Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode für ein Pilzpathogenesemodell vor, das die natürliche Positionierung von Pilzsporen in den Lungenatemwegen für die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie beibehält.

Zusammenfassung

Pilze infizieren den Menschen, wenn Sporen aus der Umwelt in die Lunge eingeatmet werden. Die Lunge ist ein heterogenes Organ. Die leitenden Atemwege, einschließlich Bronchien und Bronchiolen, verzweigen sich, bis sie im alveolären Luftraum enden, wo der Gasaustausch stattfindet. Infektionen, die von den Bronchiolen oder Lungenbläschen ausgehen, lösen unterschiedliche Wirtsreaktionen und Krankheitsmanifestationen aus. Daher erweitert das genaue Verständnis, wo sich Sporen auf natürliche Weise in der Lunge lokalisieren, insbesondere kurz nach der Infektion, die Möglichkeiten für die Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen. Im Folgenden beschreiben wir eine in-situ-Analyse von Lungen von Mäusen, die mit Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Arthrokonidien infiziert waren. Herkömmliche Methoden zur histologischen Konservierung beinhalten das flüssige Aufblasen der Atemwege mit einer Fixierlösung, die die natürliche Position der aspirierten Pilzpartikel verdrängt und die Sporen von den proximalen Bronchiolen in die terminalen Lufträume drückt.

Umgekehrt erhält diese Methode des Aufblasens mit Perfusionsfixierung des Blutgefäßsystems die physiologische Position der Pilzsporen in den Bronchiolen. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Ansatz zur Kryokonservierung, Einbettung und Bildgebung von Lungenproben. Wir teilen auch Hochdurchsatz-Rechentechniken über das Open-Source-Programm QuPath, um die räumliche Verteilung von Pilzsporen in der Lunge zu analysieren. Die hier vorgestellte Methode ist einfach und schnell, erfordert nur minimale Ausrüstung und kann leicht für die Verwendung mit vielen Modellen von Pilzinfektionen der Atemwege angepasst werden.

Einleitung

Der Mensch kann bis zu Milliarden von Sporen pro Tag von einer Vielzahl von Umweltpilzen einatmen¹. Um unsere Barriereabwehr gegen diese eingeatmeten Sporen zu verstehen, müssen wir die genauen mikroanatomischen Umgebungen verstehen, in denen diese Sporen in den Atemwegen und im Lungenparenchym landen. Die zelluläre Zusammensetzung der Atemwege (d. h. der Epithelzellen) verändert sich entlang der Luftröhre, der Bronchien, der Bronchiolen und der Lungenbläschen erheblich. Jede dieser unterschiedlichen Regionen besteht aus verschiedenen Zelltypen mit diskreten Funktionen, die ein Arsenal an Abwehrmechanismen zur Verhinderung pathologischer Infektionen zur Verfügung stellen.

Die genaue Lokalisation der pulmonalen Pilzsporenablagerung kann zwischen den Atemwegslumen der säulenepithelial ausgekleideten Bronchiolen, der Alveolargänge oder der Alveolen variieren². Die meisten klinisch relevanten Pilzarten produzieren Sporen mit einem Durchmesser zwischen 1 μm und 10 μm³. Die Ablagerung dieser Sporenpartikel in der Lunge hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. Aerodynamik, Dichte, elektrische Ladung und phoretische Kräfte, die den Mechanismus der Sedimentation nach Inhalation beeinflussen können⁴. Im Allgemeinen lagern sich große Partikel (> 6 μm) in den oberen Atemwegen ab, mittelgroße Partikel (2-6 μm) können sich in kleineren Atemwegen ablagern, und kleine Partikel (<2 μm) erreichen die Alveolarregion⁵. Es wurde berichtet, dass Aspergillus-Sporen (2-3 μm) die Alveolarräume erreichen, aber klinische pathologische Berichte deuten auch auf eine signifikante Belastung durch Bronchial- und Bronchiolenerkrankungen^{hin 6}. Aufgrund der zunehmenden Beliebtheit der flexiblen Bronchoskopie werden auch zunehmend endobronchiale Pilzinfektionen von Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida-Spezies, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum und Zygomyceten erkannt⁷. Jüngste Fortschritte in der mikroskopischen Bildgebung von Aspergillus-Infektionen bei Mäusen haben auch gezeigt, dass proximale Lufträume wie Bronchien und Bronchiolen die größte Belastung für die pathologische Pilzproliferation darstellen^{können 8}. Die Erforschung der Wirtsreaktion auf pulmonale Pilzinfektionen hat gezeigt, dass sowohl bronchioläre Epithelzellen als auch alveoläre Epithelzellen eine wichtige Rolle als Immunwächter spielen, so dass die Aufklärung der genauen Orte der Sporenablagerung und der epithelialen Interaktion für zukünftige Arbeiten von entscheidender Bedeutung sein wird ^2,9,10.

