פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

Summary

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

Abstract

ראסופתיות הן תסמונות גנטיות הנגרמות על ידי פעילות יתר של ERK וכתוצאה מכך מחלות רב מערכתיות שעלולות להוביל גם לנטייה לסרטן. למרות הטרוגניות גנטית רחבה, מוטציות בעלייה בתפקוד של קו הנבט בווסתים מרכזיים של מסלול RAS-MAPK עומדות בבסיס רוב המקרים, והודות לטכניקות ריצוף מתקדמות, ממשיכים לזהות וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים המשפיעים על מסלול RAS-MAPK. אימות תפקודי של הפתוגניות של וריאנטים אלה, החיוני לאבחון מדויק, דורש פרוטוקולים מהירים ואמינים, רצוי in vivo. בהתחשב במיעוט הטיפולים היעילים בילדות המוקדמת, פרוטוקולים כאלה, במיוחד אם ניתנים להרחבה במודלים חסכוניים של בעלי חיים, יכולים להיות חיוניים בהצעת קרקע פרה-קלינית למיצוב מחדש של תרופות.

כאן אנו מתארים צעד אחר צעד את הפרוטוקול לייצור מהיר של מודלים חולפים של RASopathy בעוברי דג זברה ובדיקה ישירה של שינויים בפעילות ERK הקשורים למחלות חיות המתרחשים כבר במהלך הקיבה באמצעות הדמיית העברת אנרגיית תהודה Förster (FRET) מולטי-ספקטרלית בזמן אמת. הפרוטוקול משתמש בכתב ERK טרנסגני שהוקם לאחרונה ושולב בחומרה של מיקרוסקופים מסחריים. אנו מספקים יישום לדוגמה למודלים של דג זברה של תסמונת נונן (NS) המתקבלים על ידי ביטוי של Shp2^D61G. אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת רישום של שינוי אות ERK במודל הדגים של NS לפני ואחרי אפנון אותות פרמקולוגיים על ידי מעכבי MEK במינון נמוך. אנו מפרטים כיצד ליצור, לאחזר ולהעריך אותות FRET רציומטריים מרכישות מולטי-ספקטרליות לפני ואחרי הטיפול וכיצד להצליב את התוצאות באמצעות אימונופלואורסצנציה קלאסית על עוברים שלמים בשלבים מוקדמים. לאחר מכן אנו מתארים כיצד, באמצעות בחינת פרמטרים מורפומטריים סטנדרטיים, לשאול שינויים מאוחרים בצורת העובר, המעידים על פגיעה כתוצאה מהקיבה, באותם עוברים שפעילות ה-ERK שלהם מוערכת על ידי FRET חי 6 שעות לאחר ההפריה.

Introduction

ראסופתיה היא תסמונות גנטיות הפוגעות בהתפתחות תקינה ומשפיעות על איברים ורקמות שונות. מצבים אלה נגרמים לרוב על ידי מוטציות בעלייה בתפקוד (GoF) בקו הנבט בגנים ובשחקנים המרכזיים המעורבים באיתות RAS/MAK, וכתוצאה מכך פעילות יתר (זרחון מוגבר) של הקינאז המווסת על ידי אות חוץ-תאי (ERK). ERK מווסת כמה תהליכים בסיסיים חשובים במהלך ההתפתחות - צמיחת רקמות - על ידי העברה לגרעין ^1,2. מוטציות סומטיות בגנים המעורבים במסלול RAS-MAPK הן האירועים השכיחים ביותר המובילים לסרטן³. לפיכך, באופן לא מפתיע, נטייה לסרטן נצפית גם ב-RASopathies. תסמונת נונן (NS), המאופיינת בעיכוב התפתחותי, קומה נמוכה, ליקויים קוגניטיביים בחומרה משתנה וקרדיומיופתיה, היא הצורה הנפוצה ביותר של RASopathy². ברוב המקרים, המחלה נגרמת על ידי מוטציות GoF ב-PTPN11, גן ה-RASopathy הראשון שהתגלה בתחילת שנת 2000⁴ המקודד לחלבון טירוזין פוספטאז SHP2, הפועל כמווסת חיובי של המסלול.

מאז, הודות לשימוש האקספוננציאלי בגישות ריצוף אקסום בחולים לא מאובחנים, וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים המשפיעים על גורמים המעורבים ב-RAS-MAPK, וככל הנראה קשורים לצורות שונות של RASopathies, ממשיכים להתגלות וממתינים לאפיון תפקודי לריבוד יעיל של חולים². כדי להשיג מטרה זו, נדרשים פרוטוקולים ניסיוניים המבטיחים אימות פונקציונלי מהיר ואינפורמטיבי ברמת האורגניזם. שימוש במודלים קלאסיים וסטנדרטיים של יונקים לבדיקת וריאנטים בעלי משמעות לא ידועה יהיה יקר, גוזל זמן רב וידרוש שיטות פולשניות בבעלי חיים גדולים שאינם שקופים. אסטרטגיה כזו בבירור אינה תואמת את הדרישה לבדיקות מהירות, בהתחשב בנטל החברתי המיוצג על ידי חולי RASopathy עניים או לא מאובחנים, כיום ללא טיפול או טיפול. פרוטוקולים להערכה כמותית של תכונות פנוטיפיות מרכזיות ומתאמים מולקולריים באורגניזמים שלמים ישמשו גם להאצת התרגום הקליני האפשרי של תרופות שעשויות להיות זמינות לחולי RASopathy על ידי ייעוד מחדש/מיקום מחדש.

דג הזברה הוא מודל אידיאלי לחקר מחלות המשפיעות על התפתחות מוקדמת. בתור התחלה, דג הזברה חולק רמה גבוהה של הומולוגיה גנטית עם בני אדם. הפוריות הגבוהה של דגים בוגרים מביאה לייצור גדול של עוברים קטנים ומתפתחים במהירות. העוברים שקופים בשלבים מוקדמים, כך שניתן לדמיין תהליכים התפתחותיים עיקריים - אפיבוליה, קיבה, צירים ויצירת תוכנית גוף - ללא מאמץ באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית. בנוסף, הזמינות של קווים טרנסגניים שניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחר התנהגות תאית ספציפית ואירועים מולקולריים דינמיים במרחב ובזמן במהלך ההתפתחות, בשילוב עם טכניקות מתקדמות ליצירת מודלים גנטיים, היא ללא תחרות. יתר על כן, ניתן להעריך קריאות פנוטיפיות ברמות מרובות בדגי הזברה (מפגמים אורגניזמים ועד פגמים תאיים), וכבר נקבעו בדיקות ייעודיות למספר מחלות, כולל RASopathies⁵. יתר על כן, שיטות טבילה פשוטות יחסית למתן תרופות בשלבים המוקדמים, לפחות עבור תרכובות מסיסות במים, מאפשרות בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה in vivo בפורמט של 96 בארות.

מנקודת מבט מולקולרית, מחקרים המשתמשים בגישות סטנדרטיות, כגון אימונוהיסטוכימיה ואימונובלוט, מדגימים היטב את המתאם בין הפעלת ERK לבין פגמים התפתחותיים הקשורים ל-RASopathy בעוברי דגים ^6,7. החיישן הביולוגי FRET מסוג EKAR שפותח לאחרונה בדגי זברה (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) מספק כלי אמין in vivo לרישום הפעלת ERK במהלך האמבריוגנזה באופן מרחבי-זמני. לפיכך, זה יכול להיות בעל ערך להערכה טובה יותר של שינויים דינמיים ב-ERK ומודולציות פרמקולוגיות במודלים של דגי RASopathy.

