保留气道中真菌孢子空间动力学的小鼠肺成像的有效方法

摘要

我们提出了一种真菌发病机制模型的方法，该方法保留了真菌孢子在肺气道中的自然定位，以便通过荧光显微镜进行分析。

摘要

当环境孢子被吸入肺部时，真菌会感染人类。肺是一个异质性器官。传导气道（包括支气管和细支气管）分支，直到终止于发生气体交换的肺泡空腔。起源于细支气管或肺泡的感染会引起不同的宿主反应和疾病表现。因此，准确了解孢子在肺部自然定位的位置，尤其是在感染后不久，扩大了研究宿主-病原体相互作用的机会。在此，我们详细介绍了感染 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子虫的小鼠肺的原位分析。传统的组织学保存方法包括用固定液对气道进行液体充气，固定液取代吸入的真菌颗粒的自然位置，将孢子从近端细支气管推到末端气腔。

相反，这种使用脉管系统灌注固定进行充气的方法保留了真菌孢子在细支气管内的生理位置。此外，我们描述了一种低温保存、包埋和成像肺标本的简单方法。我们还通过开源 QuPath 程序共享高通量计算技术，以分析真菌孢子在肺内的空间分布。这里介绍的方法简单快捷，需要最少的设备来执行，并且可以很容易地适应许多呼吸道真菌感染模型。

引言

人类每天可以从各种环境真菌中吸入多达数十亿个孢子¹。要了解我们对这些吸入孢子的屏障防御，我们必须了解这些孢子落在气道和肺实质内的精确微观解剖环境。气道的细胞组成（即上皮细胞）沿气管、支气管、细支气管和肺泡显着变化。这些不同区域中的每一个都由具有不同功能的细胞类型组成，这些细胞类型利用防御库来防止病理感染。

肺真菌孢子沉积的确切位置在柱状上皮衬里细支气管、肺泡管或肺泡² 的气道管腔之间可能有所不同。大多数临床相关的真菌种类产生直径在 1 μm 到 10 μm 之间的孢子³。这些孢子颗粒在肺中的沉积取决于几个因素，例如空气动力学、密度、电荷和泳力，这些因素会影响吸入后沉降的机制⁴。通常，大颗粒 （> 6 μm） 沉积在上气道，中等颗粒 （2-6 μm） 可以沉积在较小的气道中，小颗粒 （<2 μm） 到达肺泡区域⁵。据报道，曲霉孢子 （2-3 μm） 可到达肺泡间隙，但临床病理报告也表明支气管和细支气管疾病的负担很大⁶。由于可弯曲支气管镜检查的日益普及，烟曲霉、粗球孢子菌、念珠菌属、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌和接合菌的支气管内真菌感染也越来越受到认可⁷。小鼠曲霉菌感染的显微镜成像的最新进展还表明，支气管和细支气管等更近端的气隙可能对病理性真菌增殖承担最高的负担⁸。对宿主对肺部真菌感染反应的研究表明，细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞都作为免疫哨兵发挥着重要作用，因此阐明孢子沉积和上皮相互作用的确切位置对于未来的工作至关重要 ^2,9,10。

研究这些近端气道发病机制动力学很困难，因为标准的肺固定和切片制备技术可以将孢子从上皮衬里气道的这些近端位置移位，并将它们推向远端末端肺泡区域。通常，使用 10% 福尔马林或 4% 多聚甲醛使肺部充气并迅速使整个肺暴露于固定剂中。在准备用于冷冻切片的肺部时，一些小组将最佳切割温度 （OCT） 化合物注入肺部以提高冷冻切片性能¹¹。这些做法在正确的环境中是有用的，但我们的实验室和其他小组发现它们会从近端位置移动孢子和颗粒，从而干扰对孢子暴露的细胞类型和随后的宿主反应的解释¹²。

为了准确确定吸入真菌孢子的微观解剖定位，我们开发了一种快速、低资源的方法，用于保存真菌孢子在小鼠气道中的位置。我们采用了 Thomas 等人（2021 年）的小鼠空气充气血管灌注固定方法，其中我们减少了获得满意结果所需的设备、时间和技术技能的数量¹³。从这里描述的方法中，我们观察到 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子（大小）比以前显示的在近端积累得更多，即在远端细支气管和支气管-肺泡交界处，而不是末端肺泡。这些信息可以集中有关与肺这些区域相关的关键细胞类型及其对吸入真菌孢子的早期反应的影响的生物学问题。

