JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים שיטה למודל פתוגנזה פטרייתית המשמרת את המיקום הטבעי של נבגי פטריות בדרכי הנשימה של הריאות לניתוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Abstract

פטריות מדביקות בני אדם כאשר נבגים סביבתיים נשאפים לריאות. הריאה היא איבר הטרוגני. דרכי הנשימה המוליכות, כולל הסמפונות והסימפונות, מסתעפות עד לסיומם במרחב האווירי המכתשית שבה מתרחשים חילופי גזים. זיהומים שמקורם בסימפונות או בנאדיות מעוררים תגובות מארח מובהקות וביטויי מחלה. לכן, הבנה מדויקת היכן נבגים מתמקמים באופן טבעי בריאות, במיוחד זמן קצר לאחר ההדבקה, מרחיבה את ההזדמנויות לחקירה של אינטראקציות מארח-פתוגן. כאן, אנו מפרטים ניתוח באתרו של ריאות מעכברים הנגועים ב-Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. שיטות קונבנציונליות לשימור היסטולוגי כוללות ניפוח נוזלי של דרכי הנשימה עם תמיסה מקבעת, אשר מעבירה את המיקום הטבעי של חלקיקי פטרייה נשאבים, ודוחפת נבגים מהסימפונות הפרוקסימליים למרחבי האוויר הסופיים.

לעומת זאת, שיטה זו של ניפוח אוויר עם קיבוע זלוף כלי דם משמרת את המיקום הפיזיולוגי של נבגי פטריות בתוך הסימפונות. יתר על כן, אנו מתארים גישה פשוטה לשימור בהקפאה, הטמעה והדמיה של דגימות ריאה. אנו גם חולקים טכניקות חישוביות בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תוכנת הקוד הפתוח QuPath כדי לנתח את ההתפלגות המרחבית של נבגי פטריות בתוך הריאה. השיטה המוצגת כאן היא פשוטה ומהירה, דורשת ציוד מינימלי לביצוע, וניתן להתאים אותה בקלות לשימוש עם מודלים רבים של זיהום פטרייתי בדרכי הנשימה.

Introduction

בני אדם יכולים לשאוף עד מיליארדי נבגים ביום ממגוון פטריות סביבתיות1. כדי להבין את הגנות המחסום שלנו כנגד הנבגים הנשאפים האלה, עלינו להעריך את הסביבות המיקרואנטומיות המדויקות שבהן הנבגים האלה נוחתים בתוך דרכי הנשימה ופרנכימת הריאות. ההרכב התאי של דרכי הנשימה (כלומר, תאי אפיתל) משתנה באופן משמעותי לאורך קנה הנשימה, הסמפונות, הסימפונות והנאדיות. כל אחד מהאזורים השונים הללו מורכב מסוגי תאים שונים עם פונקציות נפרדות המועילות לארסנל של הגנות למניעת זיהום פתולוגי.