בחיישן Teen , מצע ERK ספציפי במדווח עובר זרחן עם הפעלת ERK, מה שמפעיל שינוי קונפורמציה שמביא לסביבה הקרובה את תורם ה-CFP הפלואורסצנטי (D) ואת מקבל ה-Ypet הפלואורסצנטי (YFP משופר) (A). אם ספקטרום פליטת D חופף במידה ניכרת לספקטרום הספיגה של ה-A, FRET יכול להתרחש (ספיגת אנרגיה מ-D ל-A). זה פרופורציונלי למרחק בין D ל-A, ולכן, ב-Teen, למצב ההפעלה של ERK. ניתן להגדיר פרוטוקולי הדמיה שונים באמצעות מודולי הדמיה סטנדרטיים ומתקדמים של מיקרוסקופים סטנדרטיים או קונפוקליים בדגימות חיות וקבועות כאחד. עם עירור D, רכישת סריקות מולטי-ספקטרליות לאורך ספקטרום פליטה מוגדר (λ) מ-CFP ל-YFP ואחריו אלגוריתמים "ניתוק" ספקטרליים היא בין השיטות האמינות ביותר לרישום וכימות נתוני FRET⁸. ניתן ליישם אותו גם על דגימות דג זברה חיות כדי לתעד דינמיקת רקמות in vivo .

בעקבות דוחות קודמים ^{6,9 ויישום 7} האחרון שלנו, כאן, אנו מפרטים את זרימת העבודה שלב אחר שלב באמצעות דגי Teen כדי להעריך את הפעלת ERK בתאים בשולי הקוטב החי של מודלים של NS בתחילת הגסטרולציה ולתאם אותה עם פגמים אופייניים בצירי הגוף הנראים רק מאוחר יותר בהתפתחות. אנו מראים כיצד להשיג ולבחון נתוני FRET כמותיים מגסטרולה NS חיה לפני ואחרי טיפול ב-MEKi זמין וכיצד להצליב את התוצאות באמצעות אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כנגד ERK זרחני (פעיל) או לבצע ניתוח מורפומטרי מתאם של פגמים בהתארכות העובר.

ניתן ליישם את זרימת העבודה כדי להגביר את הבדיקה התפקודית של וריאנטים מתפתחים וגני מחלה הקשורים לכאורה ל-RASopathies ולקבל תובנות לגבי המתאם של דינמיקת הפעלת ERK מרחבית וזמנית במהלך התפתחות בעלי חוליות והפגמים המורפולוגיים בעוברים. אנו מראים כי ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם כדי לבחון את היעילות של תרופות מועמדות הפועלות לווסת את הפעלת ERK.

Protocol

כל הליכי הניסוי הכוללים שיכון וגידול בעלי חיים נערכו על פי הנחיות ARRIVE לשימוש בדגי זברה במחקר בבעלי חיים ואושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF). כל תגובות ה-DNA/RNA ומפגשי ההדמיה עשויים להיות מוקטנים או מוקטנים לפי הצורך, בהתאם לחומר הסופי הנדרש או למספר הגנים והגרסאות שנבדקו.

1. ייצור וטיפול תרופתי במודלים חולפים של דג זברה RASopathy

הערה: כדי לנטר את הביטוי של גרסאות הקשורות ל-RASopathy, ניתן להשתמש במבנים ספציפיים המכילים את רצף הקידוד הרצוי (cds) של החלבון המעניין במסגרת עם ה-cds של תגים קטנים שאינם פלואורסצנטיים (כגון myc או דומה). בדרך זו, ניתן להעריך את רמות הביטוי של החלבון המוטנטי על ידי כתם מערבי סטנדרטי כנגד התג. אם קיימים נוגדנים נגד החלבון הספציפי המבוקש, ניתן להימנע מתגים. ניתן להשתמש באימונופלואורסצנציה גם כדי להעריך את ביטוי החלבון ברקמת העובר בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. סוג זה של ניסוי בקרה יכול להיות שימושי למתאם ביטוי חלבון מוטנטי עם רמות הפעלת ERK מושרות. השימוש בתגים פלואורסצנטיים אינו מומלץ בשילוב של הדמיית FRET, בהתחשב בשיחות הצלבה אפשריות של פליטת הקרינה במהלך מיקרוסקופיה.