研究方案

本协议中描述的所有方法均已获得罗格斯生物医学健康科学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 用细胞内荧光标记孢子

1. 在 30 °C 下，用 5 μM 的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （CFSE）、Cell Tracker Orange 或 Cell Tracker Red（或选择的细胞内染料）染色 1 x 10⁶ 个孢子 30 分钟，然后用 PBS 洗涤，并以 12,000 x g 旋转孢子 。 重复此洗涤一次。
2. 准备适当浓度的孢子接种物，使 25 μL 含有适合一只小鼠的孢子剂量。

2. 使用异氟醚麻醉通过吸入吸入小鼠接种孢子

注意:异氟醚是一种挥发性麻醉剂，必须在管道式生物安全柜或通风橱内使用。

1. 要制备异氟醚暴露罐，请将折叠的餐巾纸放入 1 L 螺口 Nalgene 染色缸中，并在餐巾纸上放置一个塑料网圈作为小鼠的平台。餐巾纸中加入 2 mL 异氟醚，盖上罐子，等待 1-2 分钟，让气体在容器中达到平衡。

图 1:孢子接种异氟醚开滴法的装置。 将折叠的餐巾纸放入 1 L 螺旋盖罐的底部，然后插入圆形塑料网作为小鼠的平台。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 在将小鼠暴露于麻醉下之前，准备装有 25 μL 接种物的移液管。将鼠标放入异氟醚容器中并倾斜容器以监测鼠标是否失去扶正反射，此时鼠标已经失去知觉并倒置。这通常需要大约 10 秒。
3. 监测呼吸频率 （RR），直到它减慢到一致的每分钟 50-80 次呼吸 （bpm），约为静息 RR 的 50%。这通常需要另外 10 秒。此时，从异氟醚罐中取出鼠标。
   注意:这是一种高浓度的异氟醚，会产生快速麻醉诱导，必须非常密切地监测小鼠。致死性异氟醚过量是一种风险，因为异氟醚的浓度是可变的，并且对异氟醚的剂量反应曲线非常陡峭。如果呼吸频率低于 50 bpm 和/或不规则，请将鼠标从异氟醚中取出，让它恢复 3-5 分钟，然后重试（最多重复尝试两次）。
4. 通过对脚趾捏无反应来确认麻醉深度。然后，将鼠标单手仰卧，让鼠标以更高的速率（从 50-60 bpm 开始）和活力定期呼吸 3-5 次。开始时，将移液管尖端放在小鼠口咽部的后部，并在吸入过程中释放接种物。
   注意:这些通过嘴巴发出的喘息声会使头部下方震动，因为需要募集辅助呼吸的肌肉。在这些喘息过程中插入移液管时，每次喘息时，嘴都应该张开。如果嘴巴没有张开，则小鼠的麻醉不充分，可能不会从口咽部吸入内容物。移液管应压住舌头，将其推向口腔底部和前部，以防止吞咽接种物。当移液管在嘴里并且老鼠被充分麻醉时，老鼠每次喘息都会张开嘴巴。
5. 用手和拇指握住鼠标，感觉小鼠胸部后部和前部是否有湿啰音，以确认接种物的吸入。

3. 小鼠的安乐死

1. 在处死时间点前 10 分钟，用 200 mg/kg 氯胺酮和 24 mg/kg 甲苯噻嗪的混合物腹膜内注射小鼠。
2. 注射后等待 10 分钟，直到小鼠进入麻醉手术平面，通过对脚趾捏无反应来确认。

4. PBS 和福尔马林灌注肺部

1. 用 70% 乙醇喷洒麻醉的小鼠。用剪刀剪回小鼠的皮肤，拉开皮肤，露出四面八方的腹膜。将鼠标上半部分的皮肤拉过头顶，从皮肤中拉出手臂。
2. 在胸骨和胸腔的下侧切开腹膜，露出腹膜。将肝脏向下移位，露出隔膜。用剪刀小心地将隔膜从肺实质上刺出，以避免在肺部本身刺穿一个洞。
   注意:无意中刺穿肺部将使随后的空气无法充气。
3. 隔膜穿刺后，空气进入胸部，使肺部塌陷。切开左侧的胸腔，露出心脏。用 30 G 针头以每 5 秒 1 mL 的速率将 5-10 mL PBS 注入右心室（以避免损坏血管），迅速美白肺部。
   注意:福尔马林是一种有害的挥发性物质，应在管道式生物安全柜或通风橱内处理。
4. 完成后，取出针头并使用新针头以相同的速率将 5 mL 10% 中性缓冲福尔马林 （NBF） 注射到右心室中。

