Optimierung urodynamischer Maustechniken für eine verbesserte Genauigkeit

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen Leitfaden für die Imprägnierung der Haut mit Cyanacrylat, um die Aufnahme von Urin durch Fell und Haut zu verhindern. Es enthält Anweisungen zum Auftragen des Klebers auf die Haut, zum Implantieren eines Blasenkatheters und Elektroden für die Zystometrie und die Elektromyographie des externen Harnröhrenschließmuskels bei wachen Mäusen.

Zusammenfassung

Die genaue Messung von Harnparametern bei wachen Mäusen ist entscheidend für das Verständnis von Funktionsstörungen der unteren Harnwege (LUT), insbesondere bei Erkrankungen wie der neurogenen Blase nach einer posttraumatischen Rückenmarksverletzung (SCI). Die Durchführung von Zystometrie-Aufzeichnungen an Mäusen stellt jedoch erhebliche Herausforderungen dar. Wenn sich Mäuse während der Aufnahme in einer liegenden und eingeschränkten Position befinden, neigt der Urin dazu, von Fell und Haut aufgenommen zu werden, was zu einer Unterschätzung des entleerten Volumens (VV) führt. Das Ziel dieser Studie war es, die Genauigkeit der Zystometrie und der externen Harnröhrenschließmuskel-Elektromyographie (EUS-EMG) bei wachen Mäusen zu verbessern. Wir haben eine einzigartige Methode entwickelt, bei der Cyanacrylatklebstoff verwendet wird, um eine wasserdichte Hautbarriere um den Harnröhrengang und den Bauch zu schaffen, die die Aufnahme von Urin verhindert und präzise Messungen gewährleistet. Die Ergebnisse zeigen, dass nach dem Auftragen des Cyanacrylats die Summe von VV und RV mit dem infundierten Kochsalzvolumen konsistent blieb und nach dem Experiment keine feuchten Bereiche beobachtet wurden, was auf eine erfolgreiche Verhinderung der Urinabsorption hinweist. Darüber hinaus stabilisierte die Methode gleichzeitig die Elektroden, die mit dem externen Harnröhrenschließmuskel (EUS) verbunden waren, sorgte für stabile Elektromyographie-Signale (EMG) und minimierte Artefakte, die durch die Bewegung der erwachten Maus und die Manipulation des Experimentators verursacht wurden. Methodische Details, Ergebnisse und Implikationen werden diskutiert und unterstreichen die Bedeutung der Verbesserung urodynamischer Techniken in der präklinischen Forschung.

Einleitung

Die Speicherung und Abgabe von Urin ist abhängig von der koordinierten Aktivität der Harnblase und des äußeren Harnröhrenschließmuskels (EUS). Bei einigen Pathologien wie der neurogenen Blase können sowohl die Detrusormuskulatur der Blase als auch der Schließmuskel dysfunktional werden, was zu erheblichen Blasenproblemen führt, insbesondere nach einer traumatischen Rückenmarksverletzung (SCI)¹.

Kleine Nagetiere werden häufig als experimentelles Modell verwendet, um die präklinische Funktion der unteren Harnwege (LUT) zu ^untersuchen2. Die Aufzeichnungstechniken der Filling-Zystometrie (FC) und der EUS-Elektromyographie (EUS-EMG) können je nach Wahl der Methoden, genaue Messung und Interpretation der Ergebnisse präzise objektive Informationen liefern³. Urodynamische Tests werden häufig verwendet, um das Entleerungsvolumen (VV), die Entleerungseffizienz (VE) und die Blasenkapazität^{zu bewerten 4}. VE misst, wie effektiv sich die Blase selbst entleeren kann. Sie wird berechnet, indem das entleerte Volumen durch die Summe der entleerten und verbleibenden Volumina dividiert wird (VV+RV). Auf der anderen Seite wird die Blasenkapazität berechnet, indem die VV (die Menge an Urin, die beim Wasserlassen ausgestoßen wird) zum RV (die Menge an Urin, die nach dem Wasserlassen in der Blase verbleibt) addiert ^wird5. Daher ist die Messung von VV und RV der Schlüssel zur Ableitung anderer Parameter.

