気道内の真菌胞子の空間動態を保存するマウス肺の効率的なイメージング法

要約

蛍光顕微鏡による分析のために、肺気道内の真菌胞子の自然な位置を保持する真菌病因モデルの方法を提示します。

要約

真菌は、環境胞子が肺に吸い込まれると人間に感染します。肺は不均一な器官です。気管支や細気管支を含む伝導性気道は、ガス交換が起こる肺胞空域で終了するまで分岐します。細気管支または肺胞に由来する感染症は、明確な宿主反応と疾患症状を引き起こします。したがって、特に感染直後に、胞子が肺のどこに自然に位置するかを正確に理解することで、宿主と病原体の相互作用を研究する機会が広がります。ここでは、 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidiaに感染したマウスの肺のin-situ分析について詳しく説明します。組織学的保存のための従来の方法は、固定液で気道を液体で膨らませることを含み、吸引された真菌粒子の自然な位置を移動させ、胞子を近位細気管支から終末空域に押し出します。

逆に、血液血管系灌流固定による空気膨張のこの方法は、細気管支内の真菌胞子の生理学的位置を維持します。さらに、肺標本の凍結保存、埋め込み、イメージングの簡単なアプローチについても説明します。また、オープンソースのQuPathプログラムを通じて、肺内の真菌胞子の空間分布を解析するハイスループット計算技術も共有しています。ここで紹介する方法は、シンプルで迅速で、最小限の機器で実施でき、多くの呼吸器真菌感染症モデルでの使用に容易に適応できます。

概要

人間は、さまざまな環境真菌から1日あたり最大数十億の胞子を吸い込むことができます¹。これらの吸入胞子に対するバリア防御を理解するには、これらの胞子が気道と肺実質内に着地する正確な微小解剖学的環境を理解する必要があります。気道の細胞組成(すなわち、上皮細胞)は、気管、気管支、細気管支、および肺胞に沿って大きく変化します。これらの異なる領域のそれぞれは、病理学的感染を防ぐための防御の武器庫を利用する個別の機能を持つ異なる細胞タイプで構成されています。

肺真菌胞子沈着の正確な位置は、円柱上皮に裏打ちされた細気管支の気道内腔、肺胞管、または肺胞²の間で異なる可能性があります。臨床的に関連するほとんどの真菌種は、直径1μmから10μmの胞子を生成します³。これらの胞子粒子の肺への沈着は、空気力学、密度、電荷、光力などのいくつかの要因に依存し、吸入後の沈降のメカニズムに影響を与える可能性があります⁴。一般に、大きな粒子(>6μm)は上気道に沈着し、中型の粒子(2〜6μm)はより小さな気道に沈着し、小さな粒子(<2μm)は肺胞領域⁵に到達します。アスペルギルス属の胞子(2-3μm)は肺胞腔に到達することが報告されていますが、臨床病理学の報告では、気管支および細気管支疾患の重大な負担も示されています⁶。また、軟性気管^支鏡検査の人気が高まっているため、Aspergillus fumigatus、Coccidioides immitis、Candida species、Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、およびZygomycetesの気管支内真菌感染症の認識も高まっています7。マウスのアスペルギルス感染症の顕微鏡イメージングの最近の進歩は、気管支や細気管支などのより近位の空域が病的真菌増殖に対して最も高い負担を負う可能性があることも明らかに^{しています8。}肺真菌感染症に対する宿主応答に関する研究は、細気管支上皮細胞と肺胞上皮細胞の両方が免疫センチネルとして重要な役割を果たしていることを示しており、胞子沈着と上皮相互作用の正確な部位を解明することは、将来の研究にとって不可欠です^2,9,10。