5. 给灌注的肺充气

1. 去除胸腔的前半部分。要暴露气管，请切开颈部左右两侧的上肋骨和锁骨。注意避免在气管所在的中线附近切割。用镊子将剩余的上肋和锁骨扣在颈部中线上，然后向上拉，直到气管暴露出来。
2. 准备一根 10 厘米长的缝合线，将其拉到气管下方，并在暴露的气管下端预先打一个松散的结。准备一个带有 1 G 导管的 1 mL 空气注射器。使用 18 G 针在暴露区域上端的气管上打一个孔。
3. 将导管放入该孔中，确保相对紧密的配合以防止空气逸出。在 10 秒内缓慢将 1 mL 空气注入肺部，观察所有肺叶的肺充气情况。完全充气导致肺部略微包裹心脏并填充它们在未穿刺的横膈膜中占据的体积。
4. 拉紧气管周围的结，然后取出导管。握住气管，用钝剪刀从小鼠身上取出肺部，注意不要刺穿肺部。

6. 浸入式固定和脱水

1. 将肺放在装有 20 mL 10% NBF 的 50 mL 锥形管的顶部边缘。将缝合线保持在锥形体外，拧下盖子，倒置锥形，使肺倒悬在 20 mL NBF 中。将其在 4 °C 下放置 24-48 小时。
2. 用 PBS 冲洗肺部，然后在 4 °C 下置于 30% 蔗糖-PBS （w/v） 溶液中 72-96 小时，以使肺部脱水，为冷冻保存做准备。从蔗糖中取出肺，将肺放入具有最佳切割温度 （OCT） 培养基的低温模具中，并将样品在 -80 °C 下冷冻。

7. 冷冻切片

1. 切片前，将 OCT 冻存块中的标本平衡至低温恒温器的 -20 °C 温度 1 小时。以 20-100 μm 的厚度切块。
   注意:充气会导致标本的脆性增加，增加厚度切割可以防止切片过程中组织破损。
2. 将切片收集到载玻片上，晾干 30 分钟至 1 小时，以确保组织粘附在载玻片上。
   注意:在此阶段，载玻片可保持在 -80 °C。

8. 玻片准备和封闭

1. 将载玻片在室温 （RT） 下放入 PBS 浴（在培养皿或 Coplin 罐中）中 30 分钟，以从载玻片中取出 OCT。
   注:较厚的部分 （40-100 μm） 可能无法粘附在载玻片上，较薄的部分最好将它们平整和直立在培养皿中，而不是侧放到 Coplin 染色缸中。
2. OCT 从组织中溶解后干燥载玻片。使用抹布擦干组织标本周围载玻片周边的多余液滴。
3. 使用疏水性 Pap 笔在标本周围画一个周边，然后晾干 5 分钟。
4. 制备不含动物成分的封闭溶液的封闭缓冲液，每张载玻片含有 0.3% Tween-20 和 1:100 Fc 封闭剂，每张载玻片 300 mL。
   注:对于细胞内靶标，可使用 1% Tween-20。300 μL 的体积通常就足够了，但覆盖组织所需的体积完全取决于疏水标志物的周长大小。从这一点开始，组织不应干燥。
5. 将封闭溶液在载玻片上在 RT 下放置 1 小时。

9. 免疫染色

1. 通过吸出液体并加入 300-500 μL PBS 来清洗载玻片。重复洗涤一次。
2. 在含 0.33% Tween-20（或 1% 用于细胞内靶标）的无动物阻断剂溶液中制备一代 AlexaFluor-647 偶联的大鼠抗小鼠 EpCAM（克隆 G8.8）抗体（气道上皮标志物）。每张载玻片加入 300 μL 该溶液，并在 4 °C 下染色过夜。
   注:应凭经验测试抗体的染色浓度、时间和温度。对于大多数抗体，薄切片 （8-20 μm） 在 37 °C 下染色 30 分钟，较厚的切片 （20-100 μm） 在 4 °C 下染色过夜。如果使用未偶联抗体，洗涤 2 次（如上所述），并在经验确定的时间和温度下使用二抗荧光抗体。通常，二抗染色在 RT 下以 1:1000 稀释度进行 1 小时。
3. 从样本中取出抗体溶液，用 300 mL PBS 洗涤载玻片 5 分钟。重复此洗涤一次。擦干载玻片，去除标本和周围玻璃杯中所有多余的液体。
4. 向每块纸巾中加入一滴 RT 软固封片剂（例如 SlowFade Glass）。注意避免气泡，让瓶子倒置，然后慢慢将每一滴到纸巾上。放置适当大小的盖玻片，使其超出样品和疏水标志物的周边。