Die Untersuchung dieser Pathogenesedynamik der proximalen Atemwege ist schwierig, da Standardtechniken zur Lungenfixierung und -aufbereitung Sporen aus diesen proximalen Positionen in epithelial ausgekleideten Atemwegen verdrängen und in Richtung der distalen terminalen Alveolarregionen schieben können. Üblicherweise wird 10 % Formalin oder 4 % Paraformaldehyd verwendet, um die Lunge aufzublasen und die gesamte Lunge schnell einem Fixiermittel auszusetzen. Bei der Vorbereitung der Lunge für die Kryosektion verabreichen einige Gruppen eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) in die Lunge, um die Leistung der Kryosektion zu verbessern¹¹. Diese Praktiken sind im richtigen Kontext nützlich, haben aber von unserem Labor und anderen Gruppen festgestellt, dass sie Sporen und Partikel von proximalen Orten verdrängen und dadurch die Interpretationen über die sporenexponierten Zelltypen und die anschließende Wirtsreaktion beeinträchtigen¹².

Um die mikroanatomische Lokalisation von inhalierten Pilzsporen genau zu bestimmen, haben wir eine schnelle, ressourcenschonende Methode zur Konservierung der Position von Pilzsporen in den Atemwegen von Mäusen entwickelt. Wir adaptierten eine murine Luftblasmethode zur vaskulären Perfusionsfixation von Thomas et al. (2021), bei der wir den Aufwand an Ausrüstung, Zeit und technischen Fähigkeiten reduzierten, die erforderlich waren, um ein zufriedenstellendes Ergebnis zu erzielen¹³. Anhand der hier beschriebenen Methode haben wir beobachtet, dass Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Arthrokonidien (3-5 μm groß) proximal reichern als zuvor gezeigt, nämlich in distalen Bronchiolen und broncho-alveolären Übergängen und nicht in terminalen Alveolen. Diese Informationen können biologische Fragen zu den kritischen Zelltypen, die mit diesen Regionen der Lunge assoziiert sind, und ihrem Einfluss auf die frühen Reaktionen auf eingeatmete Pilzsporen fokussieren.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Rutgers Biomedical Health Sciences genehmigt.

1. Markieren Sie Sporen mit intrazellulärer Fluoreszenz

1. 1 x 10⁶ Sporen in Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE), Cell Tracker Orange oder Cell Tracker Rot (oder einem intrazellulären Farbstoff Ihrer Wahl) bei 5 μM für 30 min bei 30 °C färben, dann mit PBS waschen und die Sporen bei 12.000 x g schleudern . Wiederholen Sie diese Wäsche einmal.
2. Bereiten Sie das Sporeninokulum in der richtigen Konzentration vor, so dass 25 μl die richtige Sporendosis für eine Maus enthalten.

2. Inokulation der Maus mit Sporen durch Aspirationsinhalation mit Isofluran-Anästhesie

ACHTUNG: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum und muss in einer Elektro-Biosicherheitswerkbank oder einem Abzug verwendet werden.

1. Um das Isofluran-Expositionsglas vorzubereiten, legen Sie eine gefaltete Serviette in ein 1-Liter-Nalgene-Glas mit Schraubverschluss und legen Sie einen Kunststoffnetzkreis als Plattform für die Mäuse über die Serviette. Geben Sie 2 ml Isofluran in die Serviette, schließen Sie das Glas und warten Sie 1-2 Minuten, bis sich das Gas im Behälter ausgeglichen hat.

Abbildung 1: Vorrichtung für die offene Isofluran-Drop-Methode zur Sporeninokulation. Eine gefaltete Serviette wird in den Boden eines 1-Liter-Schraubglases gelegt, und dann wird ein kreisförmiges Plastiknetz eingesetzt, das als Plattform für die Mäuse dient. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Bevor Sie die Maus einer Anästhesie aussetzen, bereiten Sie eine Pipette mit 25 μl des Inokulums vor. Platzieren Sie die Maus in den Isofluran-Behälter und kippen Sie den Behälter, um den Verlust des Aufrichtreflexes zu überwachen, wenn die Maus das Bewusstsein verloren hat und auf dem Kopf steht. Dies dauert in der Regel ca. 10 s.
3. Überwachen Sie die Atemfrequenz (RR), bis sie sich auf konstante 50-80 Atemzüge pro Minute (bpm) verlangsamt, etwa 50% der Ruhe-RR. Dies dauert in der Regel weitere 10 s. Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt die Maus aus dem Isofluran-Glas.
   HINWEIS: Hierbei handelt es sich um eine hohe Konzentration von Isofluran, die eine schnelle Einleitung der Anästhesie bewirkt, und die Maus muss sehr genau überwacht werden. Eine tödliche Überdosierung von Isofluran ist ein Risiko, da die Konzentration von Isofluran variabel sein kann und die Dosis-Wirkungs-Kurve zu Isofluran sehr steil ist. Wenn die Atemfrequenz unter 50 Schläge pro Minute sinkt und/oder unregelmäßig ist, entfernen Sie die Maus von Isofluran, lassen Sie sie 3-5 Minuten lang einwirken und versuchen Sie es erneut (maximal zwei wiederholte Versuche).
4. Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren. Positionieren Sie dann die Maus in Rückenlage in einer Hand und lassen Sie die Maus 3-5 regelmäßige Atemzüge mit zunehmender Frequenz (beginnend bei 50-60 Schlägen pro Minute) und Kraft nehmen. Zu Beginn dieser Operation platzieren Sie die Pipettenspitze am hinteren Rand des Oropharynx der Maus und geben Sie das Inokulum während einer Inhalation frei.
   HINWEIS: Diese Keuchen durch den Mund erschüttern den Kopf aufgrund der Rekrutierung von akzessorischen Muskeln für die Atmung nach unten. Wenn die Pipette während dieser Atemzüge eingeführt wird, sollte sich der Mund bei jedem Atemzug öffnen. Wenn sich der Mund nicht öffnet, ist die Maus unzureichend betäubt und wird wahrscheinlich keinen Inhalt aus dem Oropharynx einatmen. Die Pipette sollte die Zunge niederdrücken und sie nach unten und vorne in den Mund drücken, um ein Verschlucken des Inokulums zu verhindern. Wenn sich die Pipette im Mund befindet und die Maus ausreichend betäubt ist, öffnet die Maus mit jedem Atemzug ihren Mund.
5. Fühlen Sie mit der Hand und dem Daumen, die die Maus halten, nach Knistern an den hinteren und vorderen Aspekten des Brustkorbs der Maus, um die Inhalation des Inokulums zu bestätigen.

3. Euthanasie von Mäusen

1. Injizieren Sie der Maus intraperitoneal einen Cocktail aus 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin 10 Minuten vor dem Opferzeitpunkt.
2. Warten Sie 10 Minuten nach der Injektion, bis die Maus in eine chirurgische Anästhesieebene eintritt, was durch ein mangelndes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen bestätigt wird.

4. Durchblutung der Lunge mit PBS und Formalin

1. Besprühen Sie die betäubte Maus mit 70% Ethanol. Schneide mit einer Schere die Haut der Maus zurück und ziehe die Haut auseinander, um das Bauchfell von allen Seiten freizulegen. Ziehen Sie die Haut von der oberen Hälfte der Maus über den Kopf und ziehen Sie die Arme aus der Haut heraus.
2. Schneiden Sie die Peritonealmembran am Brustbein und entlang der unteren Seite des Brustkorbs und legen Sie das Peritoneum frei. Verschieben Sie die Leber nach unten und legen Sie das Zwerchfell frei. Verwende eine Schere, um das Zwerchfell vorsichtig vom Lungenparenchym weg zu punktieren, um ein Loch in der Lunge selbst zu vermeiden.
   HINWEIS: Ein versehentliches Durchstechen der Lunge macht ein anschließendes Aufblasen der Luft unmöglich.
3. Nachdem das Zwerchfell durchstochen wurde, tritt Luft in den Thorax ein und kollabiert die Lunge. Schneide den Brustkorb auf der linken Seite auf, um das Herz freizulegen. Injizieren Sie 5-10 ml PBS mit einer 30-g-Nadel in den rechten Ventrikel mit einer Rate von 1 ml pro 5 s (um eine Beschädigung der Gefäße zu vermeiden) und hellen Sie die Lunge schnell auf.
   VORSICHT: Formalin ist eine gefährliche flüchtige Substanz, die in einer Biosicherheitswerkbank oder einem Abzug gehandhabt werden sollte.
4. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Nadel und injizieren Sie mit einer neuen Nadel 5 ml 10% neutralgepuffertes Formalin (NBF) mit der gleichen Geschwindigkeit in den rechten Ventrikel.

5. Aufblasen der perfundierten Lunge

1. Entferne die vordere Hälfte des Brustkorbs. Um die Luftröhre freizulegen, schneiden Sie die oberen Rippen und Schlüsselbeine rechts und links des Halses ab. Achten Sie darauf, dass Sie nicht in der Nähe der Mittellinie schneiden, wo die Luftröhre liegt. Fassen Sie mit einer Pinzette die verbleibenden oberen Rippen und Schlüsselbeine an der Mittellinie des Halses an und ziehen Sie überlegen, bis die Luftröhre freiliegt.
2. Bereiten Sie einen Nahtanden von 10 cm Länge vor, ziehen Sie ihn unter die Luftröhre und binden Sie einen losen Knoten am unteren Ende der freiliegenden Luftröhre. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit Luft und einem 18-G-Katheter vor. Verwende eine 18 G Nadel, um ein Loch in die Luftröhre am oberen Ende des freiliegenden Bereichs zu bohren.
3. Platzieren Sie den Katheter in diesem Loch und achten Sie auf einen relativ festen Sitz, um zu verhindern, dass Luft entweicht. Injizieren Sie die 1 ml Luft langsam über einen Zeitraum von 10 s in die Lunge und achten Sie dabei auf das Aufblasen aller Lungenlappen. Das vollständige Aufblasen führt dazu, dass sich die Lungen leicht um das Herz wickeln und das Volumen füllen, das sie im unpunktierten Zwerchfell einnehmen.
4. Ziehe den Knoten fest um die Luftröhre und entferne den Katheter. Halten Sie die Luftröhre fest und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Lunge von der Maus zu entfernen, und achten Sie darauf, die Lunge nicht zu punktieren.

6. Immersionsfixierung und Dehydrierung

1. Legen Sie die Lunge auf den oberen Rand eines konischen 50-ml-Röhrchens, das mit 20 mL 10 % NBF gefüllt ist. Halten Sie die Nahtfäden außerhalb des Konischen, schrauben Sie die Kappe fest und drehen Sie den Konus um, so dass die Lunge kopfüber in 20 ml NBF aufgehängt wird. Stellen Sie es 24-48 h lang bei 4 °C auf.
2. Spülen Sie die Lunge mit PBS und legen Sie sie dann für 72-96 h bei 4 °C in eine 30%ige Saccharose-PBS-Lösung, um die Lunge zur Vorbereitung der Kryokonservierung zu dehydrieren. Entfernen Sie die Lunge von der Saccharose, legen Sie die Lunge in ein Kryomold mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) und frieren Sie die Probe bei -80 °C ein.

7. Kryosektion

1. Äquilibrieren Sie die Proben in OCT-Kryoblöcken 1 h lang auf die -20 °C Temperatur des Kryostaten, bevor Sie schneiden. Die Blöcke bei einer Dicke von 20-100 μm schneiden.
   HINWEIS: Das Aufblasen von Luft kann zu einer erhöhten Zerbrechlichkeit der Probe führen, und das Schneiden mit erhöhter Dicke kann einen Gewebebruch während des Schnitts verhindern.
2. Sammeln Sie die Schnitte auf Objektträgern und lassen Sie sie 30 Minuten bis 1 Stunde trocknen, um sicherzustellen, dass das Gewebe am Objektträger haftet.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Objektträger bei -80 °C gehalten werden.

8. Vorbereitung und Blockieren von Objektträgern

1. Legen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in ein PBS-Bad (in eine Schüssel oder ein Coplin-Glas), um die OCT von den Objektträgern zu entfernen.
   HINWEIS: Dickere Abschnitte (40-100 μm) haften möglicherweise nicht so gut an Objektträgern wie dünnere Abschnitte, daher ist es am besten, sie flach und aufrecht in einer Schale aufzubewahren, anstatt sie auf der Seite in ein Coplin-Glas zu legen.
2. Trocknen Sie die Objektträger, nachdem sich OCT vom Gewebe gelöst hat. Verwenden Sie ein Tuch, um überschüssige Tröpfchen vom Umfang des Objektträgers um die Gewebeprobe herum zu trocknen.
3. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Pap-Stift einen Umfang um die Probe und lassen Sie sie 5 Minuten trocknen.
4. Bereiten Sie einen Blockierungspuffer aus tierversuchsfreier Blockierungslösung mit 0,3 % Tween-20 und 1:100 Fc Block in 300 mL pro Objektträger vor.
   HINWEIS: Für intrazelluläre Ziele kann 1 % Tween-20 verwendet werden. Ein Volumen von 300 μl ist in der Regel ausreichend, aber das notwendige Volumen, um das Gewebe vollständig abzudecken, hängt von der Perimetergröße des hydrophoben Markers ab. Ab diesem Zeitpunkt sollte das Gewebe nicht mehr trocknen.
5. Lassen Sie die Blocklösung 1 h bei RT auf den Objektträgern.

9. Immunfärbung

1. Waschen Sie den Objektträger, indem Sie die Flüssigkeit abpipettieren und 300-500 μl PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschgang einmal.
2. Bereiten Sie den primären AlexaFluor-647-konjugierten Anti-Maus-EpCAM-Antikörper (Klon G8.8) für Ratten (Epithelmarker der Atemwege) in tierversuchsfreier Blockerlösung mit 0,33 % Tween-20 (oder 1 % für intrazelluläre Ziele) vor. Fügen Sie 300 μl dieser Lösung pro Objektträger hinzu und färben Sie sie über Nacht bei 4 °C.
   HINWEIS: Antikörper sollten empirisch auf Färbekonzentration, Zeit und Temperatur getestet werden. Dünnschliffe (8-20 μm) werden für 30 min bei 37 °C und dickere Schnitte (20-100 μm) bei 4 °C über Nacht mit Verdünnungen von 1:100 für die meisten Antikörper gefärbt. Bei Verwendung von unkonjugierten Antikörpern waschen Sie sich 2x (wie oben) und legen Sie einen sekundären fluoreszierenden Antikörper für eine empirisch bestimmte Zeit und Temperatur auf. Im Allgemeinen wird die Sekundärantikörperfärbung bei RT für 1 h bei einer Verdünnung von 1:1000 durchgeführt.
3. Entfernen Sie die Antikörperlösung aus der Probe und waschen Sie den Objektträger 5 Minuten lang mit 300 mL PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal. Trocknen Sie die Objektträger und entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit aus der Probe und dem umgebenden Glas.
4. Geben Sie einen Tropfen RT Softset-Eindeckmedium (z. B. SlowFade Glas) auf jedes Gewebestück. Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, indem Sie die Flasche auf dem Kopf stehen lassen und jeden Tropfen langsam auf das Taschentuch tropfen lassen. Legen Sie ein Deckglas in geeigneter Größe an, das über den Umfang der Probe und des hydrophoben Markers hinausragt.

10. Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie

1. Verwenden Sie ein Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop, um ganze Lungenabschnitte unvoreingenommen zu scannen, indem Sie ein Objektiv mit ausreichender Auflösung verwenden, um einzelne Sporen und Wirtszellen aufzulösen (z. B. Zeiss Axioscan 7 mit 20x Ölobjektiv mit NA = 0,8 oder ähnlichem).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Laserleistung und die PMT-Spannungsverstärkung so eingestellt sind, dass die Signal-Rausch-Verhältnisse des Ziels über dem Hintergrund maximiert werden, die mit einem FMO-Regler (Fluoreszenz minus eins) bestimmt werden.
2. Sammeln Sie ausreichend Bildkacheln, um den gesamten Lungenlappen zu erfassen (z. B. ~200 Kacheln mit einer Größe von 400 μm x 400 μm). Verwenden Sie die Mikroskop-Software (z. B. Zeiss ZEN 3.7 oder ähnlich), um das zusammengeführte Kachelbild für die Weiterverarbeitung zu exportieren.

11. Räumliche Analyse über QuPath

1. Erstellen Sie in QuPath, einer kostenlosen Open-Source-Software¹⁴, eine Projektdatei und fügen Sie die Fluoreszenzbilder zur Datei hinzu.
2. Klassifizieren Sie die EpCAM+-Pixel als Epithel, indem Sie auf die obere Menüoption Klassifizieren und dann auf Pixelklassifizierung > Schwellenwert erstellen klicken. Wählen Sie die Auflösung, den Kanal, das Glättungs-Sigma und den Schwellenwert aus, der den Zielbereich am besten identifiziert. Speichern Sie den Klassifikator unter einem eindeutigen Namen, und wählen Sie Objekte erstellen aus.
3. Wählen Sie im neuen Fenster Objekte erstellen die Option Neuer Objekttyp als Anmerkung aus. Legen Sie für das Lungenepithel die minimale Objektgröße und die minimale Lochgröße auf 100 mm² fest. Hier ist es nicht erforderlich, Objekte teilen auszuwählen. Nachdem Sie OK ausgewählt haben, werden die Anmerkungen erstellt und können mit dem Pinsel im oberen linken Bereich mit dem Auge geändert werden.
4. Um Sporen zu klassifizieren, wiederholen Sie die Schritte von 11.3 bis 11.4 mit dem Kanal, in dem die Sporen gefangen wurden, und legen Sie den neuen Objekttyp Erkennung anstelle von Anmerkung fest. Legen Sie die minimale Objektgröße und die minimale Bohrungsgröße auf 0 mm² fest, und wählen Sie Objekte teilen aus.
5. Um eine räumliche Analyse der Sporen durchzuführen, wählen Sie im oberen Menü die Option Analysieren > Räumliche Analyse > Berechnen der vorzeichenbehafteten Entfernung zu den Anmerkungen 2D. Die Entfernungen zum EpCAM+-Epithel werden für jede detektierte Spore berechnet. Exportieren Sie diese über den oberen Menüpunkt Messen > Messungen exportieren.

Ergebnisse

Diese Methode erzeugt schließlich Immunfluoreszenzbilder von Mauslungen unter Verwendung physiologischer Luftblase, um die Atemwege ungestört zu lassen. Wichtig ist, dass mehrere Prüfpunkte auf dem Weg bestätigen, dass Komponenten des Protokolls erfolgreich ausgeführt wurden. Während der Inokulation ist es wichtig zu bestätigen, dass das Inokulum aspiriert wurde, indem man nach "Knistern" an der hinteren Brustwand der Maus tastet, die darauf hinweisen, dass die Flüssigkeit in die...

Diskussion

Wir haben eine Pipeline für die Sporeninhalation und die Analyse der räumlichen Ablagerung der eingeatmeten Sporen eingerichtet. Diese Pipeline liefert wertvolle Informationen zur Bestimmung der relevanten Stromaregionen der Lunge, die von der Inhalation von Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Arthrokonidien betroffen sind. Wir haben beobachtet, dass sich Kokzidioides-Sporen und ähnlich große inerte Partikel (Daten nicht gezeigt) in distalen bronchiolären Regi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 needle (305185)	Fisher	305185
1 L  Screwtop Jar  (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Syringes 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Injection (xylazine sterile solution)	Akorn	59399-110-20
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Catheter with BD Vialon Catheter Material 18 G x 1.88 in	BD	381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Dye	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning 70 micron strainers	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoclonal antibody	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucose Monohydrate	Azer Scientific	ES17530-500G
High Vacuum Grease	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
Ketamine Hydrochloride	Dechra	1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wipers (4.4'' x 8.4")	VWR	21905-026
Lexer Baby Scissors	FST	14078-10
Micro-Adson Forceps	FST	11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask tissue culture flasks, T75, filter caps	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-source	https://qupath.github.io/
Silk Suture thread size 3/0	FST	18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.AP
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophobic Barrier Pen Set Of 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangular (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
White Plastic Wire Mesh	MAPORCH	789862904922
Yeast Extract	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	multichannel fluorescent microscope
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	microscopy software