Die präzise Messung der VV bei Mäusen im Rahmen urodynamischer Tests stellt verschiedene Herausforderungen dar. Der Urin von Nagetieren neigt dazu, aufgrund des Einflusses der Schwerkraft durch die Bauchdecke nach unten gezogen zu werden, wenn er körperlich in Bauchlage gefesselt ist⁶. Dieses Phänomen kann dazu führen, dass der Urin über das Bauchfell und die Haut aufgenommen wird, was wiederum die Menge des ausgeschiedenen Urins unterschätzt. In Anbetracht der geringen Menge an Urin, die von der Maus produziert wird, ist der Einfluss dieser Absorption auf die Genauigkeit der Ergebnisse noch ausgeprägter⁷. Darüber hinaus ist die VV in Modellen der Querschnittlähmung aufgrund des Einflusses der Detrusor-Sphinkter-Dyssynergie (DSD) oft niedriger als bei normalen Mäusen, was das Risiko von Leckpunktdrücken und Urinaufnahme durch das Fell erhöht⁸. Diese Faktoren haben einen wesentlichen Einfluss auf die Ergebnisse. Daher ist die genaue Messung von VV und RV während terminaler urodynamischer Studien an Mäusen von entscheidender Bedeutung⁹. Derzeit mangelt es an Details in den in der veröffentlichten Literatur bereitgestellten Methoden zur genauen Messung des Urinvolumens in Mausmodellen.

Cyanacrylat-Klebstoff ist eine Art Klebstoff, der aufgrund seiner schnellen und effektiven Klebeeigenschaften häufig bei chirurgischen Eingriffen in Menschen- und Tiermodellen verwendet wird 10,11,12. Dieser Klebstoff eignet sich besonders gut zum Verschließen von Wunden und Schnittwunden, da er beim Auftragen auf die Haut eine starke und flexible Verbindung bildet¹³. Darüber hinaus kann es eine große Barriere gegen Urin und Nässe sein, die mit Fell und Wunden in Kontakt kommen können¹¹.

In diesem Artikel haben wir eine neuartige und kostengünstige Technik entwickelt, die Cyanacrylat-Klebstoff verwendet, um präzise Ergebnisse bei der Zystometrie und EUS-EMG-Aufzeichnung bei wachen Mäusen zu erzielen. Diese Methode wird nützlich sein, um die zugrunde liegenden Ursachen von Blasenfunktionsstörungen zu verstehen und wirksamere Behandlungen für LUT-Störungen zu entwickeln.

Protokoll

Das Tierstudienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University School of Medicine genehmigt. Zulassungscode: 21098MD/R/MSS/HZ Zulassungsdatum: 29. September 2021.

1. Vorbereitung des Katheters

1. Schneiden Sie ein 30 cm langes Rohr aus Polyethylen PE-30 (0,017 Zoll x 0,030 Zoll) ab. Verwende ein Feuerzeug, um ein Ende des Rohrs abzufackeln, um sicherzustellen, dass es die Flamme nicht berührt, und ziehe das Feuerzeug zurück, sobald das Rohr eine entsprechend runde, glockenförmige Spitze gebildet hat.
2. Führen Sie vorsichtig etwa 3/4 der 25G-Nadel in das andere Ende der Tube ein. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor und füllen Sie sie mit sterilem 0,9 % NaCl. Verbinden Sie die Spritze mit der 25 G Nadel.
3. Ziehen Sie vorsichtig Kochsalzlösung auf, um zu überprüfen, ob die Spitze richtig ist und keine Leckagen an den Enden der Nadel auftreten. Stellen Sie sicher, dass kein Druck zu spüren ist und die Kochsalzlösung reibungslos durch den Katheter fließt.

2. Vorbereitung der Elektroden

1. Bereiten Sie 2 Stahldrähte von 20 cm Länge vor. Nehmen Sie die Stahldrähte und tragen Sie Sandpolitur auf beide Enden der Beschichtungszone auf, um 5 mm des Drahtes abzustreifen.
2. Nehmen Sie eine 25G-Nadel und führen Sie sie auf einer Seite des Drahtes ein. Achten Sie darauf, die Nadel vorsichtig einzuführen, um den Draht nicht zu beschädigen. Biegen Sie den abisolierten Teil des Drahtes wie einen Haken. Der Haken hilft dabei, den Draht mit dem EUS-Muskel zu verbinden.
3. Verwenden Sie Lötmittel, um den Stift am anderen Ende des gestreiften Drahtes zu befestigen. Das Löten hilft, den Stift am Draht zu befestigen und eine starke Verbindung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass Sie das Zinn-Blei-Löten erhitzen, bis es schmilzt und den Draht und den Stift bedeckt.

3. Vorbereitung des Tieres

1. Haltung der weiblichen C57BL/6 Maus (8 Wochen alt, 18-20 g Körpergewicht) in der Tiereinrichtung gemäß Institutional Animal Care mit einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus und unbegrenztem Zugang zu Wasser und handelsüblichen Futterpellets.

