Otimizando técnicas urodinâmicas de camundongos para maior precisão

Resumo

Este protocolo fornece um guia para impermeabilizar a pele com cianoacrilato para evitar a absorção de urina pelo e pela pele. Inclui instruções para aplicar a cola na pele, implantar um cateter vesical e eletrodos para cistometria e registros de eletromiografia do esfíncter uretral externo em camundongos acordados.

Resumo

A medição precisa dos parâmetros urinários em camundongos acordados é crucial para entender a disfunção do trato urinário inferior (LUT), particularmente em condições como lesão neurogênica da medula espinhal pós-traumática (LME). No entanto, a realização de registros de cistometria em camundongos apresenta desafios notáveis. Quando os camundongos estão em uma posição propensa e restrita durante as sessões de gravação, a urina tende a ser absorvida pelo e pela pele, levando a uma subestimação do volume miccional (VV). O objetivo deste estudo foi aumentar a precisão dos registros de cistometria e eletromiografia do esfíncter uretral externo (EUS-EMG) em camundongos acordados. Desenvolvemos um método exclusivo utilizando adesivo de cianoacrilato para criar uma barreira cutânea à prova d'água ao redor do meato uretral e do abdômen, impedindo a absorção de urina e garantindo medições precisas. Os resultados mostram que, após a aplicação do cianoacrilato, a soma de VV e VR permaneceu consistente com o volume de solução salina infundida, e não foram observadas áreas úmidas após o experimento, indicando prevenção bem-sucedida da absorção de urina. Além disso, o método estabilizou simultaneamente os eletrodos conectados ao esfíncter uretral externo (EUS), garantiu sinais de eletromiografia (EMG) estáveis e minimizou os artefatos causados pelo movimento do camundongo acordado e pela manipulação do experimentador. Detalhes metodológicos, resultados e implicações são discutidos, destacando a importância de melhorar as técnicas urodinâmicas na pesquisa pré-clínica.

Introdução

O armazenamento e a liberação de urina dependem da atividade coordenada da bexiga urinária e do esfíncter uretral externo (USE). Em algumas patologias, como a bexiga neurogênica, tanto os músculos detrusores da bexiga quanto o esfíncter podem se tornar disfuncionais, levando a problemas vesicais significativos, especialmente após lesão medular traumática (LM)¹.

Pequenos roedores são comumente usados como modelo experimental para estudar a função pré-clínica do trato urinário inferior (LUT)². As técnicas de registro de cistometria de enchimento (FC) e eletromiografia EUS (EUS-EMG) podem fornecer informações objetivas precisas, dependendo da escolha dos métodos, medição precisa e interpretação dos resultados³. Os testes urodinâmicos são comumente usados para avaliar o volume miccional (VV), a eficiência miccional (VE) e a capacidade vesical⁴. O VE mede a eficácia com que a bexiga pode se esvaziar. É calculado dividindo o volume miccional pela soma dos volumes anulados e residuais (VV+RV). Por outro lado, a capacidade vesical é calculada somando-se o VV (a quantidade de urina expelida durante a micção) ao VD (a quantidade de urina deixada na bexiga após a micção)⁵. Portanto, a medição de VV e VR são as chaves para deduzir outros parâmetros.

Medir com precisão o VV em camundongos durante testes urodinâmicos apresenta vários desafios. A urina dos roedores, quando fisicamente contida em decúbito ventral, tende a ser puxada para baixo através da parede abdominal ventral devido à influência da gravidade⁶. Esse fenômeno pode levar à absorção de urina pelo e pele abdominais, o que, por sua vez, subestima o volume de urina excretado. Considerando a pequena quantidade de urina produzida por camundongos, o impacto dessa absorbância na precisão dos resultados é ainda mais pronunciado⁷. Além disso, em modelos de LM, o VV é frequentemente menor do que em camundongos normais devido ao impacto da dissinergia do esfíncter detrusor (DSD), que aumenta o risco de pressões de pontos de vazamento e absorção de urina pelo^{pêlo 8}. Esses fatores têm um impacto significativo nos resultados. Portanto, a medição precisa de VV e RV durante estudos urodinâmicos terminais em camundongos é crucial⁹. Atualmente, há uma falta de detalhes nas metodologias fornecidas na literatura publicada sobre como medir o volume de urina com precisão em modelos de camundongos.

O adesivo de cianoacrilato é um tipo de cola comumente utilizada em procedimentos cirúrgicos em modelos humanos e animais devido às suas propriedades de colagem rápida e eficaz 10,11,12. Esse adesivo é particularmente útil para fechar feridas e lacerações, pois forma uma ligação forte e flexível quando aplicado na pele¹³. Além disso, pode ser uma grande barreira contra a urina e a umidade que podem entrar em contato com pelos e feridas¹¹.

Neste artigo, desenvolvemos uma técnica nova e econômica que utiliza adesivo de cianoacrilato para obter resultados precisos em registros de cistometria e EUS-EMG em camundongos acordados. Este método será benéfico para entender as causas subjacentes da disfunção da bexiga e desenvolver tratamentos mais eficazes para distúrbios da LUT.

