אופטימיזציה של טכניקות אורודינמיות בעכבר לשיפור הדיוק

Summary

פרוטוקול זה מספק מדריך לאיטום העור עם ציאנואקרילט למניעת ספיגת שתן על ידי פרווה ועור. הוא כולל הוראות למריחת הדבק על העור, השתלת קטטר שלפוחית השתן ואלקטרודות לציסטומטריה ורישום אלקטרומיוגרפיה של סוגר שופכה חיצוני בעכברים ערים.

Abstract

מדידה מדויקת של פרמטרים במתן שתן בעכברים ערים חיונית להבנת תפקוד לקוי של דרכי השתן התחתונות (LUT), במיוחד במצבים כמו שלפוחית נוירוגנית ופגיעה פוסט-טראומטית בחוט השדרה (SCI). עם זאת, ביצוע רישומי ציסטומטריה בעכברים מציב אתגרים בולטים. כאשר עכברים נמצאים במצב נוטה ומוגבל במהלך מפגשי הקלטה, השתן נוטה להיספג על ידי הפרווה והעור, מה שמוביל להערכת חסר של נפח מבוטל (VV). מטרת מחקר זה הייתה לשפר את הדיוק של רישומי ציסטומטריה ואלקטרומיוגרפיה של סוגר שופכה חיצוני (EUS-EMG) בעכברים ערים. פיתחנו שיטה ייחודית המשתמשת בדבק ציאנואקרילט ליצירת מחסום עור עמיד למים סביב בשר השופכה והבטן, מניעת ספיגת שתן והקפדה על מדידות מדויקות. התוצאות מראות כי לאחר מריחת הציאנואקרילט, הסכום של VV ו- RV נשאר עקבי עם נפח המלח המוחדר, ולא נצפו אזורים רטובים לאחר הניסוי, מה שמצביע על מניעה מוצלחת של ספיגת השתן. בנוסף, השיטה ייצבה בו זמנית את האלקטרודות המחוברות לסוגר השופכה החיצוני (EUS), הבטיחה אותות אלקטרומיוגרפיה יציבים (EMG) ומזערה ממצאים שנגרמו על ידי תנועת העכבר המתעורר ומניפולציה של הנסיין. נדונים פרטים מתודולוגיים, תוצאות והשלכות, המדגישים את החשיבות של שיפור טכניקות אורודינמיות במחקר פרה-קליני.

Introduction

אחסון ושחרור השתן תלויים בפעילות המתואמת של שלפוחית השתן וסוגר השופכה החיצוני (EUS). בפתולוגיות מסוימות, כגון שלפוחית נוירוגנית, הן שרירי השלפוחית והן הסוגר עלולים להפוך לבלתי מתפקדים, מה שמוביל לבעיות משמעותיות בשלפוחית השתן, במיוחד לאחר פגיעה טראומטית בחוט השדרה (SCI)¹.

מכרסמים קטנים משמשים בדרך כלל כמודל ניסיוני לחקר התפקוד הפרה-קליני של דרכי השתן התחתונות (LUT)². טכניקות הקלטה של מילוי ציסטומטריה (FC) ואלקטרומיוגרפיה של EUS (EUS-EMG) יכולות לספק מידע אובייקטיבי מדויק בהתאם לבחירת השיטות, מדידה מדויקת ופרשנות התוצאות³. בדיקות אורודינמיות משמשות בדרך כלל להערכת נפח ההתרוקנות (VV), יעילות ההתרוקנות (VE) וקיבולת שלפוחית השתן⁴. VE מודד באיזו יעילות שלפוחית השתן יכולה לרוקן את עצמה. הוא מחושב על ידי חלוקת אמצעי האחסון המבוטל בסכום של אמצעי אחסון מבוטלים ואמצעי אחסון שיוריים (VV+RV). מצד שני, קיבולת שלפוחית השתן מחושבת על ידי הוספת VV (כמות השתן הנפלטת במהלך השתנה) ל- RV (כמות השתן שנותרה בשלפוחית השתן לאחר השתנה)⁵. לכן, מדידת VV ו- RV הם המפתחות להסקת פרמטרים אחרים.