4. Anästhesie während der Operation

1. Bringen Sie die Tiere in eine Kammer mit 2 % Isofluran und reinem Sauerstoff (1 l/min). Bestätigen Sie die vollständige Anästhesie des Tieres mit einer negativen Zehenkneifuntersuchung, bevor Sie sie auf die Maske übertragen. Ändern Sie nach der Bestätigung den Gaszustand in eine Maske.
2. Stellen Sie sicher, dass die Anästhesiemaske in der richtigen Position auf dem sterilen Operationsfeld fixiert ist. Legen Sie die Rückenlage des Tieres mit der Nase in einer kleinen Inhalationsmaske (0,8-1 L/min mit 2% Isofluran) auf das sterile Tuch, um die Narkose fortzusetzen.

5. Chirurgische Vorbereitung

1. Fixieren Sie die Gliedmaßen des Tieres mit Klebeband. Rasieren Sie mit einem Elektrorasierer das Fell des Unterbauchs und um den Harnröhrengang (Genitalbereich).
2. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um eine mögliche Trockenheit der Augen zu verhindern. Bereiten Sie die rasierte Stelle mit der Povidon-Jod-Lösung vor und wischen Sie die Lösung mit 70%igem Ethanol ab. Legen Sie ein steriles Tuch auf die Operationsregion.

6. Chirurgischer Eingriff

1. Implantation eines Blasenkatheters
   1. Unter dem Operationsmikroskop mit einer geraden, stumpfen Metzenbaum-Schere einen 1-2 cm langen Schnitt in der Mittellinie der Bauch-Becken-Haut vornehmen. Fahren Sie mit dem Schnitt der Faszien und Muskeln in der Mittellinie fort, um die Blase durch die Schnittwunde freizulegen.
   2. Sobald die Blase durch die Schnittwunde sichtbar ist, ziehen Sie bei Bedarf alle umliegenden Organe oder Gewebe zurück, um eine klare Sicht auf das Operationsfeld zu erhalten. Achten Sie darauf, unnötige Manipulationen oder Spannungen an der Blase zu vermeiden, da dies zu Komplikationen wie Harnverlust oder Verletzungen der umliegenden Strukturen führen kann.
   3. Fassen Sie die Blasenkuppel und platzieren Sie eine Geldbeutelschnur, indem Sie eine 5-0 nicht resorbierbare monofile Naht mit einer konischen Nadel verwenden.
   4. Erstellen Sie mit einer Mikroschere ein kleines Zystostoma in der Handtasche und bohren Sie ein Loch, bis der Urin herausfließt.
   5. Fassen Sie das runde Spitzenende des Katheters und führen Sie ihn durch das Loch. Sobald die Spitze des Schlauchs durch das Loch geführt wurde, nähen Sie den Geldbeutelfaden um den Schlauch. Ziehe dann den Schlauch vorsichtig nach außen, bis die Spitze unter der Naht zu spüren ist.
   6. Ziehen Sie langsam 1 ml Kochsalzlösung aus dem anderen Ende des Röhrchens auf, um die Blase zu dehnen. Überprüfen Sie, ob der Katheter undicht ist. Wenn eine Leckage vorhanden ist, legen Sie eine zusätzliche Naht.
   7. Sobald die Kochsalzlösung aus der Harnröhre austritt, ziehen Sie die Kochsalzlösung zurück, um die Blase zu dekomprimieren.
2. Implantation von EUS-Elektroden (Abbildung 1)
   1. Verlängern Sie den Bauchschnitt mit einer chirurgischen Schere bis zum Beckenboden.
   2. Bewegen Sie in einer Linie mit der Blase die Muskeln und Membranen zu den Pudenduskanälen und lokalisieren Sie die Harnröhre und den äußeren Schließmuskel. Achten Sie darauf, die Becken- und Mittelschwanzgefäße sowie die Pudendusnerven nicht zu verletzen.
   3. Die Haut beidseitig in einem Abstand von 1 cm vom Harnröhrengang mit der Nadel mit der Elektrode durchstechen.
   4. Fassen Sie die Hakenspitze vorsichtig mit einer Pinzette und ziehen Sie die Nadel vorsichtig von der Haut weg.
   5. Haken Sie den EUS-Muskel vorsichtig mit der Elektrodenspitze beidseitig ein. Vermeiden Sie zu tiefe Schläge, da dies den Muskel schädigen kann, was zu möglichem Urinverlust führen kann.
   6. Verwenden Sie das nicht resorbierbare Monofilament 3-0, um die Becken- und Bauchmuskulatur sowie die Haut zu nähen.
3. Imprägnierung der Haut
   1. Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf die Haut auf, wo die Elektroden austreten, um die Elektroden an Ort und Stelle zu fixieren.
   2. Tragen Sie den Cyanacrylatkleber 1 cm entfernt um den Harnröhrengang herum und 3 cm weiter bis zum Bauch und der vernähten Region auf. Um einen Kontakt mit dem Kleber zu vermeiden, halten Sie den Meatus vorsichtig mit einer Pinzette hoch.
   3. Verwenden Sie eine 0,5-10 μl Mikropipette, um die Beschleunigerflüssigkeit zum Trocknen des Klebers zu entnehmen.
      ACHTUNG: Beschleunigerflüssigkeit ist eine brennbare Flüssigkeit.
   4. Fügen Sie die Beschleunigerflüssigkeit hinzu, um eine ordnungsgemäße Klebstoffreaktion zu gewährleisten. Dies hilft, den Kleber schneller zu trocknen und sorgt dafür, dass er sicher aushärtet.
4. Urodynamische Aufbereitung
   1. Bereiten Sie ein umgekehrtes Styropor-Wägeschiffchen mit einer Länge von 4,5 cm in der Länge, Breite und Tiefe vor. Schneiden Sie es in eine Dreiecksform mit einer Basis von 4 cm, um den Harnröhrengang der Maus in diesen Raum zu setzen. Legen Sie die Einweg-Basisform, 37 mm x 24 mm x 5 mm, unter den Platz zum Auffangen des Urins.
   2. Positionieren Sie die Maus wieder in Bauchlage und bewegen Sie sie vorsichtig auf eine speziell angefertigte Platte, die mit einer Gasmaske ausgestattet ist.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Harnröhrengang richtig in der Rille positioniert ist. Halten Sie den Kopf und die Gliedmaßen der Maus vorsichtig mit Klebeband fest und legen Sie die Platte auf ein Heizkissen, bis die Maus wieder bei vollem Bewusstsein ist (Abbildung 2).
   4. Führen Sie die Zystometrie nur durch, wenn die Maus vollständig wach ist, d. h. mindestens 40 Minuten nach der Genesung von der Narkose.

