Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

Resumo

Apresentamos um método para um modelo de patogênese fúngica que preserva o posicionamento natural dos esporos fúngicos nas vias aéreas pulmonares para análise por microscopia fluorescente.

Resumo

Os fungos infectam humanos quando os esporos ambientais são inalados para os pulmões. O pulmão é um órgão heterogêneo. As vias aéreas condutoras, incluindo brônquios e bronquíolos, ramificam-se até terminar no espaço aéreo alveolar onde ocorre a troca gasosa. Infecções originadas nos bronquíolos ou alvéolos provocam respostas distintas do hospedeiro e manifestações da doença. Portanto, entender precisamente onde os esporos se localizam naturalmente nos pulmões, particularmente logo após a infecção, expande as oportunidades de investigação das interações patógeno-hospedeiro. Aqui, detalhamos uma análise in situ de pulmões de camundongos infectados com artroconídios Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ. Os métodos convencionais de preservação histológica envolvem a insuflação líquida das vias aéreas com uma solução fixadora, que desloca a localização natural das partículas fúngicas aspiradas, empurrando os esporos dos bronquíolos proximais para os espaços aéreos terminais.

Por outro lado, este método de insuflação de ar com perfusão-fixação da vasculatura sanguínea preserva a posição fisiológica dos esporos de fungos dentro dos bronquíolos. Além disso, descrevemos uma abordagem simples para criopreservar, incorporar e obter imagens de amostras pulmonares. Também compartilhamos técnicas computacionais de alto rendimento por meio do programa QuPath de código aberto para analisar a distribuição espacial de esporos de fungos no pulmão. O método apresentado aqui é simples e rápido, requer equipamento mínimo para ser executado e pode ser facilmente adaptado para uso com muitos modelos de infecção fúngica respiratória.

Introdução

Os seres humanos podem inalar até bilhões de esporos por dia de uma variedade de fungos ambientais¹. Para entender nossas defesas de barreira contra esses esporos inalados, devemos apreciar os ambientes microanatômicos precisos onde esses esporos pousam nas vias aéreas e no parênquima pulmonar. A composição celular das vias aéreas (ou seja, células epiteliais) se transforma significativamente ao longo da traqueia, brônquios, bronquíolos e alvéolos. Cada uma dessas regiões distintas é composta por diferentes tipos de células com funções discretas que dispõem de um arsenal de defesas para prevenir infecções patológicas.

A localização precisa da deposição de esporos fúngicos pulmonares pode variar entre os lúmens das vias aéreas dos bronquíolos revestidos de epitelial colunar, ductos alveolares ou alvéolos². A maioria das espécies fúngicas clinicamente relevantes produz esporos entre 1 μm e 10 μm de diâmetro³. A deposição dessas partículas de esporos no pulmão depende de vários fatores, como aerodinâmica, densidade, carga elétrica e forças foréticas, que podem influenciar o mecanismo de sedimentação após a inalação⁴. Geralmente, partículas grandes (> 6 μm) se depositam nas vias aéreas superiores, partículas médias (2-6 μm) podem se depositar nas vias aéreas menores e partículas pequenas (<2 μm) atingem a região alveolar⁵. Esporos de Aspergillus (2-3 μm) foram relatados para atingir espaços alveolares, mas relatos de patologia clínica também indicam uma carga significativa de doença brônquica e bronquiolar⁶. Há também um reconhecimento crescente de infecções fúngicas endobrônquicas de Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, espécies de Candida, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum e Zygomycetes devido à crescente popularidade da broncoscopia flexível⁷. Avanços recentes na imagem microscópica de infecções por Aspergillus em camundongos também revelaram que espaços aéreos mais proximais, como brônquios e bronquíolos, podem suportar a maior carga de proliferação fúngica patológica⁸. Pesquisas sobre a resposta do hospedeiro a infecções fúngicas pulmonares mostraram que tanto as células epiteliais bronquiolares quanto as células epiteliais alveolares desempenham papéis importantes como sentinelas imunológicas, portanto, elucidar os locais exatos de deposição de esporos e interação epitelial será vital para trabalhos futuros ^2,9,10.