1. ליניאריזציה של פלסמיד (ימים 1-2) (איור 1A)
   הערה: בעת יצירת מודל מחלה חולפת בדג הזברה (RAsopathy כאן) הנגרמת על ידי מוטציית GoF המשפיעה על גן ספציפי, גישה מהירה היא להכין את ה-mRNA המקודד את סוג הבר (WT) ואת החלבון המוטנטי המעניין, אותו יש להזריק לאחר מכן לעוברי דג הזברה לפי השלבים הבאים. הפלסמיד המשמש כתבנית לתמלול ה-mRNA צריך להכיל את ה-CDS (רצף הקידוד) הרצוי באורך מלא עבור הגן המעניין המשובט במורד הזרם מקדם פולימראז T7, Sp6 או T3 ובמעלה הזרם של אות פוליאדנילציה (polyA). אם אינו זמין, הצעד הראשון הוא לייצר אותו על ידי שיבוט דג הזברה או ה-CDS הרצוי לאדם בווקטור^{מתאים 10} ולאמת על ידי ריצוף SANGER. עבור השיבוט, שקול זמן נוסף (בממוצע שבוע אחד כולל שיבוט, סינון מושבות ובידוד והרחבה של השיבוטים הנכונים).
   1. ליניאריזציה של הפלסמיד עם אנזימי הגבלה מתאימים החותכים רק פעם אחת במורד הזרם את אות ה-polyA (כאן KpnI). כדי להשיג ליניאריזציה יעילה של פלסמיד, מערבבים 3 γ (μg/μL) של DNA פלסמיד, 2 מיקרוליטר של אנזים הגבלה (20,000 יחידה/מ"ל) ו-10 מיקרוליטר של מאגר תגובה פי 10 בנפח סופי של 100 מיקרוליטר במים נטולי נוקלאז. מערבבים היטב את הרכיבים על ידי פיפטינג מספר פעמים ודוגרים על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות.
   2. בדוק את תוצאת הליניאריזציה על ידי אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1.5%.
      1. יש לדלל תמיסת מלאי פי 10 של TBE (48.5 גרם טריס, 11.4 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ו-20 מ"ל של 0.5 מ"ל EDTA [pH 8.0]) במים נטולי נוקלאז.
      2. הכן את ג'ל האגרוז על ידי המסה במיקרוגל 1.5 גרם אגרוז בנפח סופי של 100 מ"ל של תמיסת TBE 1x. לאחר מכן, הוסף 3.5 מיקרוליטר של כתם ג'ל צבע.
      3. יצוק את הג'ל על ידי יציקת תמיסת האגרוז לתאים בגודל מתאים, בהתאם למספר התנאים/פלסמידים. הגדר את המסרקים והמתן כשעה עד שהג'ל יתמצק; לאחר מכן, הסר את המסרקים ומקם את הג'ל הפולימרי במגש הג'ל המתאים לאלקטרופורזה.
      4. מערבבים כמה מיקרוליטר של הפלסמיד המעוכל ("חתוך") ו-1.5 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 6 (המכיל צבע לניטור האלקטרופורזה) בנפח סופי של 10 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. הכן באותו אופן גם דגימת בקרה נפרדת עם הפלסמיד הלא מעוכל ("לא חתוך"). טען את הדגימות בנתיבי האגרוז, ובנתיב הראשון, טען סולם DNA של 1 קילו-בייט. בצע את אלקטרופורזה של ה- DNA ב -100 וולט למשך 30 דקות.
      5. דמיין ותעד את רצועות ה-DNA הנובעות מהריצה על טרנס-UV רגיל. בדוק את היעילות של ליניאריזציה של פלסמיד על ידי בדיקת דפוס רצועות ה-DNA המשווה "חתוך" ו"לא חתוך".
         הערה: פלסמידים ליניאריים מספיק צריכים לפעול מהר יותר כפס חד אחד. ודא כי מחשוף ה-DNA הושלם מכיוון שהתחלת תגובת השעתוק היא שלב מגביל מרכזי שיכול להיות מעוכב על ידי נוכחות של צורות פלסמיד מחזוריות, וכתוצאה מכך תפוקת mRNA ירודה.
   3. המשך לטהר את הפלסמיד הליניארי באמצעות ערכות טיהור DNA מבוססות עמודות ספין זמינות מסחרית ואחסן את הכנת ה-DNA המטוהר ב-20 מעלות צלזיוס עד הצורך.
      הערה: במקום ליניאריזציה, ניתן להשתמש במוצר PCR כתבנית לשעתוק mRNA, בתנאי שהוא כולל את רצף מקדם הפולימראז במעלה הזרם ואת רצף אותות ה-polyA במורד הזרם של קודון העצירה. יש לטהר ולבדוק גם מוצרי PCR על ג'ל אגרוז לפני שתמשיך.
2. In vitro שעתוק, טיהור ובקרת איכות mRNA (ימים 2-3) (איור 1א)
   הערה: נקו בזהירות את אזור העבודה ואת הפיפטות עם תמיסות טיהור RNAse. השתמש בחומרים וריאגנטים נטולי נוקלאז; ללבוש כפפות. זה ימזער את זיהום ה-RNase ויאפשר תפוקה טובה יותר של mRNA באורך מלא.
   תמלל mRNA מכוסה ופוליאדניל המקודדים WT וחלבונים מוטנטיים מפלסמידים ליניאריים באמצעות ערכות סטנדרטיות לשעתוק mRNA במבחנה ובהתאם להוראות היצרן.
   1. צנטריפוגה את הפלסמיד הליניארי המטוהר למשך מספר שניות ב-17,949 × גרם כדי להבטיח שפסולת נאספת בתחתית הצינור ולא מועברת לתגובת השעתוק.
   2. הפשירו את כל הרכיבים בטמפרטורת החדר (RT) למעט התערובת של אנלוגים NTP ו-CAP, שנשמרים על קרח. שמור את הפולימראז בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
   3. צנטריפוגה לזמן קצר את כל הריאגנטים ב-17,949 × גרם לפני השימוש כדי למנוע אובדן ריאגנטים או זיהום מקרי ומערבולת קצרה של מאגר התגובה פי 10 והתערובת האנלוגית NTP/CAP המוכנה לשימוש עד שהם בתמיסה מלאה. שמור את מאגר התגובה פי 10 ב-RT.
   4. הכן את תגובת השעתוק ב-RT על ידי הוספת 600-800 ננוגרם של הפלסמיד הליניארי והמטוהר לתמיסה המכילה 10 מיקרוליטר של תערובת אנלוגית 2x NTP/CAP, 2 מיקרוליטר של מאגר תגובה פי 10, 2 מיקרוליטר של אנזים SP6, T7 או T3 (תלוי במקדם הספציפי במעלה הזרם ה-CDS בפלסמיד) בנפח סופי של 20 מיקרוליטר המורכב ממים נטולי נוקלאז. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כמה פעמים.
   5. דגרו את תגובת השעתוק ב-37 מעלות צלזיוס ב-thermocycler. הקפד גם להגדיר את טמפרטורת המכסה ל-37 מעלות צלזיוס ולהפעיל את התגובה למשך שעתיים.
   6. כדי להסיר פלסמיד שיורי שלא תומלל במהלך התגובה, הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת DNAse סטנדרטית (2 יחידות/מיקרוליטר). מערבבים היטב את התגובה על ידי פיפטינג כמה פעמים ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות.
   7. לפני שתמשיך, בדוק את האיכות והשלמות של mRNA מסונתז במבחנה על ידי אלקטרופורזה TBE/פורממיד אגרוז. ממיסים 1.0 גרם אגרוז ב-50 מ"ל של תמיסת TBE 1x, מוסיפים 5.5 מ"ל של 37% פורממיד ו-3.5 מיקרוליטר של צבע ג'ל צבע, מערבבים ויוצקים את הג'ל כפי שהוסבר לעיל.