標準的な肺固定および切片調製技術により、上皮が並ぶ気道のこれらの近位位置から胞子を移動させ、遠位終末肺胞領域に押し出すことができるため、これらの近位気道の病因動態を研究することは困難です。一般的に、10%ホルマリンまたは4%パラホルムアルデヒドを使用して肺を膨らませ、肺全体を固定剤に急速にさらします。凍結切片のために肺を準備するとき、一部のグループは、凍結切片の性能を改善するために、最適な切断温度(OCT)化合物を肺に投与します¹¹。これらの慣行は、正しい文脈では有用であるが、我々の研究室や他のグループによって、胞子や粒子を近位位置から移動させることが分かっており、それによって胞子に曝露された細胞型とその後の宿主応答に関する解釈に干渉することがわかっている¹²。

吸入した真菌胞子の微小解剖学的局在を正確に確立するために、マウスの気道における真菌胞子の位置を保存するための迅速で低資源の方法を開発しました。Thomas et al. (2021) のマウス空気膨張血管灌流固定法を採用し、満足のいく結果を達成するために必要な機器、時間、および技術的スキルの量を削減しました¹³。ここで説明した方法から、 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia(サイズ3-5 μm)は、以前に示したよりも近位、すなわち末端肺胞ではなく遠位細気管支および気管支-肺胞接合部に蓄積することが観察されました。この情報は、肺のこれらの領域に関連する重要な細胞型と、吸入された真菌胞子に対する初期の応答に対するそれらの影響に関する生物学的な問題に焦点を当てることができます。

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての方法は、ラトガース大学生物医学健康科学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 細胞内蛍光による胞子の標識

1. カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)、Cell Tracker Orange、またはCell Tracker Red(または任意の細胞内色素)で1 x 10⁶ 個の胞子を5 μMで30分間、30°Cで染色し、PBSで洗浄し、胞子を12,000 x gで回転させます 。 この洗浄を一度繰り返します。
2. 25 μLが1匹のマウスに適切な胞子用量を含むように、適切な濃度で胞子接種物を調製します。

2. イソフルラン麻酔を用いた吸引吸入によるマウス胞子の接種

注意:イソフルランは揮発性麻酔薬であり、ダクト付きバイオセーフティキャビネットまたはヒュームフード内で使用する必要があります。

1. イソフルラン曝露ジャーを調製するには、折りたたんだナプキンを 1 L のスクリュートップ Nalgene ジャーに入れ、マウスのプラットフォームとしてナプキンの上にプラスチックメッシュの円を置きます。ナプキンに2mLのイソフルランを加え、瓶を閉じ、ガスが容器内で平衡化するのを1〜2分待ちます。

図1:イソフルランオープンドロップ法による胞子接種の装置。 折りたたまれたナプキンを1Lスクリュートップジャーの底に置き、次に円形のプラスチックメッシュを挿入してマウスのプラットフォームとして機能します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. マウスを麻酔にさらす前に、25 μLの接種物を含むピペットを準備します。マウスをイソフルラン容器に入れ、容器を傾けて、マウスが意識を失い、逆さまになっている立ち上がり反射の喪失を監視します。これには通常約 10 秒かかります。
3. 呼吸数 (RR) が安定して 50-80 呼吸/分 (bpm) に減速するまで、安静時 RR の約 50% まで監視します。通常、これにはさらに 10 秒かかります。このとき、マウスをイソフルランジャーから取り出します。
   注:これは高濃度のイソフルランであり、麻酔の迅速な導入を引き起こし、マウスは非常に注意深く監視する必要があります。イソフルランの濃度は変動する可能性があり、イソフルランに対する用量反応曲線は非常に急であるため、致命的なイソフルランの過剰摂取はリスクです。.呼吸数が50 bpmを下回ったり、不規則な場合は、マウスをイソフルランから取り出し、3〜5分間回復させてから、再試行してください(最大2回の繰り返し試行)。
4. つま先の挟み込みに対する反応の欠如により、麻酔の深さを確認します。次に、マウスを片手で仰臥位に置き、マウスが3〜5回定期的に息を吐き、速度(50〜60 bpmから開始)と活力を増加させます。これが始まると、ピペットの先端をマウスの中咽頭の後部に配置し、吸入中に接種物を放出します。
   注:口からのこれらのあえぎは、呼吸のための付属筋肉の動員により、頭を劣って揺さぶります。これらのあえぎの間にピペットを挿入すると、あえぎごとに口が開くはずです。口が開かない場合、マウスの麻酔が不十分であり、中咽頭から内容物を吸い込まない可能性があります。ピペットは舌を押し下げ、接種物の嚥下を防ぐために口の底と前に向かって押します。ピペットが口の中にあり、マウスが適切に麻酔されているとき、マウスはあえぎごとに口を開けます。
5. マウスを握った手と親指で、マウスの胸部の後面と前面にパチパチという音を感じて、接種物の吸入を確認します。

