Эффективный метод визуализации легких мышей, сохраняющий пространственную динамику грибковых спор в дыхательных путях

Резюме

Мы представляем метод модели патогенеза грибов, который сохраняет естественное расположение спор грибов в дыхательных путях легких для анализа с помощью флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

Грибки заражают человека при вдыхании спор окружающей среды в легкие. Легкое – неоднородный орган. Проводящие дыхательные пути, в том числе бронхи и бронхиолы, разветвляются до тех пор, пока не заканчиваются в альвеолярном воздушном пространстве, где происходит газообмен. Инфекции, возникающие в бронхиолах или альвеолах, вызывают различные реакции хозяина и проявления болезни. Таким образом, точное понимание того, где споры естественным образом локализуются в легких, особенно вскоре после заражения, расширяет возможности для исследования взаимодействий хозяина и патогена. В данной работе мы подробно описываем анализ in situ легких мышей, инфицированных Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Традиционные методы гистологической консервации включают жидкостное надувание дыхательных путей с помощью фиксирующего раствора, который смещает естественное расположение аспирированных грибковых частиц, выталкивая споры из проксимальных бронхиол в терминальные воздушные пространства.

И наоборот, этот метод надувания воздуха с помощью перфузионной фиксации кровеносной сосудистой сети сохраняет физиологическое положение спор грибов в бронхиолах. Кроме того, мы описываем простой подход к криоконсервации, встраиванию и визуализации образцов легких. Мы также делимся высокопроизводительными вычислительными методами с помощью программы QuPath с открытым исходным кодом для анализа пространственного распределения спор грибов в легких. Представленный здесь метод прост и быстр, требует минимального оборудования для выполнения и может быть легко адаптирован для использования со многими моделями респираторных грибковых инфекций.

Введение

Человек может вдыхать до миллиардов спор в день из различных грибов окружающей^среды. Чтобы понять нашу барьерную защиту от этих вдыхаемых спор, мы должны оценить точную микроанатомическую среду, в которой эти споры попадают в дыхательные пути и паренхиму легких. Клеточный состав дыхательных путей (т.е. эпителиальных клеток) значительно трансформируется по ходу трахеи, бронхов, бронхиол и альвеол. Каждая из этих отдельных областей состоит из различных типов клеток с дискретными функциями, что позволяет использовать арсенал защитных механизмов для предотвращения патологической инфекции.

Точное местоположение отложения спор легочных грибков может варьироваться между просветами дыхательных путей колоннарных бронхиол, выстланных эпителием, альвеолярными протоками или альвеолами². Большинство клинически значимых видов грибов производят споры диаметром от 1 до 10 мкм³. Отложение этих частиц спор в легких зависит от нескольких факторов, таких как аэродинамика, плотность, электрический заряд и форетические силы, которые могут влиять на механизм осаждения после вдыхания⁴. Как правило, крупные частицы (> 6 мкм) осаждаются в верхних дыхательных путях, частицы среднего размера (2-6 мкм) могут откладываться в более мелких дыхательных путях, а мелкие частицы (<2 мкм) достигают альвеолярной области⁵. Сообщалось, что споры аспергилл (2-3 мкм) достигают альвеолярных пространств, но клинические патологоанатомические отчеты также указывают на значительное бремя бронхиальной и бронхиолярной болезни⁶. В связи с растущей популярностью гибкой^{бронхоскопии} также растет признание эндобронхиальных грибковых инфекций Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, видов Candida, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum и Zygomycetes. Недавние достижения в области микроскопической визуализации инфекций, вызванных аспергиллами, у мышей также показали, что более проксимальные воздушные пространства, такие как бронхи и бронхиолы^{, могут} нести наибольшую нагрузку для патологической грибковой пролиферации8. Исследования реакции хозяина на легочные грибковые инфекции показали, что как бронхиолярные эпителиальные клетки, так и альвеолярные эпителиальные клетки играют важную роль в качестве иммунных стражей, поэтому выяснение точных мест отложения спор и взаимодействия эпителия будет иметь жизненно важное значение для будущей работы ^2,9,10.