      זהירות: בעת טיפול בפורממיד, יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) ולהשתמש במכסה מנוע כימי.
   8. מערבבים 1 מיקרוליטר של ה-mRNA המתועתק עם 2.5 מיקרוליטר של 2x מאגר טעינת צבע פורממיד במים נטולי נוקלאז בנפח כולל של 5 מיקרוליטר. מערבבים היטב את הרכיבים על ידי פיפטינג כמה פעמים וטוענים את הדגימות בנתיבי הג'ל. הפעל את הג'ל ב-100 mV למשך 10-15 דקות במאגר TBE 1x מקורר מראש. הפעל גם סולם DNA ו/או RNA של 1 kb.
   9. אופציונלי: דנטורציה של הסולם וה-mRNA ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   10. דמיין ותעד את רצועות ה-mRNA המתקבלות על טרנסמאייטור UV רגיל.
       הערה: ריצות ארוכות וטמפרטורות גבוהות מגבירות את הסבירות לפירוק RNA.
   11. אם השלמות והגודל של ה-RNA המכוסה המסונתז הם אופטימליים, המשך בפוליאדנילציה של מסוף C על ידי הוספה לתגובה: 36 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז, 20 מיקרוליטר של מאגר טעינת דנטורציה פי 5, 10 מיקרוליטר של 25 מ"מ MnCl₂, 10 מיקרוליטר של 10 מ"מ ATP ו-4 מיקרוליטר של אנזים פוליאדנילציה (כגון E. coli Poly(A) פולימראז מטוהר מערבבים היטב את התגובה על ידי פיפטינג כמה פעמים ודוגרים על 100 מיקרוליטר של התגובה הסופית ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת.
       הערה: לא מומלץ לבדוק את איכות ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל לאחר תגובת polyA מכיוון שה-RNA ייראה מרוח עקב זנבות ה-polyA.
   12. זרז ושחזר את ה-mRNA המסונתז והפוליאדניל באמצעות מלחים מתאימים כגון LiCl. בקצרה, ערבבו כמויות שוות של מים נטולי נוקלאז ותמיסת LiCl סטנדרטית של 2.5 M (30 מיקרוליטר) ודגרו למשך >30 דקות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
       הערה: ניתן להשיג משקעים יעילים לאחר שעתיים, אך דגירה של לילה בדרך כלל מגדילה את התשואה הסופית של mRNA.
   13. כדי לגלול את ה-mRNA המטוהר, צנטריפוגה את התגובה למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-17,949 × גרם והסר את הסופרנטנט. כעת, שטפו את הגלולה עם ~1 מ"ל של 70% אתנול (EtOH), וצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-17,949 × גרם כדי להסיר מזהמים ונוקלאוטידים שיוריים מהתגובה.
   14. יבש את הגלולה באוויר ולאחר מכן תלה אותה מחדש ב-20 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. ממיסים היטב את ה-RNA על ידי פיפטינג בעדינות ושוב ושוב ב-RT ודגירה לאחר 10 דקות.
       הערה: בדוק את הגלולה כל 5 דקות כדי להבטיח אידוי EtOH. בעת השעיה, בהתחשב בדביקות של ה-RNA, פיפטה אותו עד שהוא מומס כראוי במים.
   15. העריכו את הריכוז והטוהר של ה-mRNA המוכן על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר (יחס 260/280) בספקטרופוטומטר. מדוד דילולים סקלריים שונים של תכשיר ה-RNA כדי להבטיח הערכת ריכוז נכונה.
       הערה: בדרך כלל, ריכוז ה-RNA המסונתז נע בין 1 ל-2 מיקרוגרם/מ"ל, אך הכמות הסופית יכולה להשתנות בהתאם לאורך ה-CDS ולכמות חומר המוצא.
   16. תוך כדי הערכת האיכות, שמור את מלאי ה-mRNA בקרח, ולאחר מכן הוציא אותו ל-5 מיקרוליטר ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שיידרש להזרקה.
3. הכנת תמיסות וחומרים סטנדרטיים להזרקת עוברים וטיפול תרופתי (ימים 2-3, איור 1B)
   1. משוך מחטי מיקרו-הזרקה לעוברי דג זברה באמצעות נימים סטריליים (מידות נימים סטנדרטיות: 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L מ"מ). השתמש במנגנון מושך זמין מסחרית והחל את ההגדרות הרצויות, מבחינת מתח מוצא, מצב משיכה (צעד אחד או שניים) וכוח משיכה כדי להשיג אורך קצה, קוטר וצורת מחט משתנים. לתכונות מחט נפוצות עבור דג זברה, עיין בעבד אלרחמן ועמיתיו¹¹.
      הערה: ההגדרות האופטימליות עשויות להשתנות בין מעבדות מכיוון שתנאי הסביבה (כגון לחות או טמפרטורת החדר) יכולים להשפיע על תוצאות משיכת המחט. יש לבדוק ולכייל את ההגדרות באופן קבוע. ניתן לאחסן מחטים משוכות ב-RT במיכלים נקיים למשך מספר חודשים.
   2. הכן את תמיסת המלאי 30x "Danieau" ב-pH 7.6 על ידי המסת 101.7 גרם NaCl, 1.56 גרם KCl, 2.96 גרם MgSO₄ x 7H₂O, 4.25 גרם Ca(NO₃)₂ ו-35.75 גרם HEPES ב-1 ליטר מים מזוקקים כפולים (DD) להכנת תמיסת המיקרו-הזרקה. הכן גם תמיסת מלאי של פנול אדום ב-5% במי DD לשימוש כעוקב גלוי של תערובת ההזרקה.
   3. הכן תמיסה בינונית E3 לגידול עוברים על ידי דילול 4 מ"ל של NaCl (5 מ'), 680 מיקרוליטר של KCl (1 מ'), 1.32 מ"ל של CaCl₂ x 2H₂O (1 מ') ו-1.32 מ"ל של MgSO₄ (1 מ') בנפח סופי של 4 ליטר של מי אוסמוזה הפוכה.
   4. הכנת תמיסות מלאי של התרופות הרצויות (בדוגמה זו: מעכב MEK [MEKi] PD032590) כתמיסות מלאי בהתאם לגיליון הנתונים של המוצר והמסיסות (10 מ"מ של MEKi לבחירה על ידי המסה של 5 מ"ג ב-1.036 מ"ל של DMSO). מערבבים היטב ויוצרים מנות קטנות לאחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: DMSO הוא ממס נפוץ המשמש להמסת תרכובות קוטביות ולא קוטביות ומראה מסיסות במגוון רחב של ממיסים אורגניים כמו גם במים.
   5. הכן תרחיף שרימפס מלח חי על ידי מתן אפשרות לציסטות ארטמיה סלינה לבקוע בתמיסת בקיעה (2 גרם/ליטר של ציסטות ארטמיה סלינה ב-30 גרם/ליטר של מלח אוקיינוס שהומס בעבר במי אוסמוזה הפוכה) בטמפרטורה של 28-30 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות לפחות, ומספק אוורור קבוע.
      הערה: תנאי התרבות וזמן הבקיעה עשויים להיות מושפעים מתנאי הסביבה של המתקן ומהרבה ציסטות ויש לבדוק אותם מחדש באופן קבוע ולהגדיר מחדש במידת הצורך.
4. הכנת זוגות רבייה לדגי Tg[ef1α:ERK biosensor-nes] (Teen) (יום 3)
   1. ביום ההזדווגות, האכילו את הזוגות הבוגרים באופן קבוע על פי פרוטוקול המתקן המאושר לבעלי חיים.