Protocolo

O protocolo de estudo em animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Indiana. Código de aprovação: 21098MD/R/MSS/HZ Data de aprovação: 29 de setembro de 2021.

1. Preparação do cateter

1. Corte um tubo de polietileno PE-30 de 30 cm (0,017 polegadas x 0,030 polegadas). Use um isqueiro para alargar uma extremidade do tubo, certificando-se de que não toque na chama, e retire o isqueiro assim que o tubo formar uma ponta apropriadamente redonda em forma de sino.
2. Insira cuidadosamente cerca de 3/4 da agulha 25G na outra extremidade do tubo. Prepare uma seringa de 1 mL e encha-a com NaCl estéril a 0,9%. Conecte a seringa à agulha de 25 G.
3. Infunda suavemente solução salina para verificar se há uma ponta redonda adequada e sem vazamento das extremidades da agulha. Certifique-se de que nenhuma pressão seja sentida e que a solução salina flua suavemente através do cateter.

2. Preparação de eletrodos

1. Prepare 2 fios de aço de 20 cm de comprimento. Pegue os fios de aço e aplique polidor de areia em ambas as extremidades da zona de revestimento para descascar 5 mm do fio.
2. Pegue uma agulha 25G e insira-a em um lado do fio. Certifique-se de inserir a agulha com cuidado para evitar danificar o fio. Dobre a parte descascada do fio como um gancho. O gancho ajudará a conectar o fio ao músculo EUS.
3. Use solda para prender o pino na outra extremidade do fio listrado. A soldagem ajudará a prender o pino ao fio e garantir uma conexão forte. Certifique-se de aquecer a solda de estanho-chumbo até que ela derreta e cubra o fio e o pino.

3. Preparação do animal

1. Camundongo C57BL/6 fêmea de casa (8 semanas de idade, 18-20 g de peso corporal) no biotério de acordo com o Institutional Animal Care com um ciclo claro-escuro de 12 h e acesso ilimitado a água e pellets de comida padrão.

4. Anestesia durante a cirurgia

1. Colocar os animais em uma câmara de isoflurano a 2% e oxigênio puro (1 L/min). Confirme a anestesia completa do animal usando um exame negativo do dedo do pé antes de transferi-lo para a máscara. Uma vez confirmado, altere a condição do gás para uma máscara.
2. Certifique-se de que a máscara de anestesia esteja fixada na posição apropriada no campo cirúrgico estéril. Coloque o animal em decúbito dorsal no campo estéril com o nariz em uma pequena máscara de inalação (0,8-1 L/min com 2% de isoflurano) para continuar administrando anestesia.

5. Preparação cirúrgica

1. Fixe os membros do animal com fita adesiva. Use um barbeador elétrico para raspar o pelo da parte inferior do abdômen e ao redor do meato uretral (região genital).
2. Aplique uma pomada para os olhos para evitar qualquer ressecamento potencial nos olhos. Prepare a área raspada usando a solução de iodopovidona e limpe a solução com etanol a 70%. Coloque uma cortina estéril na região da cirurgia.

