלק את מספר התא הדרוש לכל צלחת (1 x 10⁵) במספר התא למיליליטר המתקבל ממונה התא.
   9. הכינו תרחיף תאים בצינור מתאים המכיל את מספר התאים הדרוש לכל צלחת בנפח הדרוש לכל מנה (2 מ"ל) בתוספת כמות למנה אחת.
   10. מערבבים את תרחיף התא לפחות 20 פעמים על ידי היפוך הצינור והפיפטה 2 מ"ל של תרחיף התא בכל צלחת.
   11. כדי להבטיח פיזור תאים אחיד יותר, השאירו את הכלים למשך 30 דקות ב- RT לפני הצבתם באינקובטור תרביות התא.

3. טרנספקציה של תאים

הערה: כאן, FuGENE שימש כמגיב טרנספקציה. ריאגנטים ושיטות טרנספקציה אחרות ישימות גם כן. יש להעריך אמפירית את היחסים האופטימליים בין דנ"א פלסמיד (pDNA) לריאגנטים טרנספקציוניים וזמן לביטוי אופטימלי עבור כל נקודת עניין ומודל תא. כאן, 2 מיקרוגרם של pDNA הכולל לכל צלחת 35 מ"מ שימש. מבנים של תורם FRET ומקבל שימשו ביחס של 1:1, ויחס מגיב pDNA לטרנספקציה היה 1:4 (טבלה 1).

1. לפני הטרנספקציה, להחליף את supernatant תרבית התא עם טרי 2 מ"ל של מדיה שחוממה מראש.
2. לדלל pDNA בתווך אופטי-מינימלי חיוני (MEM) עם נפח סופי של 100 μL (=תמיסת pDNA).
3. לדלל את מגיב הטרנספקציה ב- Opti-MEM עם נפח סופי של 100 μL (=תמיסת מגיב).
   הערה: לקבלת טרנספקציה אחידה יותר, הכינו תערובת אב לתמיסת pDNA ומגיב.
4. מערבבים היטב pDNA ותמיסת מגיב.
5. הוסף את תמיסת ה- pDNA לתמיסת המגיב (=תמיסת טרנספקציה).
6. מערבבים היטב את תמיסת הטרנספקציה.
7. לדגור על תמיסת הטרנספקציה למשך 15 דקות ב- RT.
8. מוסיפים את תמיסת הטרנספקציה בתנועה ספירלית לצלחת.
9. מערבבים על ידי הזזת המנה 5 פעמים אופקית ואנכית על פני הספסל.
10. תאי תרבית לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ באטמוספירה באינקובטור של תרביות תאים.

  

תנאי	מבנה (ים)	לדוגמה	משמש עבור
1	LRRC8A-mCerulean	מבנה התורם בלבד	קביעת גורם תיקון β
2	LRRC8E-mVenus	קונסטרוקציית קבלה בלבד	קביעת גורם תיקון γ
3	LRRC8A-mCerulean ו-LRRC8E-mVenus	זוג FRET	כימות SE-FRET

טבלה 1: דוגמה לתנאים הדרושים לניסוי SE-FRET טיפוסי למדידת פעילות LRRC8/VRAC של תעלה המורכבת מתת-יחידה LRRC8A המאוחה לתורם (mCerulean3) ותת-יחידה LRRC8E המאוחה לפלואורופור המקבל (mVenus).

4. רכישת תמונה לקביעת גורם תיקון

הערה: יש דימום של פליטת התורם לתוך הפליטה שזוהתה של המקבל במהלך FRET. יתר על כן, יש עירור צולב של פלואורופור המקבל על ידי אורך גל עירור התורם. תהליכים אלה חייבים להיות פיצוי במהלך החישוב של SE-FRET. לשם כך, גורמי תיקון נקבעים בתאים המבטאים רק את תורם FRET או מקבל 24 שעות לאחר הטרנספקציה. כאן, ההדמיה בוצעה על גבי Leica THUNDER Imager המצויד במנורת Leica LED8, CYR71010 קוביית המסנן, HC PL APO 63x/1.40 OIL objective, מסנן מעבר ארוך עבור 460/80 ו- 553/70 ומצלמת DFC9000GTC של Leica. הניסויים בוצעו ללא בקרה סביבתית אלא בנוכחות HEPES במאגרי ההדמיה כדי לייצב את ה- pH. לתצפית/מדידות ארוכות טווח, מומלץ להשתמש במערכת בקרה סביבתית. לצורך ניתוח, SE-FRET מחושב מהתמונות הגולמיות שצולמו. זה יכול להיעשות בו זמנית במהלך הרכישה או לאחר מכן. כאן, תוכנת Leica LAS X עם תוסף SE-FRET שימשה כדי לפשט את ההליך הניסיוני לגבי חישוב גורמי התיקון והדמיית שינויי הערך SE-FRET בזמן אמת במהלך רכישת תמונה. עבור לאחר הרכישה, ניתן לקבוע גורמי תיקון ו- SE-FRET עם חבילות תוכנה אחרות (למשל, FIJI) לאחר רכישת נתונים גולמיים בהתאם לפרוטוקול המסופק להלן.