מדידה מדויקת של VV בעכברים במהלך בדיקות אורודינמיות מציבה אתגרים שונים. השתן של מכרסמים, כאשר מרוסן פיזית במצב נוטה, נוטה להימשך כלפי מטה דרך דופן הבטן הגחון בשל השפעת כוח המשיכה⁶. תופעה זו יכולה להוביל לספיגת שתן על ידי פרוות הבטן והעור, אשר, בתורו, מעריך את נפח השתן המופרש. בהתחשב בכמות הקטנה של שתן המיוצר על ידי עכבר, ההשפעה של ספיגה זו על דיוק התוצאות בולטת עוד יותר⁷. יתר על כן, במודלים של SCI, VV הוא לעתים קרובות נמוך יותר מאשר בעכברים רגילים בשל ההשפעה של dyssynergia סוגר detrusor (DSD), אשר מגביר את הסיכון של לחצים נקודת דליפה וספיגת שתן על ידי פרווה⁸. לגורמים אלה יש השפעה משמעותית על התוצאות. לכן, מדידה מדויקת של VV ו-RV במהלך מחקרים אורודינמיים סופניים בעכברים היא קריטית⁹. נכון לעכשיו, חסרים פרטים במתודולוגיות שסופקו בספרות שפורסמה כיצד למדוד את נפח השתן בצורה מדויקת במודלים של עכברים.

דבק ציאנואקרילט הוא סוג של דבק המשמש בדרך כלל בהליכים כירורגיים במודלים של בני אדם ובעלי חיים בשל תכונות ההדבקה המהירות והיעילות שלו 10,11,12. דבק זה שימושי במיוחד לסגירת פצעים וחתכים, שכן הוא יוצר קשר חזק וגמיש כאשר מוחל על העור¹³. יתר על כן, זה יכול להיות מחסום גדול נגד שתן ורטיבות שעלולים לבוא במגע עם פרווה ופצעים¹¹.

במאמר זה פיתחנו טכניקה חדשנית וחסכונית המשתמשת בדבק ציאנואקרילט להשגת תוצאות מדויקות בציסטומטריה וברישומי EUS-EMG בעכברים ערים. שיטה זו תועיל בהבנת הגורמים הבסיסיים לתפקוד לקוי של שלפוחית השתן ובמציאת טיפולים יעילים יותר להפרעות LUT.

Protocol

פרוטוקול המחקר בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה. קוד אישור: 21098MD/R/MSS/HZ תאריך אישור: 29 בספטמבר 2021.

1. הכנת קטטר

1. חותכים צינור פוליאתילן PE-30 בגודל 30 ס"מ (0.017 אינץ' x 0.030 אינץ'). השתמשו במצית כדי להבעיר קצה אחד של הצינור, לוודא שהוא לא נוגע בלהבה, ומשכו את המצית ברגע שהצינור יצר קצה עגול בצורת פעמון מתאים.
2. הכניסו בזהירות כ-3/4 ממחט ה-25G לקצה השני של הצינור. מכינים מזרק 1 מ"ל וממלאים אותו ב-0.9% NaCl סטרילי. חבר את המזרק למחט 25 גרם.
3. יש להחדיר בעדינות מי מלח כדי לבדוק אם יש קצה עגול תקין ואין דליפה מקצות המחט. ודא שלא מורגש לחץ ומלוחים זורמים בצורה חלקה דרך הצנתר.

2. הכנת אלקטרודות

1. מכינים 2 חוטי פלדה באורך 20 ס"מ. קח את חוטי הפלדה והחל פוליש חול על שני הקצוות של אזור הציפוי כדי לפשוט 5 מ"מ מהחוט.
2. קח מחט 25G והכנס אותה בצד אחד של החוט. הקפד להחדיר את המחט בזהירות כדי למנוע נזק לחוט. כופפו את החלק המופשט של החוט כמו וו. הוו יעזור לחבר את החוט לשריר EUS.
3. השתמש בהלחמה כדי לחבר את הסיכה לקצה השני של חוט הפסים. הלחמה תסייע לאבטח את הסיכה לחוט ותבטיח חיבור חזק. הקפידו לחמם את הלחמת עופרת הפח עד שהיא נמסה ומכסה את החוט והסיכה.

3. הכנת בעלי חיים

1. נקבת עכבר C57BL/6 (בת 8 שבועות, משקל גוף של 18-20 גרם) במתקן לבעלי חיים על פי Institutional Animal Care עם מחזור אור-חושך של 12 שעות וגישה בלתי מוגבלת למים וכדורי מזון סטנדרטיים.

