Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Resumo

RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Resumo

RASopatias são síndromes genéticas causadas pela hiperativação do ERK e resultando em doenças multissistêmicas que também podem levar à predisposição ao câncer. Apesar de uma ampla heterogeneidade genética, as mutações de ganho de função da linha germinativa nos principais reguladores da via RAS-MAPK estão subjacentes à maioria dos casos e, graças a técnicas avançadas de sequenciamento, variantes potencialmente patogênicas que afetam a via RAS-MAPK continuam a ser identificadas. A validação funcional da patogenicidade dessas variantes, essencial para o diagnóstico preciso, requer protocolos rápidos e confiáveis, preferencialmente in vivo. Dada a escassez de tratamentos eficazes na primeira infância, tais protocolos, especialmente se escaláveis em modelos animais econômicos, podem ser fundamentais para oferecer uma base pré-clínica para o reposicionamento/reaproveitamento de medicamentos.

Aqui descrevemos passo a passo o protocolo para geração rápida de modelos RASopatia transitórios em embriões de peixe-zebra e inspeção direta de alterações na atividade de ERK associadas a doenças vivas que ocorrem já durante a gastrulação por meio de imagens multiespectrais de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) em tempo real. O protocolo usa um repórter ERK transgênico recentemente estabelecido e integrado ao hardware de microscópios comerciais. Fornecemos um exemplo de aplicação para modelos de peixe-zebra da síndrome de Noonan (NS) obtidos pela expressão do Shp2^D61G. Descrevemos um método simples que permite o registro da mudança de sinal ERK no modelo de peixe NS antes e depois da modulação do sinal farmacológico por inibidores de MEK de baixa dose disponíveis. Detalhamos como gerar, recuperar e avaliar sinais FRET raciométricos de aquisições multiespectrais antes e depois do tratamento e como validar os resultados por meio de imunofluorescência clássica em embriões inteiros em estágios iniciais. Em seguida, descrevemos como, por meio do exame de parâmetros morfométricos padrão, consultar mudanças tardias na forma do embrião, indicativas de um comprometimento resultante da gastrulação, nos mesmos embriões cuja atividade de ERK é avaliada por FRET vivo 6 h após a fertilização.

Introdução

RASopatias são síndromes genéticas que prejudicam o desenvolvimento normal e afetam vários órgãos e tecidos. Essas condições são frequentemente causadas por mutações de ganho de função (GoF) da linha germinativa nos principais genes e atores envolvidos na sinalização RAS / MAK, resultando em uma hiperativação (aumento da fosforilação) da quinase regulada por sinal extracelular (ERK). O ERK regula alguns processos fundamentais importantes durante o desenvolvimento - crescimento do tecido - translocando para o núcleo ^1,2. Mutações somáticas em genes envolvidos na via RAS-MAPK são os eventos mais comuns que levam ao câncer³. Assim, não surpreendentemente, a predisposição ao câncer também é observada nas RASopatias. A síndrome de Noonan (SN), caracterizada por atraso no desenvolvimento, baixa estatura, déficits cognitivos com gravidade variável e cardiomiopatia, é a forma mais comum de RASopatia². Na maioria dos casos, a doença é causada por mutações GoF no PTPN11, o primeiro gene RASopathy a ser descoberto no início de 2000⁴ que codifica a proteína tirosina fosfatase SHP2, que atua como um regulador positivo da via.

Desde então, graças ao uso exponencial de abordagens de sequenciamento do exoma em pacientes não diagnosticados, variantes potencialmente patogênicas que afetam os fatores envolvidos na RAS-MAPK, e provavelmente ligadas a várias formas de RASopatias, continuam a ser descobertas e aguardam caracterização funcional para estratificação eficiente dos pacientes². Para atingir esse objetivo, são necessários protocolos experimentais que garantam uma validação funcional rápida e informativa no nível do organismo. Empregar modelos clássicos e padronizados de mamíferos para testar variantes com significado desconhecido seria caro, extremamente demorado e exigiria métodos invasivos em animais de grande porte não transparentes. Tal estratégia claramente não é compatível com a exigência de testes rápidos, dada a carga social representada por pacientes pobres ou não diagnosticados com RASopatia, atualmente sem tratamento ou tratamento. Protocolos para avaliação quantitativa de características fenotípicas e correlatos moleculares em organismos inteiros também serviriam para acelerar a possível tradução clínica de medicamentos possivelmente disponíveis para pacientes com RASopatia por meio de reaproveitamento / reposicionamento.