6. Procedimento cirúrgico

1. Implante de cateter vesical
   1. Sob o microscópio cirúrgico, utilizando uma tesoura reta e romba de Metzenbaum, crie uma incisão de 1-2 cm na linha média da pele abdominopélvica. Prossiga para incisar a fáscia e os músculos na linha média para expor a bexiga através da ferida incisional.
   2. Assim que a bexiga estiver visível através da ferida incisional, proceda à retração de quaisquer órgãos ou tecidos circundantes conforme necessário para obter uma visão clara do campo cirúrgico. Tome cuidado para evitar qualquer manipulação ou tensão desnecessária na bexiga, pois isso pode levar a complicações como vazamento urinário ou lesões nas estruturas circundantes.
   3. Segure a cúpula da bexiga e coloque um cordão de bolsa utilizando uma sutura de monofilamento não absorvível 5-0 com uma agulha de ponta cônica.
   4. Usando uma microtesoura, crie uma pequena cistostomia dentro do cordão da bolsa e faça um furo até que a urina saia.
   5. Segure a extremidade da ponta redonda do cateter e insira-a através do orifício. Depois que a ponta do tubo passar pelo orifício, suture o cordão da bolsa ao redor do tubo. Em seguida, puxe suavemente o tubo para fora até que a ponta seja sentida sob a sutura.
   6. Infunda lentamente 1 mL de solução salina da outra extremidade do tubo para distender a bexiga. Verifique se há vazamento ao redor do cateter. Se houver vazamento, coloque uma sutura adicional.
   7. Assim que a solução salina sair da uretra, retire a solução salina para descomprimir a bexiga.
2. Implante de eletrodos de EUS (Figura 1)
   1. Use uma tesoura cirúrgica para estender a incisão abdominal até o assoalho pélvico.
   2. Em linha com a bexiga, mova os músculos e membranas para os canais pudendos e localize a uretra e o músculo do esfíncter externo. Tenha cuidado para não machucar os vasos ilíacos e caudais médios e os nervos pudendos.
   3. Puncionar a pele bilateralmente, a 1 cm de distância do meato uretral, utilizando a agulha contendo o eletrodo.
   4. Segure cuidadosamente a ponta do gancho com uma pinça e puxe suavemente a agulha para longe da pele.
   5. Usando a ponta do eletrodo, prenda cuidadosamente o músculo EUS bilateralmente. Evite socar muito fundo, pois isso pode prejudicar o músculo, o que pode levar a um possível vazamento de urina.
   6. Use o monofilamento inabsorvível 3-0 para suturar os músculos pélvicos e abdômen e a pele.
3. Impermeabilização da pele
   1. Aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato na pele por onde os eletrodos saem para fixar os eletrodos no lugar.
   2. Aplique a cola de cianoacrilato a 1 cm de distância ao redor do meato uretral e 3 cm estendendo-se até o abdômen e região suturada. Para evitar o contato com a cola, segure cuidadosamente o meato com uma pinça.
   3. Use uma micropipeta de 0,5-10 μL para retirar o líquido acelerador para secar a cola.
      CUIDADO: O líquido do acelerador é um líquido combustível.
   4. Adicione o líquido acelerador para garantir a reação adesiva adequada. Isso ajudará a secar a cola mais rapidamente e garantir que ela endureça com segurança.
4. Preparação urodinâmica
   1. Prepare um barco de pesagem de poliestireno invertido com 4,5 cm de comprimento, largura e profundidade. Corte-o em forma de triângulo com uma base de 4 cm para colocar o meato da uretra do rato neste espaço. Coloque o molde de base descartável, 37 mm x 24 mm x 5 mm, sob o espaço para coleta da urina.
   2. Reposicione o mouse em uma posição de bruços e mova-o cuidadosamente para uma placa personalizada equipada com uma máscara de gás.
   3. Certifique-se de que o meato uretral esteja posicionado corretamente dentro do sulco. Aperte suavemente a cabeça e o membro do mouse com fita adesiva e coloque a placa em uma almofada de aquecimento até que o mouse recupere a consciência total (Figura 2).
   4. Realize a cistometria somente quando o mouse estiver totalmente acordado, o que ocorre pelo menos 40 minutos após a recuperação da anestesia.

7. Preparação para registro de cistometria e EUS-EMG

1. Configure e calibre a bomba de infusão de acordo com as instruções do fabricante.
2. Pegue uma seringa de 20 mL com um diâmetro de 19,05 mm e encha-a com NaCl estéril a 0,9% à temperatura ambiente. Fixe a seringa à bomba de perfusão. Defina a velocidade de infusão para 0,01 mL / min.
3. Conecte a seringa pelo tubo PE-30 a um lado do conector de três vias. Conecte o cateter vesical do outro lado a um transdutor de pressão. Antes de conectar o cateter vesical, certifique-se de remover todas as bolhas de ar.
4. Fixe o transdutor de pressão no mesmo nível da bexiga do mouse. O transdutor de pressão é conectado através de um amplificador ao sistema de aquisição de dados.
5. Prenda um gancho de linha de aterramento à pele e o outro aos locais do conector do eletrodo. Registre a pressão no software.
6. Depois de iniciar o software, verifique os sinais de pressão intravesical (IVP) e EUS-EMG. Salve o nome da amostra e defina a hora.
7. Inicie a infusão da bomba. Registre os sinais.

Resultados

Os traçados de atividade de cistometria e EUS-EMG foram usados para analisar os dados. O método de cistometria contínua envolve a infusão de solução salina na bexiga e, simultaneamente, a medição das mudanças de pressão e volume na bexiga. Para medir a VV, 0,4 mL de solução salina foi infundido a uma velocidade de 0,01 mL/min, e a urina foi coletada por 40 min em uma tampa. O resíduo pós-miccional (RVP) pode ser obtido aspirando a solução salina através do cateter. Em camundongos normais sem cola, a soma...

Discussão

Esta técnica urodinâmica descreve um procedimento aprimorado para medir o volume de urina e o sinal EUS-EMG em camundongos acordados e contidos. A presença de pêlos ao redor do meato uretral e da área abdominal pode interferir na precisão da medição da VV pela absorção da urina. Embora o pêlo ao redor do meato uretral e do abdômen tenha sido cuidadosamente raspado antes da cirurgia, os pequenos pêlos restantes dentro dessas áreas e a pele ainda absorveram a urina, geralmente deixando uma área úmida no abd...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accelerator	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
Cyanoacrylate	TED PELLA, Inc	14478
Disposable base mold	TED PELLA, Inc	27147-4
Infusion pump	Harvard Apparatus PHD ULTRA	70-3006
Isoflurane	Henry Schein Inc	1182097
PIN	World Precision Instruments	5482
Polyethylene Tubing 30	Braintree Scientific Inc	PE30
Sterile Weighing Boat	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite	DATAQ INSTRUMENTS	249022