המיקום המדויק של שקיעת נבגים פטרייתית ריאתית יכול להשתנות בין לומן דרכי הנשימה של סימפונות מרופדים באפיתל עמודים, צינורות מכתשית או נאדיות2. רוב מיני הפטריות הרלוונטיים מבחינה קלינית מייצרים נבגים בקוטרשל 1 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר. שקיעת חלקיקי הנבגים הללו בריאה תלויה במספר גורמים, כגון אווירודינמיקה, צפיפות, מטען חשמלי וכוחות פורטיים, שיכולים להשפיע על מנגנון המשקע לאחר שאיפה4. בדרך כלל, חלקיקים גדולים (> 6 מיקרומטר) משקעים בדרכי הנשימה העליונות, חלקיקים בגודל בינוני (2-6 מיקרומטר) יכולים לשקע בדרכי הנשימה הקטנות יותר, וחלקיקים קטנים (<2 מיקרומטר) מגיעים לאזור המכתשית5. נבגי אספרגילוס (2-3 מיקרומטר) דווחו כמגיעים לחללים המכתשית, אך דיווחים פתולוגיים קליניים מצביעים גם על עומס משמעותי של מחלת הסימפונותוהסימפונות 6. יש גם הכרה הולכת וגוברת בזיהומים פטרייתיים אנדוברונכיאליים של Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, מיני קנדידה, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum ו-Zygomycetes בשל הפופולריות הגוברת של ברונכוסקופיה גמישה7. ההתקדמות האחרונה בהדמיה מיקרוסקופית של זיהומי אספרגילוס בעכברים גילתה גם כי מרחבי אוויר פרוקסימליים יותר כגון סמפונות וסימפונות עשויים לשאת בנטל הגבוה ביותר לשגשוג פטרייתי פתולוגי8. מחקר על תגובת המארח לזיהומים פטרייתיים ריאתיים הראה כי גם תאי אפיתל ברונכיולר וגם תאי אפיתל מכתשית ממלאים תפקידים חשובים כזקיפים חיסוניים, כך שהבהרת האתרים המדויקים של שקיעת נבגים ואינטראקציה אפיתל תהיה חיונית לעבודה עתידית 2,9,10.

חקר הדינמיקה של פתוגנזה של דרכי הנשימה הפרוקסימליות הללו קשה מכיוון שטכניקות סטנדרטיות של קיבוע ריאות והכנת חתכים יכולות לעקור נבגים מהמיקומים הפרוקסימליים הללו בדרכי הנשימה המרופדות באפיתל ולדחוף אותם לעבר אזורי המכתשית הסופית הדיסטלית. בדרך כלל, 10% פורמלין או 4% פרפורמלדהיד משמשים לניפוח הריאות ולחשיפה מהירה של הריאה כולה לקיבוע. בעת הכנת ריאות להקפאה, קבוצות מסוימות נותנות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לתוך הריאות כדי לשפר את ביצועי ההקפאה11. שיטות אלה שימושיות בהקשר הנכון אך נמצאו על ידי המעבדה שלנו וקבוצות אחרות כעוקפות נבגים וחלקיקים ממיקומים פרוקסימליים, ובכך מפריעות לפרשנויות לגבי סוגי התאים החשופים לנבגים ותגובת המארח שלאחר מכן12.

כדי לבסס במדויק את הלוקליזציה המיקרו-אנטומית של נבגי פטריות בשאיפה, פיתחנו שיטה מהירה ודלת משאבים לשימור המיקום של נבגי פטריות בדרכי הנשימה של עכברים. אימצנו שיטת קיבוע זלוף כלי דם של ניפוח אוויר בעכברים מ-Thomas et al. (2021), שם הפחתנו את כמות הציוד, הזמן והמיומנות הטכנית הנדרשים להשגת תוצאה משביעת רצון13. מהשיטה המתוארת כאן, ראינו כי Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia (בגודל 3-5 מיקרומטר) מצטבר בצורה קרובה יותר ממה שהוצג בעבר, כלומר בסימפונות דיסטליות וצמתים ברונכו-מכתשית ולא בנאדיות סופניות. מידע זה יכול למקד שאלות ביולוגיות הנוגעות לסוגי התאים הקריטיים הקשורים לאזורים אלה של הריאה והשפעתם על התגובות המוקדמות לנבגי פטרייה בשאיפה.

Protocol

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מדעי הבריאות הביו-רפואית של ראטגרס.

1. סמן נבגים עם פלואורסצנטיות תוך תאית

  1. כתם 1 x 106 נבגים ב-carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), Cell Tracker Orange, או Cell Tracker Red (או צבע תוך-תאי לבחירה) ב-5 מיקרומטר למשך 30 דקות ב-30 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו עם PBS, וסובבו את הנבגים ב-12,000 x גרם. חזור על שטיפה זו פעם אחת.
  2. הכן את חיסון הנבגים בריכוז המתאים כך ש-25 מיקרוליטר יכיל את מינון הנבגים המתאים לעכבר אחד.