4. הרדמה במהלך הניתוח

1. הניחו את בעלי החיים בתא איזופלורן 2% וחמצן טהור (1 ליטר/דקה). יש לאשר את ההרדמה המלאה של בעל החיים באמצעות בדיקת צביטה שלילית בבוהן לפני העברתו למסכה. לאחר האישור, שנו את מצב הגז למסכה.
2. יש לוודא כי מסכת ההרדמה קבועה במיקום המתאים בשדה הניתוחי הסטרילי. הניחו את בעל החיים בשכיבה על הווילונות הסטריליים עם אפו במסכת שאיפה קטנה (0.8-1 ליטר/דקה עם 2% איזופלורן) להמשך מתן הרדמה.

5. הכנה כירורגית

1. תקן את הגפיים של החיה עם קלטת. השתמש בסכין גילוח חשמלי כדי לגלח את הפרווה של הבטן התחתונה וסביב בשר השופכה (אזור איברי המין).
2. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע יובש פוטנציאלי בעיניים. הכינו את האזור המגולח באמצעות תמיסת פובידון-יוד ונגבו את התמיסה עם אתנול 70%. הניחו וילון סטרילי על אזור הניתוח.

6. הליך כירורגי

1. השתלת קטטר שלפוחית השתן
   1. תחת המיקרוסקופ הכירורגי, באמצעות מספריים ישרים וקהים של מצנבאום, יוצרים חתך של 1-2 ס"מ בקו האמצע של עור הבטן. המשך לחתוך את הפאשיה ואת השרירים בקו האמצע כדי לחשוף את שלפוחית השתן דרך פצע החתך.
   2. ברגע ששלפוחית השתן נראית דרך פצע החתך, המשך לסגת את כל האיברים או הרקמות שמסביב לפי הצורך כדי לקבל מבט ברור על שדה הניתוח. היזהר להימנע מכל מניפולציה מיותרת או מתח על שלפוחית השתן, שכן זה יכול להוביל לסיבוכים כגון דליפת שתן או פגיעה במבנים שמסביב.
   3. אחזו בכיפת שלפוחית השתן והניחו חוט ארנק על ידי שימוש בתפר מונופילמנט 5-0 שאינו נספג עם מחט מחודדת.
   4. בעזרת מיקרו מספריים, יוצרים ציסטומיה קטנה בתוך חוט הארנק ויוצרים חור עד שהשתן זורם החוצה.
   5. אחזו בקצה העגול של הצנתר והכניסו אותו דרך החור. לאחר שקצה הצינור עבר דרך החור, תפרו את חוט הארנק סביב הצינור. לאחר מכן, משוך בעדינות את הצינור החוצה עד שהקצה מורגש מתחת לתפר.
   6. יש להחדיר באיטיות 1 מ"ל של מי מלח מהקצה השני של הצינור כדי להרחיק את שלפוחית השתן. בדוק אם יש דליפה סביב הצנתר. אם קיימת דליפה, יש להניח תפר נוסף.
   7. ברגע שהמלח יוצא מהשופכה, משכו את המלח כדי לשחרר את הלחץ על שלפוחית השתן.
2. השתלת אלקטרודות EUS (איור 1)
   1. השתמש מספריים כירורגיים כדי להאריך את חתך הבטן עד רצפת האגן.
   2. בקו אחד עם שלפוחית השתן, העבירו את השרירים והקרומים לתעלות הפודנדל ואתרו את שריר השופכה והסוגר החיצוני. היזהר לא לפגוע בכלי הדם הקאודליים האיליאק והאמצעי ובעצבים פודנדליים.
   3. נקב את העור דו צדדי, 1 ס"מ מן בשר השופכה, באמצעות המחט המכילה את האלקטרודה.
   4. תפסו בזהירות את קצה הקרס במלקחיים ומשכו בעדינות את המחט הרחק מהעור.
   5. בעזרת קצה האלקטרודה, חברו בזהירות את שריר ה-EUS באופן דו-צדדי. הימנע אגרוף עמוק מדי, כמו זה עלול לפגוע בשריר, אשר עלול להוביל דליפת שתן אפשרית.
   6. השתמש מונופילמנט 3-0 שאינו נספג כדי לתפור את שרירי האגן והבטן ואת העור.
3. איטום העור
   1. יש למרוח שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על העור שממנו יוצאות האלקטרודות כדי לקבע את האלקטרודות במקומן.
   2. יש למרוח את דבק הציאנואקרילט במרחק של 1 ס"מ המקיף את בשר השופכה ו-3 ס"מ בהמשך לאזור הבטן והתפר. כדי למנוע מגע עם הדבק, בזהירות להחזיק את meatus עם מלקחיים.
   3. השתמש מיקרופיפטה 0.5-10 μL כדי למשוך את נוזל המאיץ כדי לייבש את הדבק.
      זהירות: נוזל מאיץ הוא נוזל בעיר.
   4. הוסיפו את נוזל ההאצה כדי להבטיח תגובת דבק נאותה. זה יעזור לייבש את הדבק מהר יותר ולהבטיח שהוא מתקבע היטב.
4. הכנה אורודינמית
   1. הכינו סירת פוליסטירן הפוכה במשקל 4.5 ס"מ אורך, רוחב ועומק. חותכים אותו לצורת משולש עם בסיס של 4 ס"מ כדי לשים את בשר השופכה של העכבר בחלל זה. שים את תבנית הבסיס חד פעמי, 37 מ"מ x 24 מ"מ x 5 מ"מ, מתחת לחלל לאיסוף השתן.
   2. מקם מחדש את העכבר במצב נוטה והעבר אותו בזהירות לצלחת בהתאמה אישית המצוידת במסכת גז.
   3. ודא כי בשר השופכה ממוקם כראוי בתוך החריץ. אזנו בעדינות את הראש והאיבר של העכבר בעזרת נייר דבק והניחו את הצלחת על כרית חימום עד שהעכבר יחזור להכרה מלאה (איור 2).
   4. בצע ציסטומטריה רק כאשר העכבר ער לחלוטין, כלומר לפחות 40 דקות לאחר ההתאוששות מהרדמה.