      1. נקה את התרבית המכילה שרימפס מלח שבקעו על ידי סינון הציסטות שלא בקעו או ריקות עם שתי מסננות בגדלי סינון שונים (שלב סינון I: 180 מיקרומטר, שלב מסנן II: 112 מיקרומטר).
      2. אוספים ושוטפים את שרימפס המלח המסוננים ב -200 מ"ל מי אוסמוזה הפוכה כדי להאכיל 10-15 דגים בוגרים בכ- 5-10 מ"ל מתמיסת שרימפס המלח.
         הערה: בדוק את איכות תמיסת שרימפס המלח שבקע בהתבוננות בחיוניותם, תנועתיותם, גודלם וצבעם והקפד להסיר ציסטות שלא בקעו או ריקות, שאינן ניתנות לעיכול לדגים ועלולות לגרום נזק למערכת העיכול של הדגים. לזוגות רבייה, עדיף לספק את הארוחה האחרונה של היום לפחות 3 שעות לפני בידוד הזוגות במיכל הרבייה כדי לאפשר עיכול מזון ולשמור על רמות גבוהות של איכות המים.
   2. בחר זוגות דגים שלא זווגו להזדווגות (לפחות) בשבועיים האחרונים, כדי למזער את המצוקה ולאפשר התפתחות גמטות. אקלום את זוגות הדגים הבוגרים שנבחרו (בדרך כלל עם הרכב זה: 1 ♂: 2 ♀) במיכלי גידול מתאימים. הפרד נקבות מזכרים באמצעות מחיצת מיכל עד למחרת בבוקר. הקפידו על מחזור אור/חושך סטנדרטי של 14/10 שעות.
      הערה: ניתן לארגן גם צלבים קבוצתיים. עם זאת, במקרה זה, ההטלה יכולה להתרחש בזמנים שונים ובחירת עוברים באותו שלב ממצמדים מעורבים הופכת לקשה יותר. המעבר מחושך לאור הוא קריטי לחיבור מוצלח.
5. איסוף עוברים ומיקרו-הזרקה של WT ו-mRNA מוטנטיים (יום 4)
   1. ברגע שהאור נדלק במתקן, הסר את מחיצת המיכל המפרידה בין הזכרים לנקבות ובמידת הצורך החלף כ-20% ממי המיכל במים מתוקים ממערכת החקלאות הימית המחזורית כדי לשמור על איכות המים גבוהה מבלי לדלל יתר על המידה את ההורמונים שמשחררים הדגים.
   2. השאירו את הדג ללא הפרעה ובדקו באופן קבוע אם יש הטלת ביצים (בדרך כלל ב-30 הדקות הראשונות עד שעה אחת של אור היום). הביצים (2-3 מ"מ) מוטלות ונופלות לתחתית המיכל מופרדות על ידי רשת כך שמבוגרים לא יכולים לאכול אותן. בודדו את הבוגרים שהרבו בהצלחה וסננו את מי המיכל המכילים את הביצים דרך מסננת רגילה (כגון מסננת תה) כדי לשמור על הביצים.
      הערה: אפשר להחזיר את אותו דג למיכל הרבייה לסבב הזדווגות נוסף או להחזיר את הדג למיכלי הדיור המקוריים, תוך רישום זוג ההזדווגות, התאריך והביצועים.
   3. שטפו את העוברים שנאספו במדיום E3 טרי והסירו ביצים מנוונות ולא מופרות, צואה וסוגים אחרים של פסולת מהזוגות באמצעות פיפט פסטר.
      הערה: אסוף ~n = 100 ביצי נוער מופרות בצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ כדי למנוע אוכלוסיית יתר של עוברים.
   4. סדרו ויישרו ביצי נוער מופרות בצלחת מיקרו-הזרקה מותאמת אישית המתקבלת על ידי יציקת 2% אגרוז במדיום E3 כדי ליצור נתיבים מתאימים שחייבים להכיל ולהגביל את הביציות במהלך מיקרו-הזרקה.
      הערה: למטרה זו ניתן להשתמש בתבניות בהתאמה אישית או מסחריות.
   5. הכן תערובת מיקרו-הזרקה טרייה ליצירת עוברים מוטנטיים באופן הבא: 30-60 pg של mRNA מכוסה ופוליאדניל (כאן shp2) מומס בתמיסת Danieau 0.3x (מדולל מתמיסת המלאי) לנפח סופי של 20 μL. הוסף 0.2 μL (0.05%) של תמיסת מלאי Phenol Red כעוקב מיקרו-הזרקה.
   6. טען את המחט ב-2 מיקרוליטר של חומר הזרקה באמצעות פיפטה של מיקרו-מעמיס. הזריק את התמיסה לשלב תא אחד של עוברי דג זברה צעיר באמצעות מכשיר מיקרו-הזרקת לחץ זמין מסחרית, תוך התאמה ידנית של הגדרות הלחץ והזמן כדי לכייל כל הזרקה על סמך איכות המחט והעובר. עיין בפרוטוקולי הזרקת מיקרו סטנדרטיים של דג הזברה הזמינים בספרות^11,12.
   7. גידול עוברי נוער בהזרקת מיקרו בתנאי גידול מבוקרים (טמפרטורה: 28 מעלות צלזיוס, לחות: 70%, מחזור אור/חושך: 14/10 שעות) להתפתחות מיטבית וניקוי ביצים שנראות עכורות או מנוונות ב-3 השעות הבאות לאחר ההטלה.
   8. ב~4 שעות לאחר ההפריה (hpf), סנן את העוברים לפלואורסצנטיות (ביטוי מדווח) באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי עם הגדרות מנורה ומסנן מתאימות (465-500 ננומטר). השתמש בדגים חיוביים לבני נוער להדמיית FRET ובאחים שליליים להערכות אימונוהיסטוכימיות (IHC) (ראה להלן).
      הערה: בהתחשב בשונות הידועה בביטוי של טרנסגנים מבוססי Tol2¹³, עוברים יכולים להראות רמות משתנות של פלואורסצנטיות בגיל העשרה . מומלץ לבדוק אחים שלא הוזרקו כדי לשלוט בשונות בין-אישית בקרינה בתוך אצווה, ובהתחשב בטווח הדינמי הנמוך של הדמיית FRET, להשליך עוברים עם רמות נמוכות במיוחד של פלואורסצנטיות בסיסית.
6. טיפול בעוברי דג הזברה עם מעכב MEK (MEKi) (יום 4)
   1. הכן תמיסת ביניים של MEKi PD0325901 (1 מ"מ) על ידי דילול 1 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 10 מ"מ עם 9 מיקרוליטר עם מדיום E3. השתמש בתמיסת הביניים כדי להשיג פתרונות סופיים במינון נמוך. הכן מינון נמוך (0.25 מיקרומטר) של PD0325901 MEKi בנפח כולל של 3 מ"ל על ידי ערבוב של 0.75 מיקרוליטר של תמיסת הביניים של 1 מ"מ עם 2.25 מיקרוליטר של מדיום E3. יש לדלל 0.75 מיקרוליטר של 10% DMSO עם 2.25 מ"ל של מדיום E3 כדי לקבל את תמיסת הבקרה (Ctrl).
   2. הניחו מאגרי עוברים במספרים שווים בבארות שונות של צלחת בת 6 בארות והתחילו בטיפול בטבילה באמבטיה: עבור כל באר, החליפו את מדיום E3 במדיום E3 המכיל בקרת רכב (0.0025% DMSO) או תרופות מדוללות בריכוז הרצוי (0.25 מיקרומטר, 0.0025% DMSO) כפי שהוזכר קודם לכן. השתמש ב -3 מ"ל תמיסת תרופות לבאר.
      הערה: כדי למנוע כל השפעות הנגרמות על ידי ריכוזים משתנים של הנשא (DMSO), חשוב לוודא שגם לפתרונות הבקרה וגם לטיפול יש את אותו ריכוז DMSO סופי.
   3. שמור את העוברים המטופלים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס לפני איסוףם עד לשלב ההתפתחותי הרצוי לבדיקות מעקב (כאן: ניתוח מורפומטרי ואימות IHC).