1. לפני רכישת תמונה של תאים בודדים שעברו טרנספקציה כדי לחשב את גורמי התיקון, השתמש בדגימה אחת המבטאת את זוג FRET כדי להגדיר את הגדרת המיקרוסקופ עבור כל הערוצים (עירור תורם/פליטת תורם DD, DA תורם/מקבל ומקבל AA; ראו טבלה 1 ואיור 2C ואיור 3A).
   הערה: עבור מדידות SE-FRET עם תת-יחידות VRAC המתויגות mCerulean3 ו-mVenus כמתואר לעיל, נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: שילוב של 8x8 פיקסלים, זמן חשיפה של 100ms ועוצמת מנורת LED של 10%.
2. קחו את הדגימה המבטאת את מבנה התורם בלבד (איור 2A), שאפו את מדיית תרבית התא, ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של חיץ איזוטוני.
3. מוסיפים 3 מ"ל של חיץ איזוטוני ומניחים את הדגימה על במת המיקרוסקופ.
4. מצא שדה ראייה (FOV) עם תא אחד לפחות המבטא את מבנה התורם.
5. דמיינו את כל הערוצים (DD, DA ו-AA ראו טבלה 2 ואיור 2A).
6. צייר אזור עניין (ROI) סביב התא/תאים ומדוד את העוצמה הממוצעת של DA (= I_DA; איור 2Ac) ו-DD (= I_DD; איור 2Aa).
7. לחיסור רקע, צייר החזר השקעה בערוצי DA ו- DD שבהם נמצא רק אות הרקע ומדוד את העוצמה הממוצעת (I_BDA ו- I_BDD).
8. הפחתת העוצמה הממוצעת של החזר ההשקעה ברקע מהעוצמה הממוצעת הנמדדת בהחזר ההשקעה של התא של הערוץ המתאים ( ו - ).
9. חזור על שלבים 4.2-4.5 כאשר המדגם מבטא רק את מבנה המקבל (איור 2B).
10. צייר החזר השקעה סביב התא(ים) ומדוד את העוצמה הממוצעת של DA (= I_DA; איור 2Bf) ו-AA (= I_AA; איור 2Be).
11. לחיסור רקע, צייר החזר השקעה בערוצי DA ו- AA שבהם נמצא רק אות הרקע ומדוד את העוצמות הממוצעות (I_BDA ו- I_BAA).
12. הפחתת העוצמה הממוצעת של החזר ההשקעה ברקע מהעוצמה הממוצעת הנמדדת בהחזר ההשקעה של התא של הערוץ המתאים ( ו - ).
13. השתמש בערכים שנקבעו עבור I_DA*, I_DD* ו- I_AA* כדי לחשב את גורמי התיקון ו - ,
    כאשר גורם התיקון β משמש כדי לפצות על הדימום של פליטת התורם לתוך ערוץ DA. גורם התיקון γ משמש כדי לפצות על עירור צולב של פלואורופור המקבל על ידי אורך גל עירור התורם בערוץ DA.

עירור של	פליטה של	שם ערוץ	קו LED	קוביית סינון	מסנן מעבר ארוך
תורם	תורם	DD	440 נאנומטר	CYR71010	460/80 ניוטון מטר
תורם	מקבל	דא	440 נאנומטר	CYR71010	535/70 ניוטון מטר
מקבל	מקבל	א.א.	510 ניוטון מטר	CYR71010	535/70 ניוטון מטר

טבלה 2: סיכום הערוצים הדרושים לניסויי SE-FRET.