O peixe-zebra é um modelo de vertebrado ideal para estudar doenças que afetam o desenvolvimento inicial. Para começar, o peixe-zebra compartilha um alto nível de homologia genética com os humanos. A alta fecundidade dos peixes adultos resulta em uma grande produção de embriões pequenos e que se desenvolvem rapidamente. Os embriões são transparentes nos estágios iniciais, de modo que os principais processos de desenvolvimento - epibolia, gastrulação, eixos e formação do plano corporal - podem ser visualizados sem esforço usando microscopia padrão. Além disso, a disponibilidade de linhagens transgênicas que podem ser usadas para rastrear comportamento celular específico e eventos moleculares dinâmicos no espaço e no tempo durante o desenvolvimento, em conjunto com técnicas avançadas para gerar modelos genéticos, é imbatível. Além disso, as leituras fenotípicas podem ser avaliadas em vários níveis no peixe-zebra (de defeitos vasculares a celulares), e ensaios dedicados já estão estabelecidos para várias doenças, incluindo RASopatias⁵. Além disso, métodos relativamente simples de imersão em banho para administração de medicamentos durante os estágios iniciais, pelo menos para compostos solúveis em água, permitem a triagem de medicamentos de alto rendimento in vivo em um formato de 96 poços.

Do ponto de vista molecular, estudos usando abordagens padrão, como imuno-histoquímica e immunoblot, demonstram de forma robusta a correlação entre a ativação de ERK e defeitos de desenvolvimento associados à RASopatia em embriões de peixes ^6,7. O biossensor FRET do tipo EKAR recentemente desenvolvido em peixe-zebra (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) fornece uma ferramenta in vivo confiável para registrar a ativação de ERK durante a embriogênese de maneira espacialmente resolvida. Portanto, pode ser valioso para uma melhor avaliação das alterações dinâmicas de ERK e modulações farmacológicas em modelos de peixes RASopathy.

No sensor Teen , um substrato ERK específico no repórter é fosforilado após a ativação do ERK, desencadeando uma mudança conformacional que aproxima o doador CFP fluorescente (D) e o aceptor Ypet fluorescente (YFP aprimorado) (A). Se o espectro de emissão D se sobrepõe consideravelmente ao espectro de absorção do A, pode ocorrer FRET (absorção de energia de D para A). Isso é proporcional à distância entre D e A e, portanto, em Teen, ao status de ativação do ERK. Diferentes protocolos de imagem podem ser configurados usando módulos de imagem padrão e avançados de microscópios padrão ou confocais em amostras vivas e fixas. Após a excitação D, a aquisição de varreduras multiespectrais ao longo de um espectro definido de emissão (λ) de CFP para YFP seguido por algoritmos de "desmistura" espectral está entre os métodos mais confiáveis para registrar e quantificar dados FRET⁸. Pode ser aplicado também a espécimes vivos de peixe-zebra para registrar a dinâmica do tecido in vivo .

Seguindo os relatórios anteriores ^6,9 e nossa recente aplicação⁷, aqui detalhamos o fluxo de trabalho passo a passo usando peixes adolescentes para avaliar a ativação de ERK em células na margem do pólo animal de modelos NS no início da gastrulação e correlacioná-la com defeitos característicos dos eixos corporais visíveis apenas mais tarde no desenvolvimento. Mostramos como obter e examinar dados quantitativos de FRET de gastrulas NS vivas antes e depois do tratamento com um MEKi disponível e como validar os resultados por meio de imuno-histoquímica padrão contra ERK fosforilada (ativa) ou realizar análise morfométrica correlativa de defeitos de alongamento embrionário.

O fluxo de trabalho pode ser aplicado para impulsionar o teste funcional de variantes emergentes e genes de doenças supostamente associados a RASopatias e para obter insights sobre a correlação da dinâmica de ativação de ERK espacial e temporalmente durante o desenvolvimento de vertebrados e os defeitos morfológicos em embriões. Mostramos que este protocolo também pode ser usado para testar a eficácia de drogas candidatas que atuam na modulação da ativação de ERK.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo alojamento e reprodução de animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes ARRIVE para o uso de peixe-zebra em pesquisas com animais e autorizados pelo Ministério da Saúde italiano (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF). Todas as reações de DNA/RNA e sessões de imagem podem ser aumentadas ou reduzidas conforme desejado, dependendo do material final necessário ou do número de genes e variantes testados.