2. חיסון עכבר בנבגים באמצעות שאיפת שאיפה באמצעות הרדמה איזופלורן

זהירות: איזופלורן הוא חומר הרדמה נדיף ויש להשתמש בו בתוך ארון בטיחות ביולוגית או קולט אדים.

  1. להכנת צנצנת החשיפה לאיזופלורן, הניחו מפית מקופלת בצנצנת Nalgene עם הברגה של 1 ליטר והניחו עיגול רשת פלסטיק מעל המפית כפלטפורמה לעכברים. הוסף למפית 2 מ"ל איזופלורן, סגור את הצנצנת והמתן 1-2 דקות עד שהגז יתאזן במיכל.

figure-protocol-1208
איור 1: מכשיר לשיטת טיפה פתוחה איזופלורן לחיסון נבגים. מפית מקופלת מונחת בתחתית צנצנת בורג עליונה בנפח 1 ליטר, ואז מוכנסת רשת פלסטיק עגולה שתשמש כפלטפורמה לעכברים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. לפני חשיפת העכבר להרדמה, הכינו פיפט עם 25 מיקרוליטר של החיסון. הנח את העכבר במיכל האיזופלורן והטה את המיכל כדי לפקח על אובדן רפלקס היישור, שבו העכבר איבד את הכרתו והוא הפוך. זה בדרך כלל לוקח בערך 10 שניות.
  2. עקוב אחר קצב הנשימה (RR) עד שהוא מאט ל-50-80 נשימות לדקה (bpm), כ-50% מה-RR במנוחה. זה בדרך כלל לוקח עוד 10 שניות. בשלב זה, הסר את העכבר מצנצנת האיזופלורן.
    הערה: זהו ריכוז גבוה של איזופלורן, שייצר אינדוקציה מהירה של הרדמה, ויש לעקוב מקרוב אחר העכבר. מנת יתר קטלנית של איזופלורן מהווה סיכון, מכיוון שריכוז האיזופלורן יכול להיות משתנה, ועקומת המינון-תגובה לאיזופלורן תלולה מאוד. אם קצב הנשימה יורד מתחת ל-50 פעימות לדקה ו/או אינו סדיר, הסר את העכבר מאיזופלורן, אפשר לו להתאושש למשך 3-5 דקות ונסה שוב (מקסימום שני ניסיונות חוזרים).
  3. אשר את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן. לאחר מכן, מקם את העכבר במצב שכיבה ביד אחת, ואפשר לעכבר לקחת 3-5 נשימות מתנשמות רגילות בקצב הולך וגובר (החל מ-50-60 פעימות לדקה) ומרץ. כשזה מתחיל, הנח את קצה הפיפט בחלק האחורי של האורופרינקס של העכבר ושחרר את החיסון במהלך שאיפה.
    הערה: התנשפויות אלה דרך הפה מטלטלות את הראש בצורה נחותה עקב גיוס שרירי עזר לנשימה. כאשר מחדירים את הפיפט במהלך ההתנשפויות הללו, הפה צריך להיפתח עם כל התנשמות. אם הפה לא נפתח, העכבר אינו מורדם מספיק וסביר להניח שלא ישאף תוכן מהלוע. הפיפט צריך ללחוץ על הלשון, לדחוף אותה לכיוון החלק התחתון והקדמי של הפה כדי למנוע בליעה של החיסון. כאשר הפיפט נמצא בפה והעכבר מורדם כראוי, העכבר יפתח את פיו בכל התנשמות.
  4. כשהיד והאגודל מחזיקים את העכבר, יש לחוש פצפוצים בהיבטים האחוריים והקדמיים של בית החזה של העכבר כדי לאשר שאיפת החיסון.

3. המתת חסד של עכברים

  1. הזריק לעכבר תוך הצפק קוקטייל של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו-24 מ"ג/ק"ג קסילזין 10 דקות לפני נקודת הזמן של ההקרבה.
  2. המתן 10 דקות לאחר ההזרקה עד שהעכבר נכנס למישור כירורגי של הרדמה, שאושר על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.