איור 2: תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של דגימות המשמשות לחישוב גורמי התיקון β ו-γ הדרושים כדי לקבוע את פעילות VRAC של תעלה המורכבת מתת-יחידה LRRC8A המאוחה לתת-יחידה mCerulean3 (mCer) של התורם המאוחה לפלואורופור mVenus (mVen) המקבל באמצעות מדידות SE-FRET. (א,ב) איתור DD של התורם/תורם, AA מקבל/מקבל וערוץ DA של התורם/מקבל בתאי HeLa המבטאים רק את התורם (A) LRRC8A-mCer או את המקבל (B) LRRC8E-mVen. (C) זיהוי תעלות DD, AA ו-DA בתאי HeLa שהודבקו יחד עם זוג התורמים והמקבלים LRRC8A-mCer ו-LRRC8E-mVen. לוחות a-i מציגים תמונות שצולמו בערוץ איתור התורם (עירור התורם וזיהוי אות התורם; ד.ד.; a, d ו- g), ערוץ זיהוי המקבל (עירור המקבל וזיהוי אות המקבל; א.א.; b, e ו- h ) וערוץ זיהוי אות FRET (עירור התורם ואיתור האות המקבל; דא; ג, ו וט). לוח j הוא שכבת העל של הלוחות g ו- h. ערוץ DD מוצג בירוק וערוץ AA במגנטה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. הדמיה בהילוך מהיר לכימות SE-FRET

1. קחו את הדגימה המבטאת את מבנה התורם והמקבל (טבלה 1, איור 2C ואיור 3A), שאפו מדיה של תרבית תאים, ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של חיץ איזוטוני 24 שעות לאחר הטרנספקציה.
2. מוסיפים 3 מ"ל של חיץ איזוטוני ומניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ.
3. לשאיפה מאוחרת יותר של החיץ האיזוטוני, מקבעים ומתאימים צינורית צינורית כך שקצה הצינורית יגיע לתחתית המנה.
4. להוספת חוצצים, יש לקבע ולהתאים את הצינורות כך שהחיץ המונע על ידי זרימת כוח הכבידה יוכל לרדת לתוך המנה.
   הערה: כאן, נעשה שימוש במערכת זילוח כבידה מבוקרת שסתום עם ארבעה שסתומים מגנטיים כדי לשלוט בזרימת החיץ, אך שיטות אחרות ישימות גם כן.
5. מצא FOV עם לפחות תא אחד המבטא את מבנה התורם והמקבל בו זמנית.
6. הגדר ניסוי קיטועי זמן עבור הערוצים DD, DA ו- AA עם מרווח של 10 שניות ומשך זמן כדי לכסות את כל התנאים של רצף הגירוי, לדוגמה, 12 מחזורים של קו בסיס ואחריו 15 מחזורים לכל מצב (איור 3).
   הערה: ניתן לאמץ את המרווח ואת מספר המחזורים בהתאם לצרכי הניסוי, אך תמיד צריך לכלול מדידה בסיסית לנורמליזציה לתצוגה חזותית טובה יותר והשוואה של הנתונים.
7. לאחר מדידת קו הבסיס, שטפו את הדגימה במאגר עבור התנאי הראשון.
   1. שואפים את החיץ האיזוטוני דרך צינורית הצינור, תוך הפעלת ואקום עם מזרק.
   2. הוסף 3 מ"ל של החיץ של המצב הבא על ידי זרימת הכבידה.
   3. שאפו את המאגר והוסיפו שוב 3 מ"ל של אותו חיץ.
   4. חזור על שלב 5.7.3 פעם נוספת.
8. לאחר מדידת התנאי הראשון, שטפו את הדגימה במאגר עבור התנאי הבא (שלבים 5.7.1-5.7.4).
9. חזור על שלבים 5.5-5.8 עד שכל התנאים יילכדו.
10. לכימות SE-FRET, ציירו החזר השקעה סביב התא/תאים ומדדו את העוצמה הממוצעת בערוץ DD = (I_DD), DA (I_DA) ו-AA (I_AA) עבור כל התמונות (נקודות זמן) בסדרת הזמן (איור 3A, B).
11. לחיסור רקע עבור אות FRET, צייר החזר השקעה בערוץ DA שבו נמצא רק אות הרקע ומדוד את העוצמה הממוצעת (I_BDA).
12. הפחתת העוצמה הממוצעת של החזר ההשקעה ברקע מהעוצמה הממוצעת הנמדדת בהחזר ההשקעה על התא של ערוץ DA ().
13. השתמש בערכים שנקבעו כדי לחשב את ערכי SE-FRET הממוצעים עבור כל החזר השקעה וכל נקודות הזמן .
14. לקבלת יכולת השוואה טובה יותר של תנאים שונים ותצוגה חזותית של ערכי SE-FRET, השתמש בממוצע של ערכי הבסיס של כל החזר השקעה כדי לנרמל את כל נקודות הזמן של החזר ההשקעה המתאים.
15. התווה את ערכי SE-FRET המנורמלים לאורך זמן (איור 3B).