7. הכנת הקלטה לציסטומטריה ו-EUS-EMG

1. הגדר וכייל את משאבת העירוי בהתאם להוראות היצרן.
2. קחו מזרק 20 מ"ל בקוטר 19.05 מ"מ ומלאו אותו ב-0.9% NaCl סטרילי בטמפרטורת החדר. הצמידו את המזרק למשאבת העירוי. הגדר את מהירות העירוי ל- 0.01 מ"ל/דקה.
3. חבר את המזרק על ידי צינור PE-30 לצד אחד של המחבר התלת-כיווני. חברו את צנתר שלפוחית השתן לצד השני למתמר לחץ. לפני חיבור צנתר שלפוחית השתן, יש להקפיד להסיר את כל בועות האוויר.
4. תקן את מתמר הלחץ באותה רמה כמו שלפוחית השתן של העכבר. מתמר הלחץ מחובר באמצעות מגבר למערכת איסוף הנתונים.
5. חבר וו קו הארקה אחד לעור ואת השני לאתרי מחבר האלקטרודות. רשום את הלחץ בתוכנה.
6. לאחר הפעלת התוכנה, בדוק את הלחץ התוך-שלפוחית (IVP) ואת אותות EUS-EMG. שמור את שם הדוגמה והגדר את השעה.
7. התחל את עירוי המשאבה. הקלט את האותות.

תוצאות

ציסטומטריה ומעקב פעילות EUS-EMG שימשו לניתוח הנתונים. שיטת הציסטומטריה הרציפה כוללת עירוי של מי מלח לשלפוחית השתן ובו זמנית מדידת שינויי הלחץ והנפח בשלפוחית השתן. כדי למדוד VV, 0.4 מ"ל של מי מלח הוחדרו במהירות של 0.01 מ"ל לדקה, והשתן נאסף במשך 40 דקות בכובע. ניתן לקבל את השארית שלאחר הריק (PVR) על ידי שא...

Discussion

טכניקה אורודינמית זו מתארת הליך משופר למדידת נפח השתן ואות EUS-EMG בעכברים ערים ומרוסנים. נוכחות של פרווה סביב בשר השופכה ואזור הבטן יכול להפריע לדיוק של מדידת VV על ידי ספיגת שתן. למרות שהפרווה סביב בשר השופכה והבטן גולחה בקפידה לפני הניתוח, הפרוות הקטנות שנותרו באזורים אלה והעור עדיין ספגו ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accelerator	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
Cyanoacrylate	TED PELLA, Inc	14478
Disposable base mold	TED PELLA, Inc	27147-4
Infusion pump	Harvard Apparatus PHD ULTRA	70-3006
Isoflurane	Henry Schein Inc	1182097
PIN	World Precision Instruments	5482
Polyethylene Tubing 30	Braintree Scientific Inc	PE30
Sterile Weighing Boat	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite	DATAQ INSTRUMENTS	249022