1. Geração e tratamento medicamentoso de modelos transitórios de RASopatia de peixe-zebra

NOTA: Para monitorar a expressão de variantes associadas à RASopatia, podem ser usadas construções específicas que abrigam a sequência codificante desejada (cds) da proteína de interesse no quadro com os cds de pequenas tags não fluorescentes (como myc ou similar). Dessa forma, os níveis de expressão da proteína mutante podem ser avaliados por western blot padrão contra a marca. Se anticorpos contra a proteína específica de interesse estiverem disponíveis, as marcas podem ser evitadas. A imunofluorescência também pode ser usada para avaliar a expressão de proteínas no tecido embrionário seguindo protocolos padrão. Este tipo de experimento de controle pode ser útil para correlacionar a expressão de proteínas mutantes com os níveis de ativação induzidos de ERK. O uso de etiquetas fluorescentes não é aconselhável em combinação de imagens FRET, dada a possível interferência de emissão de fluorescência durante a microscopia.

1. Linearização do plasmídeo (dias 1-2) (Figura 1A)
   NOTA: Ao gerar um modelo de doença transitória em peixe-zebra (RAsopatia aqui) causada pela mutação GoF que afeta um gene específico, uma abordagem rápida é preparar o mRNA que codifica o tipo selvagem (WT) e a proteína mutante de interesse, que deve então ser injetada em embriões de peixe-zebra seguindo as etapas abaixo. O plasmídeo usado como molde para transcrever o mRNA deve conter o CDS (sequência codificante) de comprimento total desejado para o gene de interesse clonado a jusante de um promotor da polimerase T7, Sp6 ou T3 e a montante do sinal de poliadenilação (poliA). Se não estiver disponível, o primeiro passo é produzi-lo clonando o peixe-zebra ou CDS desejado pelo ser humano em um vetor¹⁰ adequado e validar por sequenciamento SANGER. Para a clonagem, considere um tempo extra (em média 1 semana, incluindo clonagem, triagem de colônias e isolamento e expansão dos clones corretos).
   1. Linearizar o plasmídeo com enzimas de restrição adequadas, cortando apenas uma vez a jusante o sinal poliA (neste caso, KpnI). Para obter uma linearização eficiente do plasmídeo, misture 3 γ (μg/μL) de DNA do plasmídeo, 2 μL de enzima de restrição (20.000 unidades/mL) e 10 μL de tampão de reação 10x em um volume final de 100 μL em água livre de nuclease. Misture bem os componentes pipetando algumas vezes e incube a mistura de reação a 37 °C por 2-4 h.
   2. Verifique o resultado da linearização por eletroforese em gel de agarose a 1,5%.
      1. Diluir 10x solução estoque de TBE (48,5 g de Tris, 11,4 mL de ácido acético glacial, 20 mL de EDTA 0,5 M [pH 8,0]) com água livre de nuclease.
      2. Prepare o gel de agarose dissolvendo no microondas 1,5 g de agarose em um volume final de 100 mL de solução 1x TBE. Em seguida, adicione 3,5 μL de corante em gel.
      3. Lançar o gel deitando a solução de agarose em câmaras de tamanho adequado, dependendo do número de condições/plasmídeos. Ajuste os pentes e aguarde aproximadamente 1 h até que o gel esteja solidificado; Em seguida, retire os pentes e posicione o gel polimerizado na bandeja de gel apropriada para a eletroforese.
      4. Misture alguns μL do plasmídeo digerido ("corte") e 1,5 μL de tampão de carga 6x (contendo um corante para monitorar a eletroforese) em um volume final de 10 μL de água livre de nuclease. Preparar também do mesmo modo uma amostra de controlo separada com o plasmídeo não digerido ("não cortado"). Carregue as amostras nas pistas de agarose e, na primeira pista, carregue uma escada de DNA de 1 Kb. Realize a eletroforese de DNA a 100 V por 30 min.
      5. Visualize e documente as bandas de DNA resultantes da execução em um transiluminador UV padrão. Verifique a eficiência da linearização do plasmídeo inspecionando o padrão das bandas de DNA comparando "cortado" e "não cortado".
         NOTA: Plasmídeos suficientemente linearizados devem funcionar mais rápido como uma banda afiada. Certifique-se de que a clivagem do DNA esteja completa, pois o início da reação de transcrição é uma etapa limitante fundamental que pode ser prejudicada pela presença de formas de plasmídeo circularizadas, resultando em baixo rendimento de mRNA.