7. Vorbereitung der Zystometrie und der EUS-EMG-Aufzeichnung

1. Richten Sie die Infusionspumpe gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie sie.
2. Nehmen Sie eine 20-ml-Spritze mit einem Durchmesser von 19,05 mm und füllen Sie sie bei Raumtemperatur mit sterilem 0,9 % NaCl. Befestigen Sie die Spritze an der Infusionspumpe. Stellen Sie die Infusionsgeschwindigkeit auf 0,01 ml/min ein.
3. Verbinden Sie die Spritze mit dem PE-30-Schlauch mit einer Seite des Dreiwegeanschlusses. Verbinden Sie den Blasenkatheter auf der anderen Seite mit einem Druckaufnehmer. Stellen Sie vor dem Anschließen des Blasenkatheters sicher, dass Sie alle Luftblasen entfernen.
4. Befestigen Sie den Druckmessumformer auf gleicher Höhe wie die Mausblase. Der Druckmessumformer wird über einen Verstärker mit dem Datenerfassungssystem verbunden.
5. Befestigen Sie einen Erdungshaken an der Haut und den anderen an den Elektrodenanschlüssen. Erfassen Sie den Druck in der Software.
6. Überprüfen Sie nach dem Start der Software den intravesikalen Druck (IVP) und die EUS-EMG-Signale. Speichern Sie den Namen des Beispiels, und legen Sie die Uhrzeit fest.
7. Starten Sie die Pumpeninfusion. Nehmen Sie die Signale auf.

Ergebnisse

Zur Analyse der Daten wurden Zystometrie und EUS-EMG-Aktivitätsverfolgungen verwendet. Bei der kontinuierlichen Zystometrie wird Kochsalzlösung in die Blase injiziert und gleichzeitig der Druck und die Volumenänderungen in der Blase gemessen. Zur Messung der VV wurden 0,4 ml Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,01 ml/min infundiert, und der Urin wurde über 40 Minuten in einer Kappe gesammelt. Das Post-Void-Residuum (PVR) kann durch Aspirieren der Kochsalzlösung durch den Katheter erhalten werden. Bei norm...

Diskussion

Diese urodynamische Technik beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Messung des Urinvolumens und des EUS-EMG-Signals bei wachen und fixierten Mäusen. Das Vorhandensein von Fell um den Harnröhrengang und den Bauchbereich kann die Genauigkeit der VV-Messung beeinträchtigen, indem Urin absorbiert wird. Obwohl das Fell, das den Harnröhrengang und den Bauch umgibt, vor der Operation sorgfältig rasiert worden war, nahmen die verbleibenden kleinen Felle in diesen Bereichen und der Haut immer noch Urin auf, so dass nach d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accelerator	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
Cyanoacrylate	TED PELLA, Inc	14478
Disposable base mold	TED PELLA, Inc	27147-4
Infusion pump	Harvard Apparatus PHD ULTRA	70-3006
Isoflurane	Henry Schein Inc	1182097
PIN	World Precision Instruments	5482
Polyethylene Tubing 30	Braintree Scientific Inc	PE30
Sterile Weighing Boat	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite	DATAQ INSTRUMENTS	249022