4. זלוף ריאות עם PBS ופורמלין

  1. רססו את העכבר המורדם ב-70% אתנול. השתמש במספריים כדי לחתוך לאחור את עור העכבר ולפרק את העור כדי לחשוף את הצפק מכל הצדדים. משוך את העור מהחצי העליון של העכבר מעל ראשו, ומשוך החוצה את הזרועות מהעור.
  2. חותכים את קרום הצפק בעצם החזה ולאורך ההיבט התחתון של כלוב הצלעות, וחושפים את הצפק. לעקור את הכבד בצורה נחותה, לחשוף את הסרעפת. השתמש במספריים כדי לנקב בזהירות את הסרעפת הרחק מפרנכימת הריאות כדי למנוע ניקוב חור בריאות עצמן.
    הערה: ניקוב לא מכוון של הריאות יהפוך את ניפוח האוויר הבא לבלתי אפשרי.
  3. לאחר ניקוב הסרעפת, אוויר נכנס לבית החזה וממוטט את הריאות. חותכים את כלוב הצלעות בצד שמאל כדי לחשוף את הלב. הזרקו 5-10 מ"ל PBS לחדר הימני עם מחט 30 גרם בקצב של 1 מ"ל ל-5 שניות (כדי למנוע נזק לכלי הדם), תוך הלבנה מהירה של הריאות.
    זהירות: פורמלין הוא חומר נדיף מסוכן שיש לטפל בו בתוך ארון בטיחות ביולוגית או קולט אדים.
  4. בסיום, הסר את המחט והשתמש במחט חדשה כדי להזריק 5 מ"ל של 10% פורמלין ניטרלי (NBF) לחדר הימני באותו קצב.

5. ניפוח אוויר של הריאה המנופחת

  1. הסר את החצי הקדמי של כלוב הצלעות. כדי לחשוף את קנה הנשימה, חותכים את הצלעות העליונות ועצמות הבריח מימין ומשמאל לצוואר. הקפד להימנע מחיתוך ליד קו האמצע שבו קנה הנשימה ישכב. בעזרת מלקחיים, הצמידו את הצלעות העליונות ועצמות הבריח הנותרות בקו האמצע של הצוואר ומשכו ביתר שאת עד שקנה הנשימה נחשף.
  2. הכינו חוט תפר באורך 10 ס"מ, משכו אותו מתחת לקנה הנשימה וקשרו מראש קשר רופף בקצה התחתון של קנה הנשימה החשוף. הכן מזרק אוויר של 1 מ"ל עם קטטר 18 גרם. השתמש במחט 18 גרם כדי ליצור חור בקנה הנשימה בקצה העליון של האזור החשוף.
  3. הכנס את הקטטר לתוך החור הזה, והבטח התאמה הדוקה יחסית כדי למנוע בריחת אוויר. הזריק לאט את 1 מ"ל האוויר לריאות במהלך 10 שניות, תוך שמירה על ניפוח הריאות של כל האונות. ניפוח מלא מביא לכך שהריאות עוטפות מעט את הלב וממלאות את הנפח שהן תופסות בסרעפת הלא מנוקבת.
  4. משוך את הקשר בחוזקה סביב קנה הנשימה והסר את הקטטר. החזק את קנה הנשימה והשתמש במספריים קהים כדי להסיר את הריאות מהעכבר, והיזהר לא לנקב את הריאה.