   3. Proceder à purificação do plasmídeo linearizado utilizando kits de purificação de ADN baseados em coluna giratória disponíveis no mercado e armazenar a preparação de ADN purificada a -20 °C até ser necessária.
      NOTA: Em vez de linearização, é possível usar um produto de PCR como modelo para a transcrição do mRNA, desde que inclua a sequência do promotor da polimerase a montante e a sequência do sinal poliA a jusante do códon de parada. Os produtos de PCR também devem ser purificados e inspecionados em um gel de agarose antes de prosseguir.
2. In vitro Transcrição, purificação e controle de qualidade de mRNA (dias 2-3) (Figura 1A)
   NOTA: limpe cuidadosamente a área de trabalho e as pipetas com soluções de descontaminação de RNAse. Use materiais e reagentes livres de nuclease; Use luvas. Isso minimizará a contaminação por RNase e permitirá um melhor rendimento de mRNA de comprimento total.
   Transcreva mRNAs tampados e poliadenilados que codificam WT e proteínas mutantes de plasmídeos linearizados usando kits padrão para transcrição de mRNA in vitro e seguindo as instruções do fabricante.
   1. Centrifugar o plasmídeo linearizado purificado durante alguns segundos a 17,949 × g para garantir que os detritos são recolhidos no fundo do tubo e não transferidos para a reacção de transcrição.
   2. Descongele todos os componentes à temperatura ambiente (RT), exceto a mistura de análogos NTP e CAP, que são mantidos no gelo. Manter a polimerase a -20 °C até à utilização.
   3. Centrifugue brevemente todos os reagentes a 17.949 × g antes do uso para evitar perda de reagente ou contaminação acidental e faça um vórtice breve do tampão de reação 10x e da mistura análoga NTP/CAP pronta para uso até que estejam completamente em solução. Mantenha o tampão de reação 10x em RT.
   4. Preparar a reacção de transcrição à RT adicionando 600-800 ng do plasmídeo linearizado e purificado a uma solução contendo 10 μL de mistura análoga 2x NTP/CAP, 2 μL de tampão de reacção 10x, 2 μL de enzima SP6, T7 ou T3 (dependendo do promotor específico a montante do CDS no plasmídeo) num volume final de 20 μL constituído por água isenta de nuclease. Misture bem pipetando para cima e para baixo algumas vezes.
   5. Incubar a reação de transcrição a 37 °C em um termociclador. Certifique-se também de definir a temperatura da tampa para 37 °C e execute a reação por 2 h.
   6. Para remover o plasmídeo residual que não foi transcrito durante a reação, adicione 1 μL de solução padrão de DNAse (2 unidades / μL). Misturar bem a reacção pipetando algumas vezes e incubar a 37 °C durante mais 30 minutos.
   7. Antes de prosseguir, verificar a qualidade e integridade do mRNA sintetizado in vitro por eletroforese TBE/formamida agarose. Dissolva 1,0 g de agarose em 50 mL de solução 1x TBE, adicione 5,5 mL de formamida a 37% e 3,5 μL de corante em gel, misture e molde o gel conforme explicado acima.
      CUIDADO: Ao manusear formamida, use Equipamento de Proteção Individual (EPI) e use um capuz químico.
   8. Misture 1 μL do mRNA transcrito com 2,5 μL de 2x Formamide Dye Loading Buffer em água livre de nuclease em um volume total de 5 μL. Misture bem os componentes pipetando algumas vezes e carregue as amostras nas faixas de gel. Execute o gel a 100 mV por 10-15 min em tampão TBE 1x pré-resfriado. Execute também uma escada de DNA e/ou RNA de 1 kb.
   9. Opcional: Desnaturar a escada e o mRNA a 70 °C por 10 min.
   10. Visualize e documente as bandas de mRNA resultantes em um transiluminador UV padrão.
       NOTA: Corridas longas e altas temperaturas aumentam a probabilidade de degradação do RNA.
   11. Se a integridade e o tamanho do RNA encapsulado sintetizado forem ideais, prossiga com a poliadenilação do C-terminal adicionando à reação: 36 μL de água livre de nuclease, 20 μL de tampão de carga desnaturante 5x, 10 μL de 25 mM MnCl₂, 10 μL de 10 mM ATP e 4 μL de enzima de poliadenilação (como E. coli poli (A) polimerase purificada). Misturar bem a reacção pipetando algumas vezes e incubar os 100 μl da reacção final a 37 °C durante mais 1 h.