Estudar a dinâmica da patogênese dessas vias aéreas proximais é difícil porque as técnicas padrão de fixação pulmonar e preparação de seccionamento podem deslocar os esporos dessas posições proximais nas vias aéreas revestidas de epitelial e empurrá-los para as regiões alveolares terminais distais. Comumente, formalina a 10% ou paraformaldeído a 4% é usado para inflar os pulmões e expor rapidamente todo o pulmão ao fixador. Ao preparar os pulmões para o crioseccionamento, alguns grupos administram o composto de temperatura ideal de corte (OCT) nos pulmões para melhorar o desempenho do criosseccionamento¹¹. Essas práticas são úteis no contexto certo, mas foram encontradas por nosso laboratório e outros grupos para deslocar esporos e partículas de locais proximais, interferindo assim nas interpretações sobre os tipos de células expostas a esporos e a subsequente resposta do hospedeiro¹².

Para estabelecer com precisão a localização microanatômica de esporos de fungos inalados, desenvolvemos um método rápido e de poucos recursos para a preservação da localização de esporos de fungos nas vias aéreas de camundongos. Adaptamos um método de fixação de perfusão vascular por insuflação de ar murino de Thomas et al. (2021), onde reduzimos a quantidade de equipamentos, tempo e habilidade técnica necessária para alcançar um resultado satisfatório¹³. A partir do método descrito aqui, observamos que os artroconídios de Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ (3-5 μm de tamanho) se acumulam mais proximalmente do que mostrado anteriormente, ou seja, em bronquíolos distais e junções bronco-alveolares em vez de alvéolos terminais. Essas informações podem focar questões biológicas sobre os tipos de células críticas associadas a essas regiões do pulmão e sua influência nas respostas precoces aos esporos de fungos inalados.

Protocolo

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Rotule os esporos com fluorescência intracelular

1. Manchar 1 x 10⁶ esporos em éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), Cell Tracker Orange ou Cell Tracker Red (ou corante intracelular de sua escolha) a 5 μM por 30 min a 30 ° C, depois lave com PBS e gire os esporos a 12.000 x g. Repita esta lavagem uma vez.
2. Prepare o inóculo de esporos na concentração apropriada para que 25 μL contenham a dose de esporos apropriada para um camundongo.

2. Inoculação de camundongo com esporos por aspiração por inalação usando anestesia com isoflurano

CUIDADO: O isoflurano é um agente anestésico volátil e deve ser usado dentro de um gabinete de biossegurança com duto ou capela de exaustão.

1. Para preparar o frasco de exposição ao isoflurano, coloque um guardanapo dobrado em um frasco Nalgene com tampa de rosca de 1 L e coloque um círculo de malha de plástico sobre o guardanapo como uma plataforma para os ratos. Adicione 2 mL de isoflurano ao guardanapo, feche o frasco e espere 1-2 min para que o gás se equilibre no recipiente.

Figura 1: Aparelho para o método de inoculação de esporos em gota aberta de isoflurano. Um guardanapo dobrado é colocado no fundo de um frasco de 1 L com tampa de rosca e, em seguida, uma malha plástica circular é inserida para atuar como uma plataforma para os ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Antes de expor o camundongo à anestesia, prepare uma pipeta com 25 μL do inóculo. Coloque o camundongo no recipiente de isoflurano e incline o recipiente para monitorar a perda do reflexo de endireitamento, onde o camundongo perdeu a consciência e está de cabeça para baixo. Isso geralmente leva cerca de 10 s.
3. Monitore a frequência respiratória (FR) até que ela diminua para 50-80 respirações consistentes por minuto (bpm), cerca de 50% da FR em repouso. Isso geralmente leva mais 10 s. Neste momento, remova o mouse do frasco de isoflurano.
   NOTA: Esta é uma alta concentração de isoflurano, que produzirá uma rápida indução da anestesia, e o camundongo deve ser monitorado de perto. A superdosagem letal de isoflurano é um risco, pois a concentração de isoflurano pode ser variável e a curva dose-resposta ao isoflurano é muito íngreme. Se a frequência respiratória cair abaixo de 50 bpm e/ou for irregular, remova o camundongo do isoflurano, deixe-o se recuperar por 3-5 minutos e tente novamente (no máximo duas tentativas repetidas).
4. Confirme a profundidade do anestésico por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé. Em seguida, posicione o mouse em decúbito dorsal com uma mão e permita que o mouse respire de 3 a 5 respirações ofegantes regulares com frequência crescente (começando em 50 a 60 bpm) e vigor. Quando isso começar, coloque a ponta da pipeta na parte posterior da orofaringe do camundongo e libere o inóculo durante a inalação.
   NOTA: Esses suspiros pela boca sacodem a cabeça inferiormente devido ao recrutamento de músculos acessórios para a respiração. Quando a pipeta é inserida durante esses suspiros, a boca deve se abrir a cada suspiro. Se a boca não abrir, o camundongo não está suficientemente anestesiado e provavelmente não inalará o conteúdo da orofaringe. A pipeta deve pressionar a língua, empurrando-a para o fundo e para a frente da boca para evitar a ingestão do inóculo. Quando a pipeta está na boca e o mouse está adequadamente anestesiado, o mouse abre a boca a cada suspiro.
5. Com a mão e o polegar segurando o mouse, sinta os crepitações nos aspectos posterior e anterior do tórax do camundongo para confirmar a inalação do inóculo.