10. 通过荧光显微镜成像

1. 使用多通道荧光显微镜以无偏倚的方式扫描整个肺切片，使用具有足够分辨率的物镜来分辨单个孢子和宿主细胞（例如，Zeiss Axioscan 7 使用 NA = 0.8 或类似值的 20 倍油物镜）。
   注意:确保将激光功率和 PMT 电压增益设置为在用荧光减一 （FMO） 控制确定的背景上最大化目标的信噪比。
2. 收集足够的图像瓦片以捕获整个肺叶（例如，~200 个 400 μm x 400 μm 的瓦片）。使用显微镜软件程序（例如，Zeiss ZEN 3.7 或类似程序）导出合并的平铺图像以进行下游处理。

11. 通过 QuPath 进行空间分析

1. 在免费的开源软件^{QuPath 14} 中，创建一个项目文件并将荧光图像添加到该文件中。
2. 通过单击顶部菜单选项 Classify，然后单击 Pixel classification > Create Thresholder，将 EpCAM+ 像素分类为上皮。选择最能识别目标区域的分辨率、通道、平滑 Sigma 和阈值。将分类器保存在唯一名称下，然后选择 Create Objects （创建对象）。
3. 在新的 Create objects 窗口中，选择 New object type as Annotation。对于肺上皮，将最小物体尺寸和最小孔尺寸设置为 100 mm²。无需在此处选择 Split Objects （拆分对象 ）。选择 OK（确定）后，将创建注释，并且可以使用左上角的 Brush（画笔 ）工具通过眼睛对其进行修改。
4. 要对孢子进行分类，请使用捕获孢子的通道重复 11.3-11.4 中的步骤，并创建新的对象类型 Detection ，而不是 Annotation。将最小对象大小和最小孔尺寸设置为 0 mm²，然后选择 分割对象。
5. 要对孢子进行空间分析，请选择顶部菜单选项 Analyze > Spatial Analysis > Calculate signed distance to annotations 2D。将计算每个检测到的孢子到 EpCAM + 上皮的距离。通过顶部菜单选项 Measure > Export Measurements 导出这些测量值。

结果

这种方法最终使用生理性空气充气来保持气道不受干扰，从而产生小鼠肺的免疫荧光图像。重要的是，沿途的多个检查点将确认协议的组件已成功执行。在接种过程中，重要的是要通过感觉小鼠后胸壁上的"噼啪声"来确认接种物是被吸入的，这表明液体已进入气道。如果没有湿啰音的感觉，则可能是小鼠吞下了接种物。用 PBS 灌注小鼠肺应导致肺部出现白色斑点，然后整?...

讨论

我们已经建立了孢子吸入和分析吸入孢子空间沉积的管道。该管道提供了有价值的信息，以确定吸入 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子细胞影响的肺部相关基质区域。我们观察到球孢子菌孢子和类似大小的惰性颗粒（数据未显示）积聚在远端细支气管区域和支气管-肺泡交界处，而不是完全分散在整个肺泡气道腔内。该模型需要相对较低的设备和技术技?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 needle (305185)	Fisher	305185
1 L  Screwtop Jar  (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Syringes 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Injection (xylazine sterile solution)	Akorn	59399-110-20
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Catheter with BD Vialon Catheter Material 18 G x 1.88 in	BD	381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Dye	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning 70 micron strainers	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoclonal antibody	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucose Monohydrate	Azer Scientific	ES17530-500G
High Vacuum Grease	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
Ketamine Hydrochloride	Dechra	1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wipers (4.4'' x 8.4")	VWR	21905-026
Lexer Baby Scissors	FST	14078-10
Micro-Adson Forceps	FST	11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask tissue culture flasks, T75, filter caps	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-source	https://qupath.github.io/
Silk Suture thread size 3/0	FST	18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.AP
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophobic Barrier Pen Set Of 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangular (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
White Plastic Wire Mesh	MAPORCH	789862904922
Yeast Extract	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	multichannel fluorescent microscope
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	microscopy software