2. הדמיית FRET מולטי-ספקטרלית חיה של דגי זברה RASopathy בשלב הגסטרולה וניתוח נתונים

1. הרכבת גסטרולה להדמיה חיה (יום 4) (איור 2A)
   1. הכן מצע הרכבה לעוברים חיים על ידי המסת 1.5 גרם של אגרוז נמס נמוך (LMA) ב-1x PBS כדי ליצור 1.5% LMA/E3.
      הערה: בחר את ריכוז האגרוז בין 0.8 ל-1.5% בהתאם לשלב ההתפתחותי והצורך הספציפי לרסן את הדג. הפיצו תמיסת LMA טרייה בכמויות בפורמט הרצוי ואחסנו LMA במצב פולימרי ב-RT (יציב למספר חודשים). זה ממזער זיהום חיידקי ופטרייתי אך בדוק את איכות ה-LMA באופן קבוע לפני השימוש.
   2. לפני הרכבת הדגימה, יש להמיס את ה-1.5% LMA בתרמו-מיקסר או באמבט מים סטרילי ב-50 מעלות צלזיוס. לאחר המסה, הפחיתו את הטמפרטורה של התרמו-מערבל לכ-30 מעלות צלזיוס.
   3. מקם עובר Teen⁺ מוזרק יחיד (כאן גסטרולה המבטאת Shp^D61G) במרכז צלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ להדמיה חיה וכוון אותו באמצעות שערה דקה. הסר את תווך ה-E3 העודף ושיתק את העובר על ידי הנחת טיפת LMA למעלה והשארתו להתפלמר ב-RT.
      הערה: בתחילת תהליך הפילמור ניתן לכוון את הדג למיקום הרצוי. מומלץ בהחלט להשתמש ב-LMA בטמפרטורה שאינה גבוהה מ-35 מעלות צלזיוס כדי למנוע נזק לרקמות.
2. קביעת פרמטרים של מיקרוסקופיה וביצוע הדמיית FRET מולטי-ספקטרלית של גסטרולה (יום 4) (איור 2ב)
   הערה: הפרוטוקול חל על השימוש בכל פלטפורמות מיקרוסקופיה קונפוקליות המצוידות בכל החומרה והתוכנה הדרושות לביצוע הדמיית FRET. כאן השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזר ארגון-יון עם קווי אורך גל של 458-476-488-496-514 ננומטר, מפצל קרן אקוסטו-אופטי לתכנות (AOBS) המפריד בין עירור ופליטת אור, שני גלאים היברידיים ספקטרליים (HyD) וחממת שלב לשמירה על תנאים יציבים של טמפרטורה (ב-28 מעלות צלזיוס) ולחות במהלך הדמיה חיה של דגימות.
   ניתן ליישם את פרוטוקול ההדמיה הרב-ספקטרלי החי של FRET כמתואר על עוברים בשלבי התפתחות שונים מעבר לקיבה מוקדמת, כפי שמוצג על ידי Fasano et al.⁷. יש לשקול מחסנית z גדולה יותר עבור שלבי התפתחות מאוחרים יותר (למשל, 24 hpf) כמו גם הגדרות מתאימות של מרווחי z ו-t כדי לאפשר שלבי זיהוי רב-ספקטרליים במהלך רכישת תמונת FRET ספקטרלית.
   1. הפעל את בקר החממה לפחות שעה אחת לפני תחילת הרכישה והגדר את הטמפרטורה ל-28 מעלות צלזיוס כדי לשמור על עוברי דג הזברה במצב בריא. לאחר שטמפרטורת החממה התייצבה, הנח את צלחת ההדמיה עם העובר על מחזיק הדגימה והשתמש במטרה של פי 10/יבש (צמצם מספרי של 0.4) כדי לדמיין במהירות את הדגימה.
   2. בתצורת הלייזר של התוכנה המוזכרת, הפעל את לייזר הארגון-יון והשתמש במחוון כדי לכוונן את עוצמת הלייזר ל-50%. ב'הגדרות חומרה', בחרו רזולוציית עומק של 8 סיביות שבה התמונות יתקבלו.
   3. בחר את מצב הסריקה XYλZ לזיהוי ספקטרלי בלוח הרכישה והגדר את פרמטרי הרכישה הבאים: פורמט תמונה: 512 x 512 פיקסלים; מהירות סריקה של 400 הרץ; זום אופטי של 0.75.
   4. הפעל את קו הלייזר של 458 ננומטר של לייזר ארגון-יון והגדר את ערך העוצמה שלו, בדרך כלל <10% (כאן 8.5%).
   5. בחר גלאי HyD והתאם את רגישות הגלאי (רווח) על ידי הזנת הערך הרצוי (כאן 500).
      הערה: עבור דגימות חיות ופלורסנט חלש וכדי לצבור פחות רעשי רקע, רצוי להשתמש בגלאים היברידיים ולא בצינורות פוטו-מכפיל (PMT).
      בתוכנה המוזכרת, הצגת ספקטרום הפליטה של צבע דורשת הפעלת גלאי.
   6. כדי להתחיל, הפעל את הגלאי הראשון (HyD) ובחר את חלבון הקרינה הציאן (CFP) כדי להציג את עקומת הפליטה שלו. פתח את התפריט הנפתח של סרגל הגלאי של התוכנה כדי לפתוח את רשימת הבחירה עבור עקומת פליטת CFP. כעת, הפעילו גלאי שני כדי להציג את עקומת הפליטה של חלבון הקרינה הצהוב השני (YFP). כדי להציג גם את עקומת הפליטה של Ypet , הפעל גלאי שני, ולאחר מכן בחר את עקומת הפליטה של YFP שתופיע בתמונת הספקטרום, לאחר כיבוי הגלאי השני.
      הערה: לאחר השלמת שלב זה, יש להשבית את הגלאי השני, מכיוון שרק גלאי אחד משמש במצב רכישה ספקטרלי.
   7. כדי להתחיל רכישות חיות, מקם את סמן הזיהוי בטווח של פליטת האות האינטנסיבית ביותר (במקרה זה, זו של YFP) כדי לדמיין את הדגימה, להחליט ולהגדיר את מיקומי ההתחלה והסיום של עובי הדגימה בחלון z-stack LAS X.
   8. עבור מאפייני טווח סריקת λ, הגדר את הפרמטרים הבאים: התחלה (460 ננומטר) וסיום (570 ננומטר) של טווח הזיהוי; רוחב פס זיהוי: 5 ננומטר; λ-סריקה גודל מדרגה: 5 ננומטר. התחל ברכישת z-stack.
      הערה: הפרמטרים שצוינו מאפשרים למשתמשים לקבל תמונה מהירה יחסית ברזולוציה מקובלת, אך ניתן להשתמש בהגדרות שונות. בהגדרות דיסק הפלואוריפ, ניתן לבטל את הבחירה במסנן ה-NOTCH המוכנס אוטומטית כדי למנוע אובדן עוצמה בודדת.
   9. כדי להעריך את שינויי האותות בזמן אמת עם חשיפה ל-MEKi, הרכיבו עובר מוטנטי יחיד (כאן Shp2^D61G) בצלחת זכוכית והדמיינו לפני ואחרי הטיפול התרופתי. עבור ניסויים חיים אלה, בצע ישירות טיפול תרופתי על ידי טבילה באמבטיה במהלך מפגש הדמיה עם מקסימום 2 מ"ל של התמיסה המכילה את התרופה המומסת.
3. עיבוד לאחר תמונה והפרדת צבע מולטי-ספקטרלית להשגת תמונות FRET רציומטריות (יום 5) (איור 2ג)
   1. כדי להפריד בין פליטת התורם (CFP) והמקבל (Ypet), הקפד לבטל את התרומה של פליטת הקרינה של שתי המולקולות בערוץ FRET, הנקראת דימום ספקטרלי (SBT).
      1. עיין במאגרי חלבונים צבעים/פלואורסצנטיים הזמינים לציבור כדי להציג ולהוריד את קובץ ה-.cvs ביחס לספקטרום פליטת CFP סטנדרטי (ספקטרום עירור ופליטה).
      2. בחלונית Data של קובץ ה- .cvs, בחר באפשרות Text to columns ופצל את הנתונים לעמודות באמצעות פסיק כמפריד. הקובץ שיתקבל יכלול מידע נוסף (למשל, עירור CFP, CFP 2P) שיש להסיר. שמור רק את נתוני העמודה ביחס לאורך הגל והפליטה.
      3. בעמודת פליטת CFP, הסר את כל נתוני העוצמה מ-501 ננומטר ואילך.
      4. שמור את קובץ ספקטרום פליטת ה-CFP המותאם מ-460 עד 500 ננומטר בפורמט .xls (נקרא "eCFP modified" באיור 2C).
      5. חזור על אותו הליך כדי להוריד ולעבד את ספקטרום פליטת החלבון YFP ולשמור רק את נתוני העמודה ביחס לאורך הגל והפליטה. הסר את כל ערכי הפליטה עד 524 ננומטר. שמור את קובץ ספקטרום הפליטה המותאם של YFP מפורמט in.xls של 525 עד 650 ננומטר (נקרא "Ypet מ-525 ננומטר" באיור 2C).
      6. כדי לאפשר אי הכללה של דימום ספקטרלי (SBT) במסד הנתונים של הצבעים הזמין בחלון התצורה של התוכנה, הכנס ושמור שני ספקטרום פליטת ייחוס מותאמים עבור CFP ו-YFP.
   2. בחר את קובץ התמונה הספקטרלית שנוצר מהפעלת ההדמיה, פתח את החלון Process ובחר Spectral Dye Separation בכלי Dye Separation. הגדר את ההגדרות עבור הפרדת הצבע באופן הבא: ברשימות הנפתחות בצד שמאל של תיבת הדו-שיח, בחר את ספקטרום פליטת ה-CFP החדש (eCFP modified) במיקום הראשון ואת ספקטרום הפליטה החדש של YFP (Ypet מ-525 ננומטר) ממסד הנתונים של הספקטרום.
   3. תחת שינוי קנה מידה, בחר לכל ערוץ כדי לשנות את קנה המידה של הערוצים בנפרד ולאחר מכן, בסריקת λ של התמונות, בחר את זה עם עוצמת האות הגדולה ביותר (המתאים לשלב 14 של הסריקה הספקטרלית ברמת שיא פליטת ערוץ FRET, המסומן על ידי חץ לבן בלוח המציג שלבי זיהוי מימין לאיור 2B). לאחר מכן, עברו לאורך סריקת Z של הדגימה, ובחרו את הקטע האופטי שמדגיש את אזור העניין באזור השוליים.
   4. השתמש במצב בחירת ה-ROI באזור השוליים של מוט החיה כדי להגדיר את האזור עם הספקטרום הטוב ביותר. לחץ על ROICrosshair המצוין בחלק העליון בחלון התצוגה כדי לקרוא לכוונת ולהתאים את גודל החזר ה-ROI של הייחוס על ידי הזנת הערך של 40 ווקסלים באזור המדידות. הגדר במדויק את תחום העניין על ידי ROICrosshair. בדיאגרמת התמונה, בחר נורמליזציה של נתונים ולאחר מכן לחץ על החל כדי לבצע את הפרדת הצבע עם ההגדרות שהוגדרו.
   5. פתח את הקובץ החדש שנוצר כששני הערוצים מופרדים והפק תמונת הקרנה דו מימדית מסדרת התמונות התלת מימדית (הקרנה בעוצמה מקסימלית) להדמיית נתונים.
   6. בחלון Process , בחר Crop כדי להפריד ערוצים לשני קבצים נפרדים, הערוצים CH1 ו- CH2 (או FRET).
   7. בחלון תהליך , בחר שלב תמונות, בחר את קובץ CH2 והוסף אותו באפשרות הראשונה, ולאחר מכן בחר את קובץ CH1 והוסף אותו לאפשרות השנייה. הגדר שינוי קנה מידה עם פקטור 5 ובחר את פעולת היחס. לאחר מכן, לחץ על החל כדי ליצור את הקובץ החדש המכיל את התמונה היחסית (YFP/CFP). שמור את הקובץ לניתוח נתוני המשך טיפול.
4. ניתוח כמותי של אותות FRET ועיבוד תמונה (ימים 5-6) (איור 2D)
   1. למדידות כמותיות של אותות FRET מתמונות רציומטריות FRET/CFP, בצע את הניסוי על עוברי N>2 (משוכפלים), בהתאם להערכה סטטיסטית אפריורית המבוססת על ההשפעה הצפויה. השתמש בחבילת עיבוד תמונה כגון תוכנת הקוד הפתוח פיג'י. ייבא את קבצי התמונה המתקבלים מהדמיה ספקטרלית והפרדת צבע לחבילת ניתוח תמונה כגון הקוד הפתוח פיג'י.
   2. לפני שתתחיל בבחירת ההחזר על ההשקעה בתמונות הגסטרולה, הגדר את הפרמטרים כמדידות קריאה באמצעות הפונקציה Analyze | הגדרת מידות | בחר את הפרמטרים המעניינים כגון שטח, צפיפות משולבת וערך אפור ממוצע.
   3. בחר את אזור העניין (במחקר הספציפי הזה: שולי הגסטרולה) באמצעות כלי בחירת המצולע מסרגל הכלים. שמור את מפרטי ה-ROI x,y על ידי לחיצה על נתח | כלים | מנהל החזר ROI.
   4. כדי לבצע מדידות בהחזר השקעה נבחר, לחץ על ניתוח | למדוד. חזור על שלבים אלה עבור כל החזר ROI ותמונה/תנאי.
      הערה: במידת הצורך, שמור את התמונה בשם. תבנית TIFF. אפשר לשמור את כל מדידות ההחזר על ההשקעה הנובעות ממספר תמונות כקובץ ROI אחד. שנה את שם כל מדד ברשימת מנהל ההחזר על ההשקעה בשם הנכון ביחס לכל דגימה/תמונה.
   5. עבור כל מצב (מוטנטי ומוטנטי + טיפול כאן), חלץ את כל הערכים של יחס FRET/CFP עבור כל החזר ROI שנבחר שהושג וארגן אותם בגליון עבודה על ידי ארגון, למשל, קבוצות ניסוי בעמודות וכל ערך גולמי בשורות.
   6. השתמש בכל תוכנה מתאימה כדי להעריך הבדלים סטטיסטיים של אותות FRET בין תנאי ניסוי שונים וליצירת גרפים והדמיית נתונים.
      הערה: תוכנות קוד פתוח ותוכנות מורשות זמינות לפתרונות ניתוח נתונים וגרפים.
   7. ארגן פרויקט ספציפי להערכה הסטטיסטית בהתחשב בכל המדידות הגולמיות ומספר השכפולים עבור כל תנאי ניסוי. לניתוח סטטיסטי של שכפול ביולוגי יחיד, צור טבלת עמודות עם משתנה קיבוץ אחד, כאשר כל קבוצה מוגדרת על ידי עמודה. לניתוח סטטיסטי של יותר משכפול ביולוגי אחד, צור טבלאות מקובצות עם לפחות שני משתני קיבוץ, האחד מוגדר על ידי עמודות (למשל, תנאי ניסוי) והשני מוגדר על ידי שורות (למשל, ערכים ממוצעים של שכפולים).
   8. לאחר סידור נכון של קבוצות הניסוי בגיליון העבודה, העריכו את התפלגות הנתונים (מבחן נורמליות, למשל, ד'אגוסטינו-פירסון, אנדרסון-דרלינג) ועל סמך התוצאה, בחרו את המבחן הסטטיסטי המתאים ביותר.
      1. בצע ANOVA חד כיווני לנתונים פרמטריים (בעקבות התפלגות גאוס) ובדיקת Kruskal-Wallis לנתונים לא פרמטריים. אם קיימים גורמים נוספים (ריכוזים גנטיים ותרופות), שקול ANOVA דו-כיווני. השווה את ערך ה-FRET הממוצע עבור כל תנאי זה מול זה (השוואות מרובות) ותקן עבור השוואות מרובות באמצעות מבחן פוסט הוק (למשל, מבחן טוקי ושל דאן עבור נתונים פרמטריים ולא פרמטריים, בהתאמה).