       NOTA: Não é aconselhável verificar a qualidade do RNA por eletroforese em gel após a reação de poliA porque o RNA aparecerá manchado devido às caudas de poliA.
   12. Precipitar e recuperar o mRNA sintetizado tampado e poliadenilado usando sais apropriados, como LiCl. Resumidamente, misture volumes iguais de água livre de nuclease e solução padrão de LiCl 2,5 M (30 μL) e incube por >30 min a -20 °C.
       NOTA: A precipitação eficiente pode ser obtida após 2 h, mas a incubação noturna normalmente aumenta o rendimento final de mRNA.
   13. Para granular o mRNA purificado, centrifugue a reação por 30 min a 4 ° C a 17,949 × g e remova o sobrenadante. Agora, lave o pellet com ~ 1 mL de etanol a 70% (EtOH) e centrifugue por 15 min a 4 ° C a 17.949 × g para remover contaminantes e nucleotídeos residuais da reação.
   14. Seque o pellet ao ar e suspenda-o novamente em 20 μL de água livre de nuclease. Dissolva bem o RNA pipetando suave e repetidamente em RT e incube em 10 min.
       NOTA: Verifique o pellet a cada 5 min para garantir a evaporação do EtOH. Ao ressuspender, dada a viscosidade do RNA, pipete-o até que esteja devidamente dissolvido em água.
   15. Avaliar a concentração e a pureza do ARNm preparado medindo a absorvância a 260 nm e 280 nm (razão 260/280) num espectrofotómetro. Meça diferentes diluições escalares da preparação de RNA para garantir a estimativa correta da concentração.
       NOTA: Normalmente, a concentração do RNA sintetizado varia de 1 a 2 μg/mL, mas a quantidade final pode diferir dependendo do comprimento do CDS e da quantidade de material de partida.
   16. Ao avaliar a qualidade, mantenha o estoque de mRNA no gelo, depois aliquote-o em alíquotas de 5 μL e armazene-o a -80 °C até que seja necessário para a injeção.
3. Preparação de soluções e materiais padrão para injeção de embriões e tratamento medicamentoso (Dias 2-3, Figura 1B)
   1. Puxe agulhas de microinjeção para embriões de peixe-zebra usando capilares estéreis (dimensões capilares padrão: 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm). Use um aparelho extrator disponível comercialmente e aplique as configurações desejadas, em termos de tensão de saída, modo de tração (uma ou duas etapas) e força de tração para obter comprimento, diâmetro e formato da agulha variáveis. Para recursos de agulha comumente usados para peixe-zebra, consulte Abdelrahman e colegas¹¹.
      NOTA: As configurações ideais podem variar entre os laboratórios porque as condições ambientais (como umidade ou temperatura ambiente) podem influenciar os resultados do puxão da agulha. As configurações devem ser testadas e calibradas regularmente. As agulhas puxadas podem ser armazenadas em RT em recipientes limpos por vários meses.
   2. Prepare a solução estoque 30x "Danieau" em pH 7,6 dissolvendo 101,7 g de NaCl, 1,56 g de KCl, 2,96 g de MgSO₄ x 7H₂O, 4,25 g de Ca(NO₃)₂ e 35,75 g de HEPES em 1 L de água bidestilada (DD) para preparar a solução de microinjeção. Prepare também uma solução de estoque de vermelho de fenol a 5% em água DD para uso como marcador visível da mistura de injeção.
   3. Prepare a solução média E3 para o crescimento embrionário diluindo 4 mL de NaCl (5 M), 680 μL de KCl (1 M), 1,32 mL de CaCl₂ x 2H₂O (1 M) e 1,32 mL de MgSO₄ (1 M) em um volume final de 4 L de água de osmose reversa.
   4. Prepare soluções estoque dos medicamentos desejados (neste exemplo: o inibidor de MEK [MEKi] PD032590) como soluções estoque de acordo com a folha de dados do produto e solubilidade (10 mM do MEKi de escolha dissolvendo 5 mg em 1,036 mL de DMSO). Misturar bem e gerar alíquotas pequenas para conservar a -80 °C até à utilização.
      NOTA: O DMSO é um solvente comum usado para dissolver compostos polares e apolares e apresenta solubilidade em uma ampla gama de solventes orgânicos, bem como em água.
   5. Preparar uma suspensão viva de artêmia permitindo que os quistos de Artemia salina eclodam em solução de incubação (2 g/L de quistos de Artemia salina em 30 g/L de sal marinho previamente dissolvido em água de osmose inversa) a 28-30 °C durante pelo menos 18 h, proporcionando arejamento constante.