3. マウスの安楽死

1. 犠牲時点の10分前に、200 mg / kgケタミンと24 mg / kgキシラジンのカクテルをマウス腹腔内に注射します。.
2. マウスが麻酔の手術面に入るまで、注射後10分待ちます。これは、つま先のつま先つまみに対する反応の欠如によって確認されます。

4. PBSとホルマリンによる肺の灌流

1. 麻酔をかけたマウスに70%エタノールを噴霧します。はさみを使用してマウスの皮膚を切り取り、皮膚を引き離して腹膜を四方に露出させます。マウスの上半分から皮膚を頭の上に引っ張り、皮膚から腕を引き抜きます。
2. 胸骨と胸郭の下面に沿って腹膜を切断し、腹膜を露出させます。肝臓を下に変位させ、横隔膜を明らかにします。はさみを使用して、肺の実質から離れて横隔膜を慎重に穿刺し、肺自体に穴を開けないようにします。
   注:誤って肺に穴を開けると、その後の空気の膨張が不可能になります。
3. 横隔膜に穴を開けると、空気が胸部に入り、肺が崩壊します。左側の胸郭を切って心臓を露出させます。50Gの針で5〜10mLのPBSを5秒あたり1mLの割合で右心室に注入し(血管の損傷を防ぐため)、肺を急速に白くします。
   注意: ホルマリンは危険な揮発性物質であり、ダクト付きのバイオセーフティキャビネットまたはヒュームフード内で取り扱う必要があります。
4. 終了したら、針を取り外し、新しい針を使用して、5 mLの10%中性緩衝ホルマリン(NBF)を同じ速度で右心室に注入します。

5.灌流された肺を空気で膨らませる

1. 胸郭の前半分を取り外します。気管を露出させるには、首の左右にある上肋骨と鎖骨をカットします。気管が横たわる正中線付近で切断しないように注意してください。鉗子で、首の正中線に残っている上部の肋骨と鎖骨をつかみ、気管が露出するまで上方向に引っ張ります。
2. 長さ10cmの縫合糸を用意し、気管の下に引っ張り、露出した気管の下端で緩い結び目をあらかじめ結びます。18Gのカテーテルで1mLの空気のシリンジを準備します。18Gの針を使用して、露出領域の上端にある気管に穴を開けます。
3. カテーテルをその穴に挿入し、空気が逃げるのを防ぐために比較的しっかりとフィットするようにします。1 mLの空気を10秒間ゆっくりと肺に注入し、すべての葉の肺の膨張を監視します。.完全に膨張すると、肺が心臓をわずかに包み込み、穿刺されていない横隔膜で肺が占める体積が満たされます。
4. 気管の周りの結び目をしっかりと引っ張り、カテーテルを取り外します。気管を保持し、鈍いハサミを使用してマウスから肺を取り出し、肺に穴を開けないように注意してください。