3. אימות IHC של תוצאות FRET וניתוח מורפומטרי מתאם של פגמי קיבה

1. הכנת תמיסות וקיבוע והרכבה של עוברים עבור IHC כנגד tERK ו-pERK (יום 7) (איור 3A)
   1. הכנת פתרונות עבודה הנדרשים ל-IHC.
      1. הכן תמיסת מלאי של 10x PBS על ידי המסת 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם של Na₂HPO₄ ו-2.4 גרם של KH₂PO₄ ב-1 ליטר של מי DD. חיטוי הפתרון כדי לשמור עליו סטרילי.
      2. הכן תמיסת PBS-Triton (PBSTr) 0.8% על ידי המסת 8 מ"ל של 10% Triton X-100 בנפח סופי של 100 מ"ל של 1x PBS.
      3. הכינו תמיסות גליצרול של 20%, 50% ו-80% על ידי דילול של 3 מ"ל, 7.5 מ"ל ו-12 מ"ל של 100% גליצרול, בהתאמה, בנפח סופי של 15 מ"ל של 1x PBS.
   2. הכן 4% פרפורמלדהיד (PFA)/0.25% PBSTr (תמיסה מקבעת) על ידי ערבוב של 2.5 מ"ל של 16% PFA ב-250 מיקרוליטר של 10% טריטון X-100 שהומס בעבר בנפח סופי של 10 מ"ל של 1x PBS. השתמש בתמיסה זו כדי לקבע עוברים ב-6 hpf למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. השתמש בצינורות של 2 מ"ל ומקסימום חמישה עוברים לכל צינור כדי לאפשר קיבוע ושטיפות יעילים.
      הערה: מומלץ להכין קיבוע טרי לכל סיבוב קיבוע. זהירות: בעת טיפול בפורמלדהיד ב-16%, יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) ומתחת למכסה מנוע כימי.
   3. שטפו את העוברים בצינורות של 2 מ"ל על ידי מילוי הצינורות ב-1.5 מ"ל של 0.8% PBSTr לכמה פעמים. העבירו את העוברים לצינורות חדשים של 2 מ"ל ואחסנו את העוברים ב-1x PBS עד לשימוש.
      הערה: אם אינך מכיר את הטיפול בעוברי דג זברה מוקדמים, עבוד תחת סטריאומיקרוסקופ כדי למנוע אובדן עוברים במהלך פיפטינג. השתמש בכלי פלסטיק "כריכה נמוכה" כדי להפחית את הדביקות האפשרית של העוברים לדופן הצינור.
2. חדירות רקמות ו-IHC נגד pERK ו-tERK (ימים 7-9)
   הערה: תוצאות IHC תלויות במספר משתנים שיכולים להיות שונים בין מעבדות וייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה ספציפית של הפרוטוקולים.
   1. שטפו את עוברי דג הזברה הקבועים ב-1 מ"ל של 0.8% PBSTr למשך 3 x 10 דקות ב-RT.
   2. לחלחל את הדגימות עם 2 מיקרוליטר של פרוטאינאז K מדולל ב-0.8% PBSTr (1:1,000) למשך 2 דקות ב-RT.
   3. עצור את חדירות הרקמה על ידי שטיפת הדגימות ב-1 מ"ל של 0.8% PBSTr למשך 3 x 10 דקות, וקבע את הדגימות ב-500 מיקרוליטר של 4% PFA/1x PBS למשך 20 דקות ב-RT. לאחר מכן, שטפו את הדגימות ב-1 מ"ל של 0.8% PBSTr למשך 3 x 10 דקות.
      הערה: השיטה והזמן המשמשים לחדירת רקמות הם שלבים קריטיים שיכולים להיות מושפעים מסוג האנטיגן, איכות שימור הרקמות וגורמים סביבתיים. בצע אופטימיזציה של הפרוטוקול לפני החלתו על דגימות יקרות.
   4. דגרו את הדגימות עם מאגר חוסם 1x (BB) המכיל 5% סרום עיזים רגיל (NGS), 1% אלבומין סרום בקר (BSA), 1% DMSO, שהוכנו כדלקמן: 75 מיקרוליטר של 100% NGS, 150 מיקרוליטר של 10% BSA ו-15 מיקרוליטר של 100% DMSO בנפח סופי של 1.5 מ"ל של 0.8% PBSTr. השתמש ב-200 מיקרוליטר של התמיסה לכל צינור ודגר את העוברים למשך 20-30 דקות ב-RT בתמיסה.
   5. הסר את ה-1x BB מהשלב הקודם ודגר את הדגימות בתמיסה המכילה תערובת של הנוגדנים הראשוניים הרצויים (כאן: דילול 1 מיקרוליטר של נוגדן חד שבטי ראשוני של עכבר p44/42 MAPK, סה"כ ERK, tERK, + 1 מיקרוליטר של פוספו-ארנב פוליקלונלי-p44/42 MAPK, זרחן ERK, pERK) ב-250 מיקרוליטר של תמיסת BB 1x שהוכנה טרייה. השתמש ב-200 מיקרוליטר מהתמיסה לכל צינור ודגר את העוברים בתמיסה למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס.
   6. כדי למנוע כריכה לא ספציפית, שטפו את הדגימות עם 1 מ"ל של 0.8% PBSTr מספר פעמים (יש לשטוף תחילה כל 10 דקות ולאחר מכן כל 30 דקות).
   7. דגרו את הדגימות ב-1x BB טרי שהוכן למשך 20 דקות ב-RT. השתמש ב-200 מיקרוליטר לכל צינור.
   8. הסר את ה-BB 1x מהשלב הקודם ודגר את הדגימות בתערובת של הנוגדנים המשניים (1 מיקרוליטר של 488 נגד עכברים מצומדים פלואורסצנטיים, + 1 מיקרוליטר של 633 אנטי-ארנב עיזים מצומד פלואורסצנטי ב-600 מיקרוליטר של תמיסת BB 1x). השאירו את העוברים רועדים בעדינות למשך הלילה בחום של 20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ביצענו IHC על דגי נוער שליליים (לא טרנסגניים) מאותה אצווה המשמשת להדמיית FRET. לחלופין, ניתן להשתמש גם בדגי Teen⁺ , אך במקרה זה, יש להשתמש במקום זאת בנוגדנים משניים המצומדים לפלואורופורים שאינם חופפים לספקטרום הפליטה של CFP או YFP.
   9. בטל כריכה לא ספציפית כמתואר לעיל.
   10. שטפו את הדגימות בשיפוע של תמיסות גליצרול/1x PBS (20%, 50%, 80%) למשך 15 דקות לכל תמיסה ב-RT. אחסן את הדגימות ב-90% גליצרול/1x PBS ב-4 מעלות צלזיוס.
       הערה: כדי למזער ריקבון פלואורסצנטי אפשרי, אחסן את הדגימות בחושך.
3. מיקרוסקופיה קונפוקלית של רקמה מוכתמת חיסונית וניתוח כמותי (ימים 10-11) (איור 3B-E)
   1. הרכיבו את העוברים כמתואר קודם.
   2. הגדר את פרמטרי רכישת המיקרוסקופיה הקונפוקלית כדלקמן: לייזר לבן ב-80%, טווח פליטת הקרינה ב-507 - 551 ננומטר עבור אנטי-עכבר עזים מצומד פלואורסצנטי (במקרה זה עם ספקטרום פליטה של 488 ננומטר, המשמש ל-tERK), 644 - 740 ננומטר לאנטי-ארנב עז מצומד פלואורסצנטי (במקרה זה עם ספקטרום פליטה של 633 ננומטר, המשמש ל-pERK). בחר מצב רכישה רציף, סריקת פורמט של 512 x 512 פיקסלים ומהירות של 400 הרץ. הגדר את ההתחלה והסיום של הסריקה בעובי גודל צעד z של 4 - 5 מיקרומטר וזום דיגיטלי סטנדרטי של 1. השתמש בטבילה במים יעד פי 25 (עם צמצם מספרי של 0.05) כדי לרכוש את כל הגסטרולה ב-6 hpf
      זהירות: פרוטוקול זה כולל יישום לייזרים שעלולים להזיק; לכן, זה דורש הכשרת כוח אדם בהתאם לדרישות הלאומיות הספציפיות.
   3. לאחר רכישת תמונה קונפוקלית, בדוק את קובץ התמונה הגולמית שהתקבל באמצעות חבילת עיבוד תמונה כגון תוכנת הקוד הפתוח פיג'י.
      1. בפיג'י, השתמשו בפקודה פיצול ערוצים מהתפריט Image ותפריט המשנה Color כדי לקבל תמונה של ערוץ יחיד (סה"כ ERK: ערוץ = 0, C = 0; pERK: ערוץ = 1, C = 1) וצרו תמונת הקרנת z בעוצמה מרבית לשני הערוצים על ידי לחיצה על Image | ערימות | פרויקט Z.
      2. חזור על ההליך למדידות עוצמת החזר על ההשקעה כמתואר קודם וחלץ את הנתונים לגליון עבודה.
      3. כדי להסיק שינויים בעוצמת האות p-ERK בהחזר ה-ROI הרצוי בקרב קבוצות ניסוי, חשב את יחס p-ERK/t-ERK על ידי חלוקת ערכי הצפיפות המשולבים הגולמיים של צביעת p-ERK בצפיפות משולבת גולמית של אות t-ERK. המשך להערכת המובהקות הסטטיסטית כמו בשלב 2.4.
         הערה: ניתן לשנות את הגדרות פרמטרי ההדמיה בהתאם לצרכים הספציפיים ובהתחשב במשך הזמן עבור כל דגימה, איכות התמונות הרצויה ומספר המישורים שיש לרכוש.
4. מדידות צירים ב-11 עוברי hpf (יום 4 לקיבוע עוברים, יום 12 לאיסוף נתונים וניתוחם) (איור 4A-D)
   1. בתום הקיבה (11 hpf), יש לתקן את העוברים עם 4% PFA ב-1x PBS למשך 20 דקות ב-RT, לשטוף מספר פעמים ב-1x PBS ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לרכישת התמונה.
   2. כוונו את העוברים לרוחב באמצעות פיפטה פסטר בבאר אחת של צלחת בת 12 בארות המכילה 1x PBS טרי.
   3. כדי להעריך נוכחות של צורה אליפסה (יחס צירי עובר Y/X > 1), פנוטיפ ראסופתיה אופייני בדג הזברה, ויחס הצלה מורפולוגית של צירי עובר כתוצאה מיעילות הטיפול, רכוש תמונות של עוברים שלמים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו עם מטרת הגדלה של פי 3.4 (אובייקט סריקה של 0.63x x גורם זום 8.60) פשוט על ידי לכידת תמונות במצב שדה בהיר.
   4. ייבא את קובץ התמונה לחבילת ניתוח תמונה כגון הקוד הפתוח פיג'י.
      1. מדוד את אורך צירי העוברים (x, ציר מינורי; y, ציר ראשי) על ידי בחירת הכלי הישר מסרגל הכלים ולחיצה על ניתוח | למדוד. לאחר ביצוע המדידות שנבחרו, הוסף אותן לרשימת מנהל ה-ROI ושמור את קובץ ה-ROI כפי שהוסבר לניתוח הדמיית FRET לעיל.
         הערה: חזור על שלבים אלה עבור כל תמונת עובר.
   5. המשך לייצא את הנתונים בגליון עבודה ולחשב את יחס הצירים על-ידי חלוקת אורך הציר הראשי (y) באורך הציר המשני (x). חשב את הממוצע, סטיית התקן של הממוצע, או שגיאת התקן של ממוצע של שכפולים שונים.
   6. המשך לניתוח נתונים סטטיסטיים כמו בשלב 2.4.

תוצאות

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה פשוטה ליצירה מהירה של מודלים חולפים של RASopathy בעוברי דג זברה ולהערכת תנודות ERK במוטציות מוקדמות עם שיטת הדמיית FRET חיה סטנדרטית המיושמת על חיישן דג זברה ERK שהוקם לאחרונה ^6,9. כפי שהוכח לאחרונה ^6,7...

Discussion

למרות עשרות שנים של מחקר ואינספור מוטציות המובילות לצורות הטרוגניות מאוד של RASopathies שמופו כעת, וריאנטים גנטיים בעלי משמעות לא ידועה ממשיכים לצוץ ממאמצי הריצוף בחולים לא מאובחנים. ואכן, במקרים רבים, אבחון המבוסס אך ורק על מאפיינים קליניים יכול להיות מאתגר וגישות גנומיות פ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Mini-sub Cell GT Horiziontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1704406	Gel Elecrophoresis
PC-100 Vertical puller	Narishige	-	Needle puller
PowerPac Universal Power Supply	Bio-Rad	1645070	Gel Elecrophoresis
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Plasmid preparation
Softwares
Biorender	Biorender	CC-BY 4.0 license	Cartoon elaboration for Figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Data analyses
Fiji software	ImageJ	15.3t	Imaging rendering and quantitative analyses (FRET signals measurements, ERK fluorescence intensity in IHC assay, embryo axes lenght)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Statistical data analyses
iControl spectrophotometer software	Tecan	v. 2.0	RNA quantification
Illustrator	Adobe	26.0.3 (64-bit)	Figure assembling
LASX software	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Imaging acquisition for spectral FRET experiments and embryo imaging for axes lenght measurements
Q9 Mini 18.02-SN software	Uvitec	-	Gel image acquisition