איור 3: תמונות פלואורסצנטיות מייצגות וכימות SE-FET. (A) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות ו-SE-FRET לכאורה של נקודת הזמן הראשונה של ניסוי הקפות זמן כדי למדוד את פעילות VRAC על ידי SE-FRET של תעלה המורכבת מתתי-יחידות LRRC8A ו-LRRC8E בהתאם לטוניות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אותם תאים מוצגים באיור 2C. לוחות a-i מציגים את הזיהוי של ערוצי DD, AA ו- DA ואת SE-FRET המחושב לכאורה. קווי מתאר לבנים מייצגים את החזר ההשקעה (תאים i-iii בלוח d) המשמשים למדידת עוצמות האות הממוצעות ב- DD, AA ו- DA ואת תמונת SE-FRET הנראית לעין. (B) כימות ערכי SE-FRET לאורך זמן. רצף התנאים היה 12 מחזורים של חיץ הדמיה איזוטוני (קו בסיס) ואחריו 15 מחזורים של חיץ הדמיה היפוטוני ו-15 מחזורים של חיץ הדמיה היפרטוני. ערך SE-FRET הממוצע הגולמי של כל החזר השקעה (תאים i-iii) ונקודת הזמן נורמל לממוצע של הערך הבסיסי (איזוטוני) עבור החזר ההשקעה המתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

בשיטה מבוססת FRET זו, ניתן לנטר את פעילות LRRC8/VRAC במהלך גירוי אוסמוטי, והירידה ב- SE-FRET מתואמת עם מידת ההיפוטוניות החוץ תאית⁴⁵. תוצאות מייצגות של הפעלת ערוצים הנגרמת על ידי היפוטוניות מוצגות גם כאן (איור 3 ואיור 4). בנוסף, ניתן לצפות בהפעלת LRRC8/VRAC על ידי גירויים איזוסמוטיים שונים, כגון מניפולציה של איתות דיאצילגליצרול⁴⁵ או במהלך הפעלת מיוציטים⁵⁶.

איור 4: עקבות SE-FRET. (A) עקבות SE-FRET לכאורה מ-5 ניסויים בלתי תלויים. הנתונים מייצגים ממוצע ± SD של N = 2 עד N = 7 תאים לכל שדה ראייה (FOV). (B) ממוצע ± SD של כל התאים (N = 31 תאים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מכיוון שתעלות LRRC8/VRAC מעורבות גם בהפחתת נפח אפופטוטי^24,57, צפייה בפעילות הערוץ עם השראת אפופטוזיס תהיה יישום נוסף לשיטה המתוארת כאן. בהתאם לכך, פרוטוקול ניטור SE-FRET בתאי HeLa המבטאים LRRC8A-mCerulean3 ו-LRRC8E-mVenus בוצע תוך יישום תרופות הגורמות לאפופטוזיס בתיווך קולטן מוות. גורם נמק הגידול (TNF)-α וציקלוהקסמיד (CHX) הוכחו בעבר כמעוררים זרמי VRAC תוך מספר דקות⁵⁸. לאחר תוספת של 2 ננוגרם/מ"ל TNF-α ו-1 מיקרוגרם/מ"ל CHX במאגר איזוטוני, חלה ירידה חזקה ב-SE-FRET (איור 5). החלפת החיץ בתווך היפרטוני, אף על פי שהכיל TNF-α ו-CHX, ערכי SE-FRET התאוששו קרוב לקו הבסיס (איור 5A), בהתאמה להפחתת זרמי VRAC בתמיסת אמבטיה היפרטונית במהלך הטיפול בליגנד Fas⁵⁸ הגורם לאפופטוזיס. הטיפול בתאים עם DMSO, הממס עבור TNF-α ו- CHX, לא הביא להפחתת SE-FRET. TNF-α + CHX לא השפיעו על SE-FRET של CFP-18aa-YFP, מבנה טנדם של EYFP ו-ECFP כבקרת FRET⁵⁹, מה שמדגים את הספציפיות של LRRC8/VRAC (איור 5B).