6. קיבוע טבילה והתייבשות

  1. הנח את הריאות על הקצה העליון של צינור חרוטי של 50 מ"ל מלא ב-20 מ"ל של 10% NBF. שמור את חוטי התפר מחוץ לחרוט, הברג את המכסה והפוך את החרוט כך שהריאות תלויות הפוכות ב-20 מ"ל של NBF. הניחו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות.
  2. שטפו את הריאות ב-PBS, ולאחר מכן הניחו בתמיסת 30% סוכרוז-PBS (w/v) למשך 72-96 שעות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לייבש את הריאות כהכנה לשימור בהקפאה. הסר את הריאות מסוכרוז, הנח את הריאות בקריומולד עם מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), והקפיא את הדגימה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

7. הקפאה

  1. אזנו את הדגימות בקריובלוקים של OCT לטמפרטורת -20 מעלות צלזיוס של הקריוסטט למשך שעה אחת לפני החיתוך. חותכים את הבלוקים בעובי של 20-100 מיקרומטר.
    הערה: ניפוח אוויר עלול להוביל לשבריריות מוגברת של הדגימה, וחיתוך בעובי מוגבר יכול למנוע שבירת רקמות במהלך החיתוך.
  2. אסוף חלקים על שקופיות זכוכית והניח להתייבש במשך 30 דקות עד שעה כדי להבטיח היצמדות רקמות למגלשה.
    הערה: ניתן להחזיק מגלשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בשלב זה.

8. הכנת שקופיות וחסימה

  1. הניחו את השקופיות באמבט PBS (בצלחת או בצנצנת קופלין) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר OCT מהשקופיות.
    הערה: חלקים עבים יותר (40-100 מיקרומטר) עשויים שלא להיצמד למגלשות זכוכית כמו גם לחלקים דקים יותר, ולכן עדיף לשמור אותם שטוחים וזקופים בצלחת ולא להניח על צידם בצנצנת קופלין.
  2. יבש את השקופיות לאחר ש-OCT התמוסס הרחק מהרקמה. השתמש במגבון כדי לייבש טיפות עודפות מהיקף המגלשה סביב דגימת הרקמה.
  3. השתמש בעט פאפ הידרופובי כדי לצייר היקף סביב הדגימה, ותן לה להתייבש במשך 5 דקות.
  4. הכן מאגר חסימה של תמיסת חסימה ללא בעלי חיים עם 0.3% Tween-20 ו-1:100 Fc Block ב-300 מ"ל לכל מגלשה.
    הערה: עבור מטרות תוך-תאיות, ניתן להשתמש ב-1% Tween-20. נפח של 300 מיקרוליטר מספיק בדרך כלל, אך הנפח הדרוש לכיסוי הרקמה תלוי לחלוטין בגודל ההיקף של הסמן ההידרופובי. הרקמה לא צריכה להתייבש מנקודה זו ואילך.
  5. השאירו את פתרון החסימה על השקופיות למשך שעה אחת ב-RT.

9. צביעה חיסונית

  1. שטפו את השקופית על ידי הוצאת הנוזל והוספת 300-500 מיקרוליטר PBS. חזור על הכביסה פעם אחת.
  2. הכן נוגדן EpCAM מצומד נגד עכברים של AlexaFluor-647 (שיבוט G8.8) (סמן אפיתל של דרכי הנשימה) בתמיסת חוסם ללא בעלי חיים עם 0.33% Tween-20 (או 1% למטרות תוך-תאיות). הוסף 300 מיקרוליטר לכל שקופית של תמיסה זו והכתים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש לבדוק נוגדנים באופן אמפירי לריכוז הצביעה, הזמן והטמפרטורה. חלקים דקים (8-20 מיקרומטר) מוכתמים במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס וחלקים עבים יותר (20-100 מיקרומטר) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה באמצעות דילול של 1:100 עבור רוב הנוגדנים. אם משתמשים בנוגדנים לא מצומדים, יש לשטוף פעמיים (כנ"ל) ולמרוח נוגדן פלואורסצנטי משני לזמן וטמפרטורה שנקבעו אמפירית. בדרך כלל, צביעת נוגדנים משנית נעשית ב-RT למשך שעה אחת בדילול של 1:1000.
  3. הסר את תמיסת הנוגדנים מהדגימה, ושטוף את השקופית עם 300 מ"ל PBS למשך 5 דקות. חזור על שטיפה זו פעם אחת. יבש את השקופיות, הסר את כל עודפי הנוזלים מהדגימה ומהזכוכית שמסביב.
  4. הוסף טיפה אחת של מדיית הרכבה רכה RT (למשל, SlowFade Glass) לכל פיסת רקמה. הקפידו להימנע מבועות על ידי מתן הבקבוק לשקוע כשהוא הפוך והטלה איטית של כל טיפה על הממחטה. הנח פתק כיסוי בגודל מתאים כדי להרחיב מעבר להיקף הדגימה והסמן ההידרופובי.

10. הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

  1. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-ערוצי כדי לסרוק קטעי ריאה שלמים בצורה לא מוטה באמצעות מטרה עם רזולוציה מספקת כדי לפתור נבגים בודדים ותאים מארחים (למשל, Zeiss Axioscan 7 באמצעות אובייקט שמן פי 20 עם NA = 0.8 או דומה).
    הערה: ודא שעוצמת הלייזר ו-PMTTAGהגבר מוגדרים כדי למקסם את יחסי האות לרעש של המטרה על פני הרקע שנקבעו עם בקרת פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO).
  2. אסוף מספיק אריחי תמונה כדי ללכוד את כל אונת הריאה (למשל, ~200 אריחים בגודל 400 מיקרומטר x 400 מיקרומטר). השתמש בתוכנת המיקרוסקופ (למשל, Zeiss ZEN 3.7 או דומה) כדי לייצא את תמונת האריח הממוזגת לעיבוד במורד הזרם.

11. ניתוח מרחבי באמצעות QuPath

  1. ב-QuPath, תוכנת קוד פתוחחינמית 14, צרו קובץ פרויקט והוסיפו את התמונות הפלואורסצנטיות לקובץ.
  2. סווג את הפיקסלים של EpCAM+ כאפיתל על ידי לחיצה על אפשרות התפריט העליון סיווג, ולאחר מכן סיווג פיקסלים > צור סף. בחר את הרזולוציה, הערוץ, סיגמת ההחלקה וערך הסף המזהה בצורה הטובה ביותר את אזור היעד. שמור את המסווג תחת שם ייחודי ובחר צור אובייקטים.
  3. בחלון החדש יצירת אובייקטים , בחר סוג אובייקט חדש כביאור. עבור אפיתל הריאות, הגדר את גודל האובייקט המינימלי ואת גודל החור המינימלי ל-100 מ"מ2. אין צורך לבחור באפשרות Split Objects כאן. לאחר בחירת OK, ייווצרו הביאורים, וניתן לשנות אותם באמצעות העין באמצעות הכלי Brush באזור השמאלי העליון.
  4. כדי לסווג נבגים, חזור על השלבים מ-11.3-11.4 באמצעות הערוץ שבו נלכדו הנבגים והפוך את סוג האובייקט החדש לזיהוי במקום ביאור. הגדר גודל אובייקט מינימלי וגודל חור מינימלי ל- 0 מ"מ2, ובחר Split Objects.
  5. כדי לבצע ניתוח מרחבי של הנבגים, בחר באפשרות התפריט העליון ניתוח מרחבי > > חשב מרחק חתום לביאורים דו-ממדיים. המרחקים לאפיתל EpCAM+ יחושבו עבור כל נבג שזוהה. ייצא אותם דרך אפשרות התפריט העליון מדידה > ייצוא מדידות.

תוצאות

שיטה זו מייצרת בסופו של דבר תמונות אימונו-פלואורסצנטיות של ריאות עכברים תוך שימוש בניפוח אוויר פיזיולוגי כדי להשאיר את דרכי הנשימה ללא הפרעה. חשוב לציין, מספר נקודות ביקורת לאורך הדרך יאשרו שרכיבי הפרוטוקול בוצעו בהצלחה. במהלך החיסון, חשוב לוודא שהחיסון נשאף על ידי תחוש...