Изучение динамики патогенеза проксимальных дыхательных путей затруднено, поскольку стандартные методы фиксации легких и подготовки к разрезам могут вытеснить споры из этих проксимальных положений в эпителиально выстланных дыхательных путях и вытолкнуть их к дистальным терминальным альвеолярным областям. Как правило, 10% формалина или 4% параформальдегида используется для раздувания легких и быстрого воздействия на все легкое фиксатора. При подготовке легких к криосекции некоторые группы вводят в легкие соединение оптимальной температуры резания (ОКТ) для улучшения производительности криосекции¹¹. Эти методы полезны в правильном контексте, но было обнаружено, что наша лаборатория и другие группы вытесняют споры и частицы из проксимальных мест, тем самым мешая интерпретации типов клеток, подвергшихся воздействию спор, и^{последующей реакции} хозяина.

Для точного установления микроанатомической локализации вдыхаемых спор грибов нами разработан быстрый, малоресурсный метод сохранения локализации спор грибов в дыхательных путях мышей. Мы адаптировали метод фиксации сосудистой перфузии с надуванием воздуха у мышей от Thomas et al. (2021), в котором мы сократили количество оборудования, времени и технических навыков, необходимых для достижения удовлетворительного результата¹³. С помощью описанного здесь метода мы обнаружили, что артроконидии Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (размером 3-5 мкм) накапливаются проксимальнее, чем было показано ранее, а именно в дистальных бронхиолах и бронхо-альвеолярных соединениях, а не в терминальных альвеолах. Эта информация может сфокусировать биологические вопросы, касающиеся критических типов клеток, связанных с этими областями легких, и их влияния на раннюю реакцию на вдыхаемые грибковые споры.

протокол

Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Маркировка спор внутриклеточной флуоресценцией

1. Окрасьте 1 x 10⁶ спор в карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE), Cell Tracker Orange или Cell Tracker Red (или внутриклеточный краситель по выбору) при 5 мкМ в течение 30 минут при 30 °C, затем промойте PBS и открутите споры при 12 000 x g. Повторите эту промывку один раз.
2. Приготовьте споровый инокулюм в соответствующей концентрации так, чтобы 25 мкл содержал подходящую дозу спор для одной мыши.

2. Инокуляция мыши спорами путем аспирационной ингаляции с использованием изофлурановой анестезии

ВНИМАНИЕ: Изофлуран является летучим анестетиком и должен использоваться в канальном шкафу биобезопасности или вытяжном шкафу.

1. Чтобы приготовить банку для воздействия изофлурана, положите сложенную салфетку в банку Nalgene объемом 1 л с завинчивающейся крышкой и поместите на салфетку круг из пластиковой сетки в качестве платформы для мышей. Добавьте в салфетку 2 мл изофлурана, закройте банку и подождите 1-2 минуты, пока газ уравновесится в емкости.

Рисунок 1: Аппарат для изофлурана методом открытой капли посева спор. На дно банки объемом 1 л с завинчивающейся крышкой кладут сложенную салфетку, а затем вставляют круглую пластиковую сетку, которая служит платформой для мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Перед тем, как подвергнуть мышь анестезии, приготовьте пипетку с 25 мкл инокулюма. Поместите мышь в контейнер с изофлураном и наклоните контейнер, чтобы следить за потерей рефлекса выпрямления, когда мышь потеряла сознание и находится вверх ногами. Обычно это занимает около 10 секунд.
3. Контролируйте частоту дыхания (ОР) до тех пор, пока она не замедлится до стабильных 50-80 вдохов в минуту (уд/мин), что составляет около 50% ОР в состоянии покоя. Обычно на это уходит еще 10 секунд. В это время выньте мышку из баночки с изофлураном.
   Примечание: Это высокая концентрация изофлурана, которая приведет к быстрой индукции анестезии, и за мышью необходимо очень внимательно следить. Смертельная передозировка изофлурана представляет собой риск, так как концентрация изофлурана может быть вариабельной, а кривая «доза-реакция» на изофлуран очень крутая. Если частота дыхания падает ниже 50 уд/мин и/или нерегулярна, извлеките мышь из изофлурана, дайте ей восстановиться в течение 3-5 минут и повторите попытку (максимум две повторные попытки).
4. Подтвердите глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги. Затем расположите мышь в положении лежа на спине в одной руке и позвольте ей сделать 3-5 регулярных задыхающихся вдохов с возрастающей частотой (начиная с 50-60 ударов в минуту) и энергичностью. Как только это начнется, поместите кончик пипетки в заднюю часть ротоглотки мыши и выпустите инокулюм во время ингаляции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти вздохи через рот встряхивают голову вниз из-за задействования вспомогательных мышц для дыхания. Когда пипетка вводится во время этих вздохов, рот должен открываться с каждым вздохом. Если рот не открывается, мышь недостаточно обезболечена и, скорее всего, не будет вдыхать содержимое ротоглотки. Пипетка должна надавливать на язык, проталкивая его ко дну и передней части рта, чтобы предотвратить проглатывание инокулюма. Когда пипетка находится во рту и мышь адекватно обезболивается, мышь будет открывать рот при каждом вздохе.
5. Держа мышь рукой и большим пальцем, нащупайте хрипы на задней и передней частях грудной клетки мыши, чтобы подтвердить вдыхание инокулюма.