איור 5: הפעלת VRAC איזוסמוטית על-ידי אפופטוזיס בתיווך קולטן מוות. (A) ערכי SE-FRET מנורמלים מתאי HeLa המבטאים LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen (n = 8 מנות, 23 תאים) לאורך זמן. לאחר 15 מחזורים במאגר הדמיה איזוטוני (קו בסיס), פתרון האמבטיה הוחלף בחיץ איזוטוני בתוספת 2 ng/mL TNF-α ו-1 μg/mL cycloheximide (CHX) למשך 30 מחזורים ולאחר מכן 20 מחזורים חיץ הדמיה היפרטוני עם TNF-α ו-CHX. ערך SE-FRET הממוצע הגולמי של כל החזר השקעה ונקודת זמן נורמל לממוצע של הערך הבסיסי (איזוטוני) עבור החזר ההשקעה המתאים. (B) כימות ערכי SE-FRET מנורמלים של תאי HeLa המבטאים LRRC8A/E כמו ב-A עם תמיסה איזוטונית המכילה DMSO כבקרת רכב עבור CHX (n = 5 כלים, 12 תאים) או חיץ איזוטוני המכיל השראות אפופטוזיס כמו ב-A (n = 8 כלים, 23 תאים), או של תאי HeLa המבטאים CFP-18aa-YFP עם השראות אפופטוזיס (n = 3 כלים, 9 תאים). הנתונים מייצגים את הממוצע של 10 נקודות הזמן האחרונות במאגר המתאים של תאים בודדים (סמלים) ואת הממוצע של כל התאים ± SD; ** p < 0.01 ANOVA חד-כיווני רגיל ואחריו מבחן ההשוואה המרובים של Tukey לאחר הוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מיקרוסקופ FRET הוא טכניקה מבוססת ובשימוש נרחב לחקר האינטראקציה בין חלבונים. לפיכך, שיטות מבוססות FRET ניתן ליישם במעבדות רבות של מומחיות משתנה. סידורים קונפורמטיביים במהלך gating נוטרו עבור מגוון רחב של תעלות יונים באמצעות בדיקות מבוססות FRET (לדוגמה, ראה הפניות 34,50,51,52,53,60,61,62,63,64,65,66,67), במקרים מסוימים בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה בפלאורומטריה מהדק טלאי 68,69,70,71. ניתן להשתמש ב-FRET כדי לחקור את יחסי מבנה-פונקציה של תעלות יונים אלה או כדי לפקח על פעילותן ללא תלות בהעברת יונים. לשיטה המוצגת כאן יכולים להיות יתרונות ברורים על פני אלקטרופיזיולוגיה מכיוון שהיא מאפשרת ניטור הפעילות של תעלות LRRC8/VRAC באתרן.

שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים ציפוי התאים כדי להגיע למפגש אופטימלי עבור טרנספקציה והדמיה, אשר באופן אידיאלי מאפשר הבחנה קלה בין תאים לניתוח מאוחר יותר. העברה משותפת יעילה של תת-היחידות השונות חיונית ללוקליזציה תת-תאית נכונה; לדוגמה, עודף של תת-היחידה שאינה LRRC8A יוביל ללוקליזציה משופרת של הרשתית האנדופלסמית (ER)⁴. לכן, ייתכן שיהיה צורך להתאים את יחסי הפלסמיד. בהתאם למערכת, זוגות FRET חדשים שנוצרו צריכים להיות מאומתים, למשל, על ידי הלבנה מקבלת. יש לאזן את זמן החיבור וזמן החשיפה זה כנגד זה כדי לאפשר פתרון זמני ומרחבי אופטימלי לשאלת המחקר. בינינג מאפשר זמני חשיפה קצרים יותר ובכך מפחית את פוטנציאל ההלבנה של חיישן FRET תוך הפחתת הרזולוציה המרחבית. לכן, אם מערך הניסוי דורש, למשל, אפליה תת-תאית של פעילות LRRC8/VRAC, יש להימנע מקשירה. שאלת המחקר קובעת באופן שווה את מספר ומרווח המחזורים בסדרת קיטועי זמן. מרווח הזמן רלוונטי רק אם הקינטיקה של שינויי FRET (ולכן הפעלה/הפעלה של LRRC8/VRAC) נדרשת; אחרת, ניתן לבצע גם הקלטות פשוטות של "לפני ואחרי". אורך הניסוי תלוי בתהליך הפיזיולוגי. באופן אידיאלי, יש לעקוב אחר פעילות LRRC8/VRAC בגירויים עד לייצוב SE-FRET. גורמים אלה יכולים להיקבע בניסויי פיילוט. יש לקבוע גורמי תיקון לחישוב אות SE-FRET האמיתי עבור כל התנאים. גורמי תיקון שנקבעו באופן שגוי עלולים להוביל להערכת יתר או חסר של עוצמות SE-FRET. לבסוף, לאחר קביעת קו בסיס יציב, מרווח הזמן בין התמונות צריך להיות קצר מספיק כדי ללכוד את התהליך הפיזיולוגי של עניין.

השיטה נושאת כמה מגבלות. אחת מהן היא ששינויים בעוצמות ה-FRET הבין-LRRC8 תוך שיקוף תנועות ה-LRRDs, אינם בהכרח תואמים להעברת יונים או אוסמוליטים דרך הנקבוביות. זה ברור מהשינויים ב-FRET שנצפו עם LRRC8A homomers⁴⁵ למרות הזרמים המינימליים שלהם ^4,32,72. ייתכן שחוסמי נקבוביות של ערוצי LRRC8/VRAC לא ישפיעו על אות ה-FET, ולכן שיטה זו אינה מתאימה לחיפוש אחר אפנן ערוצים ספציפי. יתר על כן, רמות הביטוי של חלבוני LRRC8 המבוטאים יתר על המידה עשויות להשפיע על התהליכים הפיזיולוגיים הנצפים, במיוחד כאשר חלבוני LRRC8 המתויגים C סופניים מציגים פעילות בסיסית¹⁴.

היבט שיכול להיחשב כמגבלה או יתרון בהתאם לשאלת המחקר הספציפית הוא שבשיטה זו, רק תת-היחידות LRRC8 המבוטאות באופן אקטופי נמדדות באופן סלקטיבי. לכן, רמות רקע של חלבונים אנדוגניים כמעט ולא מפריעות למדידות. מצד שני, החלבונים המבוטאים יתר על המידה עשויים שלא להתנהג כמו תעלות LRRC8 אנדוגניות עם הרכב תת-יחידות וסטויכיומטריה שונים פוטנציאלית. לדוגמה, גירויים שונים כגון חמצון עשויים להיות בעלי השפעות מודולטוריות מנוגדות על תעלות LRRC8³⁶ המורכבות באופן שונה. על ידי שינוי היחסים בין תת-יחידות המבוטאות במשותף, ניתן לכוונן את הסטויכיומטריה שלהן ואת מוליכות היונים הכוללת^14,73, אך ההרכב המקורי שלהן, עם ככל הנראה לעתים קרובות יותר משני פרלוגים בתוך^{קומפלקס אחד 21}, אינו ברור ועשוי להשתנות בין סוגי תאים 74,75,76. יתר על כן, היתוך של חלבונים פלואורסצנטיים ל-C-termini הציטוסולי של חלבוני LRRC8 הוכח כמגביר את פעילות תעלת LRRC8/VRAC הבסיסית בביציות Xenopus ¹⁴, ככל הנראה משום שהתגים הגדולים מווסתים את הקונפורמציה של ה-LRRDs, אשר עשויים לשלוט בפתיחת התעלה 14,44,45 . לכן, גודלם של החלבונים הפלואורסצנטיים, המקשר והכיוון שלהם עשויים להשפיע לא רק על יעילות FRET אלא גם על פעילות התעלה. עם זאת, חשוב לציין, תעלות VRAC של חלבוני LRRC8 שהתמזגו עם חלבונים פלואורסצנטיים נותרו מגיבות לגירוי היפוטוני¹⁴, מה שאיפשר את השימוש בהם כחיישני FRET⁴⁵.