Discussion

הקמנו צינור לשאיפת נבגים וניתוח התצהיר המרחבי של הנבגים הנשאפים. צינור זה מספק מידע רב ערך לקביעת אזורי הסטרומה הרלוונטיים של הריאה המושפעים משאיפת Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. ראינו כי נבגי Coccidioides וחלקיקים אינרטיים בגודל דומה (נתונים לא מוצגים) מצטברים באז?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מימון ותמיכה נרכשו באמצעות מענק ה-NIH K22 AI153678-01 ובית הספר ללימודים מתקדמים של ראטגרס. אנו מודים לפואד יוסופזאי ולוק פריצקי מהמרכז להדמיה תאית והיסטולוגיה של מדעי הבריאות הביו-רפואית של ראטגרס על עבודתם ומומחיותם בהשגת תמונות אימונו-פלואורסצנטיות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
18 G, 1 1/2 needle (305185)Fisher305185
1 L  Screwtop Jar  (Nalgene)Fisher Scientific11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Syringes 10 mL Luer LockFisher14-817-175
AnaSed Injection (xylazine sterile solution)Akorn59399-110-20
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.VectorSP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Catheter with BD Vialon Catheter Material 18 G x 1.88 inBD381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)BD553142
CellTracker Orange CMRA DyeFisher ScientificNC0873640
CFSELabviva75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ BEI ResourcesNR-166
Corning 70 micron strainersVWR10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoclonal antibodyBiolegend118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"LabvivaEN3012
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (1mL, Leur Slip)Fisher14-955-462
Glucose MonohydrateAzer Scientific ES17530-500G
High Vacuum GreaseVWR59344-055
Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)ThermoFischer62249
Isoflurane USPCovetrus29405
Ketamine HydrochlorideDechra1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wipers (4.4'' x 8.4")VWR21905-026
Lexer Baby ScissorsFST14078-10
Micro-Adson ForcepsFST11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)Fisher22-026-350
Nunc EasYFlask tissue culture flasks, T75, filter capsVWR15708-134
PBSVWR45000-446
Peel-A-Way embedding moldsSigmaE6032-1CS
QuPath 0.5.1 SoftwareOpen-sourcehttps://qupath.github.io/
Silk Suture thread size 3/0FST18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus VWR48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)ThermoFischerS36917
SucroseSigmaS0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura FinetekVWR25608-930
Tween 20ThermoFischerJ20605.AP
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophobic Barrier Pen Set Of 2Fisher ScientificNC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangular (24 mm x 40 mm #1.5)VWR48393-230
White Plastic Wire MeshMAPORCH789862904922
Yeast ExtractFisherBP9727-500
Zeiss AxioScan 7 Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.htmlmultichannel fluorescent microscope
ZEN 3.7 SoftwareCarl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.htmlmicroscopy software

References

  1. American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. Report on an American Academy of Microbiology Colloquium. , (2019).
  2. Crossen, A. J., et al. Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity. J Fungi (Basel). 9 (1), 40 (2022).
  3. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).
  4. Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. . Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems. , (2020).
  5. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  6. Kradin, R. L., Mark, E. J. The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp. Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).
  7. Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity. Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).
  8. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).
  9. Wiesner, D. L., et al. Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation. Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).
  10. Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).
  11. Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice. J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).
  12. Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals. J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).
  13. Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. 168, e62215 (2021).
  14. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878 (2017).
  15. Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. 162, e60605 (2020).
  16. Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).
  17. Gil, J., Weibel, E. R. Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy. Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).
  18. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).
  19. Evans, C. M., et al. The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity. Nat Commun. 6, 6281 (2015).
  20. Galati, D. F., Asai, D. J. Immunofluorescence microscopy. Curr Protoc. 3 (8), e842 (2023).
  21. Hickey, S. M., et al. Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations. Cells. 11 (1), 35 (2021).
  22. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  23. Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. Mouse isoflurane anesthesia using the drop method. Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Coccidioides posadasiiQuPath

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved