Méthode efficace d’imagerie des poumons murins qui préserve la dynamique spatiale des spores fongiques dans les voies respiratoires

Résumé

Nous présentons une méthode pour un modèle de pathogenèse fongique qui préserve le positionnement naturel des spores fongiques dans les voies respiratoires pulmonaires pour une analyse par microscopie fluorescente.

Résumé

Les champignons infectent les humains lorsque des spores environnementales sont inhalées dans les poumons. Le poumon est un organe hétérogène. Les voies respiratoires conductrices, y compris les bronches et les bronchioles, se ramifient jusqu’à se terminer dans l’espace aérien alvéolaire où se produisent les échanges gazeux. Les infections provenant des bronchioles ou des alvéoles provoquent des réponses distinctes de l’hôte et des manifestations de la maladie. Par conséquent, comprendre précisément où les spores se localisent naturellement dans les poumons, en particulier peu de temps après l’infection, élargit les possibilités d’étude des interactions hôte-pathogène. Nous détaillons ici une analyse in situ de poumons de souris infectées par Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Les méthodes conventionnelles de conservation histologique impliquent le gonflage liquide des voies respiratoires avec une solution fixatrice, qui déplace l’emplacement naturel des particules fongiques aspirées, poussant les spores des bronchioles proximales vers les espaces aériens terminaux.

À l’inverse, cette méthode de gonflage de l’air avec fixation par perfusion vasculaire sanguine préserve la position physiologique des spores fongiques au sein des bronchioles. De plus, nous décrivons une approche simple de la cryoconservation, de l’intégration et de l’imagerie des échantillons pulmonaires. Nous partageons également des techniques de calcul à haut débit via le programme open source QuPath pour analyser la distribution spatiale des spores fongiques dans les poumons. La méthode présentée ici est simple et rapide, nécessite un équipement minimal et peut être facilement adaptée pour être utilisée avec de nombreux modèles d’infections fongiques respiratoires.

Introduction

Les humains peuvent inhaler jusqu’à des milliards de spores par jour à partir d’une variété de champignons environnementaux¹. Pour comprendre nos défenses barrières contre ces spores inhalées, nous devons apprécier les environnements microanatomiques précis où ces spores atterrissent dans les voies respiratoires et le parenchyme pulmonaire. La composition cellulaire des voies respiratoires (c’est-à-dire les cellules épithéliales) se transforme considérablement le long de la trachée, des bronches, des bronchioles et des alvéoles. Chacune de ces régions distinctes est composée de différents types de cellules avec des fonctions discrètes qui disposent d’un arsenal de défenses pour prévenir l’infection pathologique.

L’emplacement précis du dépôt de spores fongiques pulmonaires peut varier entre les lumières des voies respiratoires des bronchioles colonnaires tapissées d’épithéliales, des canaux alvéolaires ou des alvéoles². La plupart des espèces fongiques cliniquement pertinentes produisent des spores d’un diamètre³ compris entre 1 m et 10 m. Le dépôt de ces particules de spores dans les poumons dépend de plusieurs facteurs, tels que l’aérodynamique, la densité, la charge électrique et les forces phorétiques, qui peuvent influencer le mécanisme de sédimentation après l’inhalation⁴. Généralement, les grosses particules (> 6 μm) se déposent dans les voies respiratoires supérieures, les particules de taille moyenne (2-6 μm) peuvent se déposer dans les voies respiratoires plus petites et les petites particules (<2 μm) atteignent la région alvéolaire⁵. Des spores d’Aspergillus (2-3 μm) ont été signalées pour atteindre les espaces alvéolaires, mais les rapports de pathologie clinique indiquent également un fardeau important de maladies bronchiques et bronchiolaires⁶. En raison de la popularité croissante de la bronchoscopie^flexible 7, on reconnaît également de plus en plus les infections fongiques endobronchiques d’Aspergillus fumigatus, de Coccidioides immitis, d’espèces Candida, de Cryptococcus neoformans, d’Histoplasma capsulatum et de Zygomycètes. Les progrès récents de l’imagerie microscopique des infections à Aspergillus chez la souris ont également révélé que les espaces aériens plus proximaux, tels que les bronches et les bronchioles, peuvent porter le fardeau le plus élevé de la prolifération fongique pathologique⁸. La recherche sur la réponse de l’hôte aux infections fongiques pulmonaires a montré que les cellules épithéliales bronchiolaires et les cellules épithéliales alvéolaires jouent un rôle important en tant que sentinelles immunitaires, de sorte qu’il sera essentiel d’élucider les sites exacts de dépôt de spores et d’interaction épithéliale pour les travaux futurs ^2,9,10.

L’étude de la dynamique de la pathogenèse de ces voies respiratoires proximales est difficile car les techniques standard de fixation pulmonaire et de préparation de la section peuvent déplacer les spores de ces positions proximales dans les voies respiratoires tapissées d’épithélium et les pousser vers les régions alvéolaires terminales distales. Généralement, 10 % de formol ou 4 % de paraformaldéhyde sont utilisés pour gonfler les poumons et exposer rapidement l’ensemble des poumons au fixateur. Lors de la préparation des poumons pour la cryosection, certains groupes administrent un composé à température de coupe optimale (OCT) dans les poumons pour améliorer les performances de cryosection¹¹. Ces pratiques sont utiles dans le bon contexte, mais notre laboratoire et d’autres groupes ont constaté qu’elles déplacent les spores et les particules des emplacements proximaux, interférant ainsi avec les interprétations concernant les types de cellules exposées aux spores et la réponse ultérieure de l’hôte¹².

Pour établir avec précision la localisation microanatomique des spores fongiques inhalées, nous avons mis au point une méthode rapide et nécessitant peu de ressources pour la préservation de l’emplacement des spores fongiques dans les voies respiratoires des souris. Nous avons adapté une méthode de perfusion vasculaire par gonflage d’air murin de Thomas et al. (2021), où nous avons réduit la quantité d’équipement, de temps et de compétences techniques nécessaires pour obtenir un résultat satisfaisant¹³. D’après la méthode décrite ici, nous avons observé que les arthroconidies de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (d’une taille de 3 à 5 μm) s’accumulent plus proximal que ce qui a été montré précédemment, à savoir dans les bronchioles distales et les jonctions broncho-alvéolaires plutôt que dans les alvéoles terminales. Cette information peut orienter des questions biologiques concernant les types de cellules critiques associés à ces régions du poumon et leur influence sur les réponses précoces aux spores fongiques inhalées.

Protocole

Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Marquez les spores avec une fluorescence intracellulaire

1. Colorez 1 x 10⁶ spores dans de l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE), du Cell Tracker Orange ou du Cell Tracker Red (ou du colorant intracellulaire de votre choix) à 5 μM pendant 30 min à 30 °C, puis lavez avec du PBS et essorez les spores à 12 000 x g. Répétez ce lavage une fois.
2. Préparez l’inoculum de spores à la concentration appropriée de sorte que 25 μL contiennent la dose de spores appropriée pour une souris.

2. Inoculation de spores à la souris par inhalation par aspiration à l’aide d’une anesthésie à l’isoflurane

ATTENTION : L’isoflurane est un agent anesthésique volatil et doit être utilisé dans une enceinte de biosécurité canalisée ou une hotte.

1. Pour préparer le pot d’exposition à l’isoflurane, placez une serviette pliée dans un pot Nalgene à vis de 1 L et placez un cercle en plastique sur la serviette comme plate-forme pour les souris. Ajoutez 2 ml d’isoflurane dans la serviette, fermez le pot et attendez 1 à 2 minutes que le gaz s’équilibre dans le récipient.

Figure 1 : Appareil pour la méthode d’inoculation des spores à l’aide d’isoflurane à goutte ouverte. Une serviette pliée est placée au fond d’un bocal à vis de 1 L, puis un treillis circulaire en plastique est inséré pour servir de plate-forme aux souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Avant d’exposer la souris à l’anesthésie, préparez une pipette avec 25 μL d’inoculum. Placez la souris dans le récipient d’isoflurane et inclinez le récipient pour surveiller la perte du réflexe de redressement, c’est-à-dire que la souris a perdu conscience et est à l’envers. Cela prend généralement environ 10 s.
3. Surveillez la fréquence respiratoire (RR) jusqu’à ce qu’elle ralentisse à un niveau constant de 50 à 80 respirations par minute (bpm), soit environ 50 % de la RR au repos. Cela prend généralement 10 secondes supplémentaires. À ce moment, retirez la souris du bocal d’isoflurane.
   REMARQUE : Il s’agit d’une forte concentration d’isoflurane, qui produira une induction rapide de l’anesthésie, et la souris doit être surveillée de très près. Un surdosage mortel d’isoflurane présente un risque, car la concentration d’isoflurane peut être variable et la courbe dose-réponse à l’isoflurane est très abrupte. Si la fréquence respiratoire descend en dessous de 50 bpm et/ou est irrégulière, retirez la souris de l’isoflurane, laissez-la récupérer pendant 3 à 5 minutes et réessayez (un maximum de deux tentatives répétées).
4. Confirmez la profondeur de l’anesthésique par l’absence de réponse au pincement de l’orteil. Ensuite, positionnez la souris en position couchée d’une main et permettez-lui de prendre 3 à 5 respirations haletantes régulières avec un rythme croissant (à partir de 50-60 bpm) et une vigueur. Lorsque cela commence, placez l’extrémité de la pipette à l’arrière de l’oropharynx de la souris et libérez l’inoculum lors d’une inspiration.
   REMARQUE : Ces halètements par la bouche secouent la tête vers le bas en raison du recrutement de muscles accessoires pour la respiration. Lorsque la pipette est insérée pendant ces halètements, la bouche doit s’ouvrir à chaque halètement. Si la bouche ne s’ouvre pas, la souris n’est pas suffisamment anesthésiée et n’inhalera probablement pas le contenu de l’oropharynx. La pipette doit enfoncer la langue, la pousser vers le bas et l’avant de la bouche pour éviter l’infusion de l’inoculum. Lorsque la pipette est dans la bouche et que la souris est correctement anesthésiée, la souris ouvre la bouche à chaque halètement.
5. Avec la main et le pouce tenant la souris, palpez les crépitements sur les faces postérieure et antérieure du thorax de la souris pour confirmer l’inhalation de l’inoculum.

3. Euthanasie des souris

1. Injectez à la souris par voie intrapéritonéale un cocktail de 200 mg/kg de kétamine et de 24 mg/kg de xylazine 10 minutes avant le moment du sacrifice.
2. Attendre 10 minutes après l’injection jusqu’à ce que la souris entre dans un plan chirurgical d’anesthésie, confirmé par l’absence de réponse au pincement de l’orteil.

4. Perfusion des poumons avec PBS et formol

1. Vaporisez la souris anesthésiée avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux pour couper la peau de la souris et séparez la peau pour exposer le péritoine de tous les côtés. Tirez la peau de la moitié supérieure de la souris sur sa tête, en retirant les bras de la peau.
2. Coupez la membrane péritonéale au niveau du sternum et le long de la face inférieure de la cage thoracique, exposant le péritoine. Déplacer le foie vers le bas, révélant le diaphragme. Utilisez des ciseaux pour percer soigneusement le diaphragme loin du parenchyme pulmonaire afin d’éviter de percer un trou dans les poumons eux-mêmes.
   REMARQUE : Perforer par inadvertance les poumons rendra impossible le gonflage ultérieur de l’air.
3. Après la perforation du diaphragme, l’air pénètre dans le thorax, ce qui fait s’effondrer les poumons. Coupez la cage thoracique sur le côté gauche pour révéler le cœur. Injecter 5 à 10 ml de PBS dans le ventricule droit avec une aiguille de 30 G à raison de 1 ml toutes les 5 s (pour éviter d’endommager les vaisseaux), en blanchissant rapidement les poumons.
   ATTENTION : Le formol est une substance volatile dangereuse qui doit être manipulée dans une enceinte de biosécurité canalisée ou une hotte.
4. Lorsque vous avez terminé, retirez l’aiguille et utilisez une nouvelle aiguille pour injecter 5 ml de formol à tampon neutre (FBN) à 10 % dans le ventricule droit au même rythme.

5. Gonflement à l’air du poumon perfusé

1. Retirez la moitié antérieure de la cage thoracique. Pour exposer la trachée, coupez les côtes supérieures et les clavicules à droite et à gauche du cou. Prenez soin d’éviter de couper près de la ligne médiane où se trouvera la trachée. À l’aide d’une pince, agrippez les côtes supérieures et les clavicules restantes sur la ligne médiane du cou et tirez vers le haut jusqu’à ce que la trachée soit exposée.
2. Préparez un fil de suture de 10 cm de long, passez-le sous la trachée et faites un nœud lâche à l’extrémité inférieure de la trachée exposée. Préparez une seringue d’air de 1 mL avec un cathéter de 18 G. À l’aide d’une aiguille de 18 G, faites un trou dans la trachée à l’extrémité supérieure de la région exposée.
3. Placez le cathéter dans ce trou, en veillant à ce qu’il soit relativement serré pour empêcher l’air de s’échapper. Injectez lentement 1 ml d’air dans les poumons pendant 10 s, en surveillant le gonflement pulmonaire de tous les lobes. Le gonflage complet fait que les poumons s’enroulent légèrement autour du cœur et remplissent le volume qu’ils occupent dans le diaphragme non perforé.
4. Tirez le nœud autour de la trachée et retirez le cathéter. Tenez la trachée et utilisez des ciseaux émoussés pour retirer les poumons de la souris, en faisant attention de ne pas percer le poumon.

6. Fixation par immersion et déshydratation

1. Placez les poumons sur le bord supérieur d’un tube conique de 50 ml rempli de 20 ml de FBN à 10 %. Gardez les fils de suture à l’extérieur de la conique, vissez le capuchon et inversez la conique de sorte que les poumons soient suspendus à l’envers dans 20 ml de FBN. Placez-le à 4 °C pendant 24-48 h.
2. Rincer les poumons au PBS, puis les placer dans une solution à 30 % de saccharose-PBS (p/v) pendant 72 à 96 h à 4 °C pour déshydrater les poumons en vue de la cryoconservation. Retirez les poumons du saccharose, placez-les dans un cryomoule avec un milieu à température de coupe optimale (OCT) et congelez l’échantillon à -80 °C.

7. Cryosectionnement

1. Équilibrez les échantillons dans les cryoblocs OCT à la température de -20 °C du cryostat pendant 1 h avant la section. Sectionnez les blocs à des épaisseurs de 20 à 100 μm.
   REMARQUE : Le gonflage à l’air peut entraîner une fragilité accrue de l’échantillon, et une coupe à une épaisseur accrue peut prévenir la rupture des tissus pendant la section.
2. Prélever des sections sur des lames de verre et laisser sécher pendant 30 min à 1 h pour assurer l’adhérence du tissu à la lame.
   REMARQUE : Les diapositives peuvent être maintenues à -80 °C à ce stade.

8. Préparation et blocage des lames

1. Placez les lames dans un bain PBS (dans un plat ou un bocal Coplin) pendant 30 min à température ambiante (RT) pour éliminer l’OCT des lames.
   REMARQUE : Les sections plus épaisses (40-100 μm) peuvent ne pas adhérer aux lames de verre ainsi qu’aux sections plus minces, il est donc préférable de les garder plates et verticales dans un plat plutôt que de les placer sur le côté dans un bocal Coplin.
2. Séchez les lames une fois que l’OCT s’est dissous loin du tissu. Utilisez une lingette pour sécher les gouttelettes en excès du périmètre de la lame autour de l’échantillon de tissu.
3. À l’aide d’un stylo Pap hydrophobe, tracez un périmètre autour de l’échantillon et laissez-le sécher pendant 5 minutes.
4. Préparez un tampon de blocage de solution de blocage sans animaux avec 0,3 % de Tween-20 et un bloc de 1:100 Fc dans 300 mL par lame.
   REMARQUE : Pour les cibles intracellulaires, 1 % de Tween-20 peut être utilisé. Un volume de 300 μL est généralement suffisant, mais le volume nécessaire pour couvrir entièrement le tissu dépend de la taille du périmètre du marqueur hydrophobe. Le tissu ne doit pas sécher à partir de ce moment.
5. Laissez la solution de blocage sur les lames pendant 1 h à RT.

9. Immunomarquage

1. Lavez la lame en pipetant le liquide et en ajoutant 300 à 500 μL de PBS. Répétez le lavage une fois.
2. Préparez l’anticorps primaire conjugué AlexaFluor-647 anti-souris EpCAM (clone G8.8) (marqueur épithélial des voies respiratoires) dans une solution bloquante exempte d’animaux avec 0,33 % de Tween-20 (ou 1 % pour les cibles intracellulaires). Ajouter 300 μL par lame de cette solution et colorer toute la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Les anticorps doivent être testés empiriquement pour la concentration, le temps et la température de la coloration. Les lames minces (8-20 μm) sont colorées pendant 30 min à 37 °C et les sections plus épaisses (20-100 μm) à 4 °C pendant la nuit en utilisant des dilutions 1:100 pour la plupart des anticorps. Si vous utilisez des anticorps non conjugués, laver 2 fois (comme ci-dessus) et appliquer un anticorps fluorescent secondaire pendant une durée et une température déterminées empiriquement. Généralement, la coloration secondaire des anticorps est effectuée à RT pendant 1 h à une dilution de 1:1000.
3. Retirer la solution d’anticorps de l’échantillon et laver la lame avec 300 mL de PBS pendant 5 min. Répétez ce lavage une fois. Séchez les lames en enlevant tout excès de liquide de l’échantillon et du verre environnant.
4. Ajoutez une goutte de support de montage RT soft set (par exemple, SlowFade Glass) sur chaque morceau de tissu. Prenez soin d’éviter les bulles en laissant le flacon se déposer à l’envers et en déposant lentement chaque goutte sur les mouchoirs. Placez une lamelle de taille appropriée pour s’étendre au-delà du périmètre de l’échantillon et du marqueur hydrophobe.

10. Imagerie par microscopie fluorescente

1. Utilisez un microscope fluorescent multicanaux pour balayer des coupes pulmonaires entières de manière impartiale à l’aide d’un objectif ayant une résolution suffisante pour résoudre les spores individuelles et les cellules hôtes (par exemple, Zeiss Axioscan 7 avec un objectif d’huile 20x avec NA = 0,8 ou similaire).
   REMARQUE : Assurez-vous que la puissance laser et le gain de tension PMT sont réglés pour maximiser les rapports signal/bruit de la cible sur l’arrière-plan déterminés avec une commande de fluorescence moins un (FMO).
2. Recueillir suffisamment de tuiles d’image pour capturer l’ensemble du lobe pulmonaire (p. ex., ~200 tuiles de 400 μm x 400 μm). Utilisez le logiciel de microscope (par exemple, Zeiss ZEN 3.7 ou similaire) pour exporter l’image des carreaux fusionnés pour le traitement en aval.

11. Analyse spatiale via QuPath

1. Dans QuPath, un logiciel open source gratuit¹⁴, créez un fichier de projet et ajoutez-y les images fluorescentes.
2. Classez les pixels EpCAM+ en tant qu’épithélium en cliquant sur l’option de menu supérieure Classifier, puis sur Classification des pixels > Créer un seuil. Sélectionnez la résolution, le canal, le sigma de lissage et la valeur de seuil qui identifient le mieux la région cible. Enregistrez le classifieur sous un nom unique, puis sélectionnez Créer des objets.
3. Dans la nouvelle fenêtre Créer des objets , sélectionnez Nouveau type d’objet en tant qu’annotation. Pour l’épithélium pulmonaire, réglez la taille minimale de l’objet et la taille minimale du trou à 100 mm². Il n’est pas nécessaire de sélectionner Diviser les objets ici. Après avoir sélectionné OK, les annotations seront créées et elles peuvent être modifiées à l’œil nu à l’aide de l’outil Pinceau dans la zone supérieure gauche.
4. Pour classer les spores, répétez les étapes de 11.3 à 11.4 en utilisant le canal dans lequel les spores ont été capturées et faites en sorte que le nouveau type d’objet soit Détection plutôt qu’Annotation. Définissez la taille minimale de l’objet et la taille minimale du trou sur 0 mm², puis sélectionnez Diviser les objets.
5. Pour effectuer une analyse spatiale des spores, sélectionnez l’option de menu supérieure Analyser > Analyse spatiale > Calculer la distance signée aux annotations 2D. Les distances jusqu’à l’épithélium EpCAM+ seront calculées pour chaque spore détectée. Exportez-les via l’option de menu supérieure Mesure > Exporter les mesures.

Résultats

Cette méthode produit finalement des images immunofluorescentes des poumons de souris en utilisant le gonflage physiologique de l’air pour laisser les voies respiratoires intactes. Il est important de noter que plusieurs points de contrôle en cours de route confirmeront que les composants du protocole ont été exécutés avec succès. Lors de l’inoculation, il est important de confirmer que l’inoculum a été aspiré en palpant des « crépitements » sur la paroi thoracique pos...

Discussion

Nous avons établi un pipeline pour l’inhalation de spores et l’analyse du dépôt spatial des spores inhalées. Ce pipeline fournit des informations précieuses pour déterminer les régions stromales pertinentes du poumon affectées par l’inhalation d’arthroconidies de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Nous avons observé que les spores de Coccidioides et les particules inertes de taille similaire (données non présentées) s’accumulent dans les rég...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 needle (305185)	Fisher	305185
1 L  Screwtop Jar  (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Syringes 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Injection (xylazine sterile solution)	Akorn	59399-110-20
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Catheter with BD Vialon Catheter Material 18 G x 1.88 in	BD	381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Dye	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning 70 micron strainers	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoclonal antibody	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucose Monohydrate	Azer Scientific	ES17530-500G
High Vacuum Grease	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
Ketamine Hydrochloride	Dechra	1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wipers (4.4'' x 8.4")	VWR	21905-026
Lexer Baby Scissors	FST	14078-10
Micro-Adson Forceps	FST	11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask tissue culture flasks, T75, filter caps	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-source	https://qupath.github.io/
Silk Suture thread size 3/0	FST	18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.AP
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophobic Barrier Pen Set Of 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangular (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
White Plastic Wire Mesh	MAPORCH	789862904922
Yeast Extract	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	multichannel fluorescent microscope
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	microscopy software