היתרונות של שיטה לא פולשנית זו לניטור פעילות ערוץ LRRC8/VRAC במיקרוסקופ אור בהשוואה לשיטות אחרות כוללים: (i) היא מאפשרת צפייה ב-LRRC8/VRAC בתוך תאים או תאים שבדרך כלל אינם נגישים לאלקטרופיזיולוגיה. זה כולל אברונים תוך תאיים שעליהם ניתן למצוא קומפלקסים של LRRC8 או לכוון אותם ל-45,77,78. (ii) ההרכב הציטוסולי נותר ללא שינוי בשיטה, בעוד שבמהלך מדידות מהדק טלאי של כל התא, הציטוזול מוחלף במידה רבה בתמיסת פיפטה, אשר עשויה להשפיע על מסלולי איתות כפי שנצפו עם הפעלת LRRC8/VRAC⁴⁵ הנגרמת על ידי phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA). (iii) הוא מציע את האפשרות לצפות בהפעלת LRRC8/VRAC ברזולוציה תת-תאית, כגון הבחנה בין פעילות בקצוות המובילים והנגררים במהלך נדידת תאים, כאשר -מוגבל לחללים סגורים - VRAC מעורב^79,80. (iv) הוא מאפשר ניטור רציף של פעילות LRRC8/VRAC במהלך תהליכים פיזיולוגיים מורחבים כגון התמיינות מיוציטים⁵⁶.

אמנם יש מגבלות ואתגרים בשיטה זו, אך היא טומנת בחובה הבטחה לחקירה נוספת, כולל יישומים פוטנציאליים במודלים של בעלי חיים. בשילוב עם שיטות אחרות לחקר משפחת תעלות היונים והאוסמוליטים, בדיקה מבוססת FRET זו עשויה לתרום באופן משמעותי לפענוח מנגנוני ההפעלה ולחקור את הפונקציות הפיזיולוגיות המגוונות של ערוצי LRRC8 בסביבתם הטבעית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	gibco	25300-054
Camera DFC9000GTC	Leica	11547007
CFP-18aa-YFP	N/A	N/A	Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Gift from C.F. Kaminski (University of Cambridge, UK)
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	66-81-9
D(-)-Mannitol	Carl Roth	4175.1
D(+)-Glucose	Carl Roth	HN06.1
DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)	PAN-Biotech	P04-03590
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)	PAN-Biotech	P04-36500
Emission filter wheel (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)	Leica	11525480
FBS (Fetal Bovine Serum)	PAN-Biotech	P30-3302
Filter cube CYR71010	Leica	11525416
FuGENE	Promega	E2691
Glas Bottom Culture Dishes 35 mm	MatTek	P35G-0-10-C
HeLa cells	Leibniz Forschungsinstitut DSMZ	ACC 57	Mammalian cervix carcinoma/ Obtained from Leibniz Forschungsinstitut DSMZ
HEPES	Carl Roth	9105.4
ibidi µ-Disch 35 mm	ibidi	81156
KCl (Potassium chloride)	Carl Roth	6781.1
LAS X FRET Wizard	Leica	11640862
Light source LED8	Leica	11504256
LRRC8A-mCerulean3	N/A	N/A	König et al. 2019
LRRC8E-mVenus	N/A	N/A	König et al. 2019
Luna-II Automated Cell Counter	logos biosystems	L40002
Luna-II Cell Counter Slides	logos biosystems	L12001
MgCl2 (Magnesium chloride)	Carl Roth	KK36.1
Microscope THUNDER Imager live cell	Leica	11525681
NaCl (Sodium chloride)	Carl Roth	9263
Objective HC PL APO 63x/1.40 OIL	Leica	11506349
Opti-Minimal Essential Medium (MEM)	gibco	11058
Osmometer OM807	Vogel	V04807
Penicillin Streptomycin (Pen Step)	gibco	15070-063
Trypan blue solution (0,4%)	Sigma	T8154
Tumor necrosis factor (TNF)-a	Sigma-Aldrich	94948-59-1
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA Scientific Instruments	VC3-4xG