3. Эвтаназия мышей

1. Введите мышке внутрибрюшинно коктейль из 200 мг/кг кетамина и 24 мг/кг ксилазина за 10 минут до момента жертвоприношения.
2. Подождите 10 минут после инъекции, пока мышь не войдет в операционную плоскость анестезии, что подтверждается отсутствием реакции на защемление пальца ноги.

4. Перфузия легких с ПБС и формалином

1. Опрыскайте мышь под наркозом 70% этанола. С помощью ножниц отрежьте кожу мыши и раздвиньте кожу, чтобы обнажить брюшину со всех сторон. Натяните кожу с верхней половины мыши над головой, вытягивая руки из кожи.
2. Разрежьте перитонеальную оболочку у грудины и вдоль нижней части грудной клетки, обнажив брюшину. Сместите печень вниз, обнажив диафрагму. С помощью ножниц осторожно проколите диафрагму в сторону от паренхимы легких, чтобы избежать прокола отверстия в самих легких.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Случайное прокол легких сделает последующее надувание воздуха невозможным.
3. После прокола диафрагмы воздух попадает в грудную клетку, разрушая легкие. Разрежьте грудную клетку с левой стороны, чтобы раскрыть сердце. Введите 5-10 мл PBS в правый желудочек с помощью иглы 30 G со скоростью 1 мл в 5 с (чтобы избежать повреждения сосудов), быстро отбеливая легкие.
   ВНИМАНИЕ: Формалин является опасным летучим веществом, с которым следует работать в канальном шкафу биобезопасности или вытяжном шкафу.
4. По окончании извлеките иглу и с помощью новой иглы введите 5 мл 10% нейтрально буферизованного формалина (НБФ) в правый желудочек с той же скоростью.

5. Надувание воздуха в перфузии легкого

1. Удалите переднюю половину грудной клетки. Чтобы обнажить трахею, разрежьте верхние ребра и ключицы справа и слева от шеи. Следите за тем, чтобы не разрезаться рядом с средней линией, где будет лежать трахея. С помощью щипцов обхватите оставшиеся верхние ребра и ключицы по средней линии шеи и тяните вверх, пока трахея не обнажится.
2. Подготовьте шовную нить длиной 10 см, протяните ее под трахеей, а на нижнем конце оголенной трахеи предварительно завяжите свободный узел. Приготовьте шприц объемом 1 мл воздуха с катетером 18 G. С помощью иглы 18 G проделайте отверстие в трахее на верхнем конце обнаженной области.
3. Поместите катетер в это отверстие, обеспечив относительно плотное прилегание и предотвращение выхода воздуха. Медленно вводите 1 мл воздуха в легкие в течение 10 с, следя за надуванием легких всех долей. Полное надувание приводит к тому, что легкие слегка оборачиваются вокруг сердца и заполняют объем, который они занимают в непроколотой диафрагме.
4. Туго затяните узел вокруг трахеи и извлеките катетер. Возьмитесь за трахею и с помощью тупых ножниц удалите легкие у мыши, стараясь не проколоть легкое.