3. Eutanásia de camundongos

1. Injete no camundongo por via intraperitoneal um coquetel de 200 mg / kg de cetamina e 24 mg / kg de xilazina 10 minutos antes do ponto de tempo do sacrifício.
2. Aguarde 10 minutos após a injeção até que o camundongo entre em um plano cirúrgico de anestesia, confirmado pela falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.

4. Perfusão de pulmões com PBS e formalina

1. Pulverize o camundongo anestesiado com etanol a 70%. Use uma tesoura para cortar a pele do camundongo e separe a pele para expor o peritônio por todos os lados. Puxe a pele da metade superior do camundongo sobre a cabeça, puxando os braços da pele.
2. Corte a membrana peritoneal no esterno e ao longo da face inferior da caixa torácica, expondo o peritônio. Desloque o fígado inferiormente, revelando o diafragma. Use uma tesoura para perfurar cuidadosamente o diafragma do parênquima pulmonar para evitar perfurar um orifício nos próprios pulmões.
   NOTA: Perfurar inadvertidamente os pulmões impossibilitará a inflação de ar subsequente.
3. Depois que o diafragma é perfurado, o ar entra no tórax, colapsando os pulmões. Corte a caixa torácica do lado esquerdo para revelar o coração. Injete 5-10 mL de PBS no ventrículo direito com uma agulha de 30 G a uma taxa de 1 mL por 5 s (para evitar danos aos vasos), clareando rapidamente os pulmões.
   CUIDADO: A formalina é uma substância volátil perigosa que deve ser manuseada dentro de um gabinete de biossegurança canalizado ou capela de exaustão.
4. Quando terminar, remova a agulha e use uma nova agulha para injetar 5 mL de formalina tamponada a 10% (NBF) no ventrículo direito na mesma taxa.

5. Inflar o ar do pulmão perfundido

1. Remova a metade anterior da caixa torácica. Para expor a traqueia, corte as costelas superiores e as clavículas à direita e à esquerda do pescoço. Tome cuidado para evitar cortar perto da linha média onde a traqueia ficará. Com uma pinça, aperte as costelas e clavículas restantes na linha média do pescoço e puxe superiormente até que a traqueia fique exposta.
2. Prepare um fio de sutura de 10 cm de comprimento, puxe-o sob a traqueia e pré-amarre um nó solto na extremidade inferior da traqueia exposta. Prepare uma seringa de ar de 1 mL com um cateter de 18 G. Use uma agulha de 18 G para fazer um orifício na traqueia na extremidade superior da região exposta.
3. Coloque o cateter nesse orifício, garantindo um ajuste relativamente apertado para evitar que o ar escape. Injete lentamente 1 mL de ar nos pulmões ao longo de 10 s, observando a inflação pulmonar de todos os lobos. A inflação total resulta nos pulmões envolvendo levemente o coração e preenchendo o volume que ocupam no diafragma não perfurado.
4. Puxe o nó firmemente ao redor da traqueia e remova o cateter. Segure a traqueia e use uma tesoura cega para remover os pulmões do mouse, tomando cuidado para não perfurar o pulmão.

6. Fixação por imersão e desidratação

1. Coloque os pulmões na borda superior de um tubo cônico de 50 mL cheio de 20 mL de NBF a 10%. Mantenha os fios de sutura fora da cônica, aperte a tampa e inverta a cônica de forma que os pulmões fiquem suspensos de cabeça para baixo em 20 mL de NBF. Coloque-o a 4 °C por 24-48 h.
2. Lave os pulmões em PBS e coloque em uma solução de sacarose-PBS a 30% (p / v) por 72-96 h a 4 ° C para desidratar os pulmões em preparação para a criopreservação. Retirar os pulmões da sacarose, colocá-los num criomoldor com meio de temperatura de corte óptimo (OCT) e congelar a amostra a -80 °C.

7. Crioseccionamento

1. Equilibrar os provetes em crioblocos OCT à temperatura de -20 °C do criostato durante 1 h antes do seccionamento. Corte os blocos em espessuras de 20-100 μm.
   NOTA: A insuflação do ar pode levar ao aumento da fragilidade da amostra, e o corte com espessura aumentada pode evitar a quebra do tecido durante o seccionamento.
2. Colete as seções em lâminas de vidro e deixe secar por 30 min a 1 h para garantir a aderência do tecido à lâmina.
   NOTA: Os slides podem ser mantidos a -80 °C nesta fase.

8. Preparação e bloqueio de slides

1. Coloque as lâminas no banho PBS (em um prato ou frasco de Coplin) por 30 min em temperatura ambiente (RT) para remover o OCT das lâminas.
   NOTA: Seções mais grossas (40-100 μm) podem não aderir a lâminas de vidro, bem como seções mais finas, por isso é melhor mantê-las planas e verticais em um prato em vez de colocadas de lado em um frasco Coplin.
2. Seque as lâminas após a OCT ter se dissolvido do tecido. Use um lenço para secar o excesso de gotículas do perímetro da lâmina ao redor da amostra de tecido.
3. Use uma caneta de Papanicolau hidrofóbica para desenhar um perímetro ao redor da amostra e deixe secar por 5 min.
4. Prepare um tampão de bloqueio de solução de bloqueio sem animais com 0,3% de Tween-20 e 1:100 Fc Block em 300 mL por lâmina.
   NOTA: Para alvos intracelulares, 1% de Tween-20 pode ser usado. Um volume de 300 μL geralmente é suficiente, mas o volume necessário para cobrir totalmente o tecido depende do tamanho do perímetro do marcador hidrofóbico. O tecido não deve secar a partir deste ponto.
5. Deixe a solução de bloqueio nas lâminas por 1 h em RT.

9. Imunocoloração

1. Lave a lâmina pipetando o fluido e adicionando 300-500 μL de PBS. Repita a lavagem uma vez.
2. Prepare o anticorpo primário AlexaFluor-647 conjugado com rato anti-camundongo EpCAM (clone G8.8) (marcador epitelial das vias aéreas) em solução bloqueadora sem animais com 0,33% de Tween-20 (ou 1% para alvos intracelulares). Adicionar 300 μL desta solução por lâmina e corar durante a noite a 4 °C.
   NOTA: Os anticorpos devem ser testados empiricamente quanto à concentração, tempo e temperatura da coloração. As secções finas (8-20 μm) são coradas durante 30 min a 37 °C e as secções mais espessas (20-100 μm) a 4 °C durante a noite, utilizando diluições de 1:100 para a maioria dos anticorpos. Se estiver usando anticorpos não conjugados, lave 2x (como acima) e aplique um anticorpo fluorescente secundário por um tempo e temperatura determinados empiricamente. Geralmente, a coloração de anticorpos secundários é feita em RT por 1 h na diluição de 1:1000.
3. Remova a solução de anticorpos da amostra e lave a lâmina com 300 mL de PBS por 5 min. Repita esta lavagem uma vez. Seque as lâminas, removendo todo o excesso de fluido da amostra e do vidro circundante.
4. Adicione uma gota de mídia de montagem RT soft set (por exemplo, SlowFade Glass) a cada pedaço de tecido. Tome cuidado para evitar bolhas, deixando a garrafa assentar de cabeça para baixo e deixando cair lentamente cada gota sobre os lenços. Coloque uma lamínula de tamanho apropriado para se estender além do sample e do perímetro do marcador hidrofóbico.

10. Imagem por microscopia fluorescente

1. Use um microscópio fluorescente multicanal para escanear seções pulmonares inteiras de maneira imparcial usando uma objetiva com resolução suficiente para resolver esporos individuais e células hospedeiras (por exemplo, Zeiss Axioscan 7 usando objetiva de óleo 20x com NA = 0,8 ou similar).
   NOTA: Certifique-se de que a potência do laser e o ganho de tensão PMT estejam definidos para maximizar as relações sinal-ruído do alvo sobre o fundo determinado com um controle de fluorescência menos um (FMO).
2. Colete blocos de imagem suficientes para capturar todo o lobo pulmonar (por exemplo, ~ 200 blocos de tamanho 400 μm x 400 μm). Use o programa de software do microscópio (por exemplo, Zeiss ZEN 3.7 ou similar) para exportar a imagem do bloco mesclado para processamento posterior.

11. Análise espacial via QuPath

1. No QuPath, um software gratuito de código aberto¹⁴, crie um arquivo de projeto e adicione as imagens fluorescentes ao arquivo.
2. Classifique os pixels do EpCAM+ como epitélio clicando na opção do menu superior Classificar e, em seguida, em Classificação de pixels > Criar limiar. Selecione a resolução, o canal, o sigma de suavização e o valor limite que melhor identifica a região de destino. Salve o classificador com um nome exclusivo e selecione Criar Objetos.
3. Na nova janela Criar objetos , selecione Novo tipo de objeto como Anotação. Para o epitélio pulmonar, defina o tamanho mínimo do objeto e o tamanho mínimo do orifício para 100 mm². Não há necessidade de selecionar Dividir objetos aqui. Depois de selecionar OK, as anotações serão criadas e podem ser modificadas a olho nu usando a ferramenta Pincel na área superior esquerda.
4. Para classificar os esporos, repita as etapas de 11.3 a 11.4 usando o canal no qual os esporos foram capturados e faça o novo tipo de objeto Detecção em vez de Anotação. Defina o tamanho mínimo do objeto e o tamanho mínimo do furo como 0 mm² e selecione Dividir objetos.
5. Para realizar a análise espacial dos esporos, selecione a opção do menu superior Analisar > Análise espacial > Calcular distância assinada para anotações 2D. As distâncias até o epitélio EpCAM+ serão calculadas para cada esporo detectado. Exporte-os através da opção do menu superior Medir > Exportar Medidas.

Resultados

Em última análise, esse método produz imagens imunofluorescentes de pulmões de camundongos usando insuflação fisiológica de ar para deixar as vias aéreas intactas. É importante ressaltar que vários pontos de verificação ao longo do caminho confirmarão que os componentes do protocolo foram executados com sucesso. Durante a inoculação, é importante confirmar que o inóculo foi aspirado sentindo "crepitações" na parede torácica posterior do camundongo que indicam que o l?...

Discussão

Estabelecemos um pipeline para inalação de esporos e análise da deposição espacial dos esporos inalados. Este pipeline fornece informações valiosas para determinar as regiões estromais relevantes do pulmão afetadas pela inalação de artroconídios Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ. Observamos que esporos de Coccidioides e partículas inertes de tamanho semelhante (dados não mostrados) se acumulam em regiões bronquiolares distais e junções bronco-...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 needle (305185)	Fisher	305185
1 L  Screwtop Jar  (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Syringes 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Injection (xylazine sterile solution)	Akorn	59399-110-20
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Catheter with BD Vialon Catheter Material 18 G x 1.88 in	BD	381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Dye	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning 70 micron strainers	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoclonal antibody	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucose Monohydrate	Azer Scientific	ES17530-500G
High Vacuum Grease	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
Ketamine Hydrochloride	Dechra	1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wipers (4.4'' x 8.4")	VWR	21905-026
Lexer Baby Scissors	FST	14078-10
Micro-Adson Forceps	FST	11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask tissue culture flasks, T75, filter caps	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-source	https://qupath.github.io/
Silk Suture thread size 3/0	FST	18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.AP
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophobic Barrier Pen Set Of 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangular (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
White Plastic Wire Mesh	MAPORCH	789862904922
Yeast Extract	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	multichannel fluorescent microscope
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	microscopy software