      NOTA: As condições de cultura e o tempo de eclosão podem ser influenciados pelas condições ambientais da instalação e lotes de cistos e devem ser testados novamente regularmente e redefinidos, se necessário.
4. Preparação de casais reprodutores para peixes Tg[ef1α:ERK biosensor-nes] (Teen) (Dia 3)
   1. No dia do acasalamento, alimente os casais adultos regularmente de acordo com o protocolo aprovado para o biotério.
      1. Limpar a cultura que contém as artémias nascidas filtrando os quistos não eclodidos ou vazios com dois filtros de diferentes tamanhos de filtro (fase de filtro I: 180 μm, fase de filtro II: 112 μm).
      2. Colete e lave as artêmias filtradas em 200 mL de água de osmose reversa para alimentar 10-15 peixes adultos com aproximadamente cerca de 5-10 mL da solução de artêmia.
         NOTA: Verifique a qualidade da solução de artêmia eclodida observando sua vitalidade, motilidade, tamanho e cor e certifique-se de remover cistos não eclodidos ou vazios, que são indigestos para os peixes e podem causar danos ao trato gastrointestinal dos peixes. Para casais reprodutores, é preferível fornecer a última refeição do dia pelo menos 3 h antes de isolar os pares no tanque de reprodução para permitir a digestão dos alimentos e manter altos níveis de qualidade da água.
   2. Selecione pares de peixes que não foram emparelhados para acasalamento em (pelo menos) as 2 semanas anteriores, para minimizar o sofrimento e permitir o desenvolvimento de gametas. Aclimatar os pares de peixes adolescentes adultos selecionados (normalmente com esta composição: 1 ♂: 2 ♀ ) em tanques de reprodução apropriados. Separe as fêmeas dos machos usando um divisor de tanque até a manhã seguinte. Garanta um ciclo claro/escuro padrão de 14/10 h.
      NOTA: Cruzes de grupo também podem ser organizadas. No entanto, neste caso, a desova pode ocorrer em momentos diferentes e a seleção de embriões no mesmo estágio de ninhadas mistas torna-se mais difícil. A transição da escuridão para a luz é crítica para o acasalamento bem-sucedido.
5. Coleta de embriões e microinjeção de mRNAs WT e mutantes (Dia 4)
   1. Assim que a luz for acesa na instalação, remova a divisória do tanque que separa os machos e fêmeas e, se necessário, troque aproximadamente 20% da água do tanque por água doce do sistema de aquicultura de recirculação para manter a qualidade da água alta sem diluir excessivamente os hormônios liberados pelos peixes.
   2. Deixe os peixes intactos e verifique regularmente a postura de ovos (geralmente nos primeiros 30 minutos a 1 h de luz do dia). Os ovos (2-3 mm) são postos e caem no fundo do tanque separados por uma grade de forma que os adultos não possam comê-los. Isole os adultos que se reproduziram com sucesso e coe a água do tanque contendo os ovos por meio de uma peneira padrão (como uma peneira de chá) para reter os ovos.
      NOTA: É possível colocar o mesmo peixe de volta no tanque de reprodução para outra rodada de acasalamento ou devolver o peixe aos tanques de alojamento originais, registrando o par de acasalamento, data e desempenho.
   3. Lave os embriões coletados com meio E3 fresco e remova ovos, fezes e outros tipos de detritos degenerados e não fertilizados dos pares usando uma pipeta Pasteur.
      NOTA: Colete ~n = 100 ovos de adolescentes fertilizados em placa de Petri de 90 mm de diâmetro para evitar a superpopulação de embriões.
   4. Organize e alinhe os ovos Teen fertilizados em uma placa de microinjeção personalizada obtida pela moldagem de agarose a 2% em meio E3 para gerar pistas apropriadas que devem conter e restringir os ovos durante a microinjeção.
      NOTA: Para este fim, podem ser utilizados moldes personalizados ou comerciais.
   5. Prepare uma mistura de microinjeção fresca para gerar embriões mutantes da seguinte forma: 30-60 pg de mRNA tampado e poliadenilado (aqui shp2) dissolvido em solução de Danieau 0,3x (diluída da solução estoque) para um volume final de 20 μL. Adicione 0,2 μL (0,05%) de solução