6. Иммерсионная фиксация и обезвоживание

1. Поместите легкие на верхний край конической трубки объемом 50 мл, наполненной 20 мл 10% NBF. Держите нити шовной нити снаружи конуса, закрутите колпачок и переверните коническую так, чтобы легкие были подвешены вверх ногами в 20 мл NBF. Поместите его при температуре 4 °C на 24-48 часов.
2. Промойте легкие в PBS, затем поместите в 30% раствор сахарозы-PBS (w/v) на 72-96 ч при 4 °C для обезвоживания легких и подготовки к криоконсервации. Извлеките легкие из сахарозы, поместите легкие в криомолд с оптимальной температурой резки (ОКТ) и заморозьте образец при температуре -80 °C.

7. Криосекция

1. Уравновесьте образцы в криоблоках ОКТ до температуры криостата -20 °С в течение 1 ч перед срезом. Секция блоков при толщине 20-100 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Надувание воздуха может привести к повышенной хрупкости образца, а резка при увеличенной толщине может предотвратить разрыв тканей во время разреза.
2. Соберите срезы на стеклянных предметных стеклах и дайте высохнуть от 30 минут до 1 часа, чтобы убедиться в прилегании тканей к предметному стеклу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе слайды можно держать при температуре -80 °C.

8. Подготовка и блокировка предмета

1. Поместите предметные стекла в ванну PBS (в посуду или банку для коплина) на 30 минут при комнатной температуре (RT), чтобы удалить ОКТ со стекол.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые секции (40-100 мкм) могут не прилипать к стеклянным предметным стеклам, а также более тонкие секции, поэтому лучше держать их плоскими и вертикальными в тарелке, а не класть на бок в банку Coplin.
2. Высушите предметные стекла после того, как ОКТ растворится в ткани. С помощью салфетки высушите лишние капли по периметру предметного стекла вокруг образца ткани.
3. С помощью гидрофобной ручки Папаниколау нарисуйте периметр вокруг образца и дайте ему высохнуть в течение 5 минут.
4. Приготовьте блокирующий буфер из блокирующего раствора без животных с 0,3% Tween-20 и 1:100 Fc Block в 300 мл на предметное стекло.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутриклеточных мишеней можно использовать 1% Tween-20. Объем в 300 мкл обычно достаточен, но необходимый объем для покрытия ткани полностью зависит от размера периметра гидрофобного маркера. С этого момента ткань не должна пересыхать.
5. Оставьте блокирующий раствор на предметных стеклах на 1 час при RT.

9. Иммуноокрашивание

1. Промойте предметное стекло, отпишивая жидкость пипеткой и добавляя 300-500 μл PBS. Повторите стирку один раз.
2. Приготовьте первичное конъюгированное антитело EpCAM (клон G8.8) к мышам (маркер эпителия дыхательных путей) AlexaFluor-647 в растворе блокатора животного происхождения с 0,33% Tween-20 (или 1% для внутриклеточных мишеней). Добавьте 300 μл этого раствора на каждое предметное стекло и окрашивайте на ночь при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела должны быть проверены эмпирически на концентрацию окрашивания, время и температуру. Тонкие срезы (8-20 мкм) окрашивают в течение 30 мин при 37 °С, а более толстые срезы (20-100 мкм) - при 4 °С в течение ночи с использованием разведений 1:100 для большинства антител. При использовании неконъюгированных антител промойте 2 раза (как указано выше) и нанесите вторичное флуоресцентное антитело в течение эмпирически определенного времени и температуры. Как правило, окрашивание вторичными антителами проводят в режиме лучевой терапии в течение 1 ч при разведении 1:1000.
3. Удалите раствор антитела из образца и промойте предметное стекло 300 мл PBS в течение 5 минут. Повторите эту стирку один раз. Высушите предметные стекла, удалив всю лишнюю жидкость с образца и окружающего стекла.
4. Добавьте по одной капле мягкого монтажного носителя RT (например, стекла SlowFade) на каждый кусок салфетки. Следите за тем, чтобы не было пузырей, позволяя бутылке осесть вверх дном и медленно капая каждую каплю на салфетки. Установите защитный накладку соответствующего размера, чтобы он выходил за пределы образца и гидрофобного маркера.

10. Визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии

1. Используйте многоканальный флуоресцентный микроскоп для сканирования целых срезов легких несмещенным образом с помощью объектива с достаточным разрешением для разрешения отдельных спор и клеток-хозяев (например, Zeiss Axioscan 7 с 20-кратным масляным объективом с NA = 0,8 или аналогичным).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мощность лазера и коэффициент усиления по напряжению ФЭУ установлены таким образом, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум мишени на фоне, определенное с помощью регулятора флуоресценции минус один (FMO).
2. Соберите достаточное количество фрагментов изображения, чтобы захватить всю долю легкого (например, ~200 фрагментов размером 400 μм x 400 μм). Используйте программное обеспечение для микроскопа (например, Zeiss ZEN 3.7 или аналогичный) для экспорта объединенного изображения листа для последующей обработки.

11. Пространственный анализ с помощью QuPath

1. В QuPath, бесплатном программном обеспечении с открытым исходным кодом¹⁴, создайте файл проекта и добавьте в него флуоресцентные изображения.
2. Классифицируйте пиксели EpCAM+ как эпителий, щелкнув в верхнем меню пункт «Классифицировать», затем классификацию пикселей > «Создать пороговый». Выберите разрешение, канал, сигму сглаживания и пороговое значение, которое лучше всего определяет целевую область. Сохраните классификатор под уникальным именем и выберите Создать объекты.
3. В новом окне "Создание объектов " выберите "Новый тип объекта " в качестве аннотации. Для эпителия легких установите минимальный размер объекта и минимальный размер отверстия на 100 мм². Здесь нет необходимости выбирать параметр «Разделить объекты ». После нажатия кнопки OK аннотации будут созданы, и их можно будет изменить на глаз с помощью инструмента «Кисть » в верхней левой области.
4. Чтобы классифицировать споры, повторите шаги из пунктов 11.3-11.4, используя канал, в котором споры были захвачены, и выберите новый тип объекта Обнаружение , а не Аннотация. Установите минимальный размер объекта и минимальный размер отверстия на 0 мм² и выберите Разделить объекты.
5. Чтобы провести пространственный анализ спор, выберите в верхнем меню пункт Анализ > Пространственный анализ > Вычислить расстояние по знаку до аннотаций 2D. Расстояния до эпителия EpCAM+ будут рассчитаны для каждой обнаруженной споры. Экспортируйте их с помощью пункта верхнего меню «Измерить» > «Экспортировать измерения».

Результаты

Этот метод в конечном итоге позволяет получать иммунофлуоресцентные изображения легких мышей с использованием физиологического надувания воздуха, чтобы не беспокоить дыхательные пути. Важно отметить, что несколько контрольных точек на этом пути подтвердят, что ком...

Обсуждение

Мы создали конвейер для ингаляции спор и анализа пространственного осаждения вдыхаемых спор. Этот конвейер предоставляет ценную информацию для определения соответствующих стромальных областей легких, пораженных вдыханием Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Мы наб?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 needle (305185)	Fisher	305185
1 L  Screwtop Jar  (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Syringes 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Injection (xylazine sterile solution)	Akorn	59399-110-20
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Catheter with BD Vialon Catheter Material 18 G x 1.88 in	BD	381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Dye	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning 70 micron strainers	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoclonal antibody	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucose Monohydrate	Azer Scientific	ES17530-500G
High Vacuum Grease	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
Ketamine Hydrochloride	Dechra	1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wipers (4.4'' x 8.4")	VWR	21905-026
Lexer Baby Scissors	FST	14078-10
Micro-Adson Forceps	FST	11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask tissue culture flasks, T75, filter caps	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-source	https://qupath.github.io/
Silk Suture thread size 3/0	FST	18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.AP
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophobic Barrier Pen Set Of 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangular (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
White Plastic Wire Mesh	MAPORCH	789862904922
Yeast Extract	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	multichannel fluorescent microscope
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	microscopy software