6.浸漬固定と脱水

1. 20 mLの10%NBFで満たされた50 mLの円錐形チューブの上端に肺を置きます。.縫合糸を円錐の外側に保ち、キャップをねじ込み、円錐を反転させて、肺が20mLのNBFで逆さまに吊り下げられるようにします。4°Cで24〜48時間置きます。
2. PBSで肺をすすぎ、次に30%ショ糖PBS(w / v)溶液に4°Cで72〜96時間入れて、凍結保存の準備として肺を脱水します。ショ糖から肺を取り出し、肺を最適な切断温度(OCT)培地のクライオモールドに入れ、試料を-80°Cで凍結します。

7.クライオセクショニング

1. OCTクライオブロック内の試料をクライオスタットの-20°C温度まで平衡化してから、切片化に1時間かかります。20-100 μmの厚さでブロックを切片にします。
   注:空気の膨張は試料の脆弱性を増大させる可能性があり、厚さを増して切断すると、切片作成中の組織の破損を防ぐことができます。
2. 切片をスライドガラスに集め、30分から1時間乾燥させて、スライドへの組織の付着を確認します。
   注:この段階では、スライドを-80°Cで保持できます。

8. スライドの準備とブロッキング

1. スライドをPBSバス(皿またはCoplinジャー)に室温(RT)で30分間入れて、スライドからOCTを取り除きます。
   注:厚いセクション(40〜100μm)は、薄いセクションと同様にスライドガラスに付着しない可能性があるため、Coplinジャーに横に置くのではなく、皿の中で平らで直立させておくのが最善です。
2. OCTが組織から溶解した後、スライドを乾燥させます。ワイプを使用して、組織標本の周りのスライドの周囲から余分な液滴を乾かします。
3. 疎水性のパップペンを使用して標本の周囲に周囲を描き、5分間乾燥させます。
4. 0.3% Tween-20および1:100 Fc Blockを含むアニマルフリーブロッキング溶液のブロッキングバッファーを調製します。これは、スライドあたり300 mLです。
   注:細胞内標的には、1%Tween-20を使用できます。通常、300 μLの容量で十分ですが、組織を完全に覆うために必要な容量は、疎水性マーカーの周囲サイズによって異なります。この時点から組織は乾燥してはいけません。
5. ブロッキング溶液をスライド上にRTで1時間放置します。

9. 免疫染色

1. 液体をピペッティングで取り除き、300〜500μLのPBSを加えてスライドを洗浄します。一度洗濯を繰り返します。
2. 0.33% Tween-20 (または細胞内標的の場合は 1%) のアニマルフリーブロッカー溶液で、一次 AlexaFluor-647 標識ラット抗マウス EpCAM (クローン G8.8) 抗体 (気道上皮マーカー) を調製します。この溶液のスライドあたり300μLを加え、4°Cで一晩染色します。
   注:抗体は、染色濃度、時間、および温度について経験的に試験する必要があります。ほとんどの抗体について、薄い切片(8-20 μm)を37 °Cで30分間染色し、厚い切片(20-100 μm)を4 °Cで一晩染色します。非標識抗体を使用する場合は、2回洗浄し(上記の通り)、二次蛍光抗体を経験的に決定した時間と温度で塗布します。一般に、二次抗体の染色は、室温で1時間、希釈倍率1:1000で行います。
3. 抗体溶液を検体から取り出し、スライドをPBS300 mLで5分間洗浄します。この洗浄を一度繰り返します。スライドを乾燥させ、試験片と周囲のガラスから余分な液体をすべて取り除きます。
4. 各ティッシュペーパーにRTソフトセット封入剤(SlowFade Glassなど)を1滴加えます。泡が入らないように注意して、ボトルを逆さまにして落ち着かせ、一滴一滴をゆっくりとティッシュに落とします。適切なサイズのカバースリップを、サンプルと疎水性マーカーの周囲を超えて伸びるように配置します。

10. 蛍光顕微鏡によるイメージング

1. マルチチャンネル蛍光顕微鏡を使用して、個々の胞子と宿主細胞を分離するのに十分な解像度の対物レンズを使用して、肺切片全体を偏りなくスキャンします(例:NA = 0.8の20倍油対物レンズを使用したZeiss Axioscan 7など)。
   注意: レーザー出力とPMT電圧ゲインが、蛍光マイナス1(FMO)コントロールで決定されたバックグラウンドに対するターゲットの信号対雑音比を最大化するように設定されていることを確認してください。
2. 肺葉全体をキャプチャするのに十分な画像タイルを収集します(例:サイズ400 μm x 400 μmのタイルを~200枚)。顕微鏡ソフトウェアプログラム(Zeiss ZEN 3.7など)を使用して、マージされたタイル画像をダウンストリーム処理用にエクスポートします。

11. QuPathによる空間解析

1. 無料のオープンソースソフトウェア^{であるQuPath14}で、プロジェクトファイルを作成し、蛍光画像をファイルに追加します。
2. トップメニューオプションの [分類]をクリックし、[ ピクセル分類]>[しきい値の作成]をクリックして、EpCAM+ピクセルを上皮として分類します。ターゲット領域を最適に識別する解像度、チャネル、スムージング シグマ、およびしきい値を選択します。分類子を一意の名前で保存し、[ オブジェクトの作成] を選択します。
3. 新しい [オブジェクトの作成 ] ウィンドウで、[ 新しいオブジェクト タイプ ] として [注釈] を選択します。肺上皮の場合、最小オブジェクトサイズと最小穴サイズを100 mm²に設定します。ここで [Split Objects ] を選択する必要はありません。 [OK]を選択すると、注釈が作成され、左上の領域にある ブラシ ツールを使用して目視で変更できます。
4. 胞子を分類するには、胞子が捕捉されたチャネルを使用して 11.3 から 11.4 の手順を繰り返し、新しいオブジェクト タイプを [アノテーション] ではなく [検出] にします。最小オブジェクト サイズと最小穴サイズを 0 mm² に設定し、[オブジェクトの分割]を選択します。
5. 胞子の空間分析を行うには、トップ メニュー オプションの [分析] > [空間分析] > [注釈 2D までの符号付き距離を計算] を選択します。EpCAM+ 上皮までの距離は、検出された胞子ごとに計算されます。これらをトップメニューオプションの 「測定」>「測定値のエクスポート」からエクスポートします。

結果

この方法では、最終的に生理学的な空気膨張を使用してマウスの肺の免疫蛍光画像を生成し、気道を乱さないようにします。重要なのは、途中の複数のチェックポイントによって、プロトコルのコンポーネントが正常に実行されたことを確認することです。接種中は、マウスの後胸壁に液体が気道に入ったことを示す「パチパチ音」を感じることで、接種物が吸引さ...

ディスカッション

胞子の吸入と吸入された胞子の空間沈着の解析のためのパイプラインを確立しました。このパイプラインは、Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia の吸入によって影響を受ける肺の関連する間質領域を決定するための貴重な情報を提供します。コクシジオイデスの胞子および同程度の大きさの不活性粒子(データは示さず)が、肺胞気道内腔全体に完全...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 needle (305185)	Fisher	305185
1 L  Screwtop Jar  (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Syringes 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Injection (xylazine sterile solution)	Akorn	59399-110-20
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Catheter with BD Vialon Catheter Material 18 G x 1.88 in	BD	381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Dye	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning 70 micron strainers	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoclonal antibody	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucose Monohydrate	Azer Scientific	ES17530-500G
High Vacuum Grease	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
Ketamine Hydrochloride	Dechra	1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wipers (4.4'' x 8.4")	VWR	21905-026
Lexer Baby Scissors	FST	14078-10
Micro-Adson Forceps	FST	11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask tissue culture flasks, T75, filter caps	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-source	https://qupath.github.io/
Silk Suture thread size 3/0	FST	18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.AP
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophobic Barrier Pen Set Of 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangular (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
White Plastic Wire Mesh	MAPORCH	789862904922
Yeast Extract	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	multichannel fluorescent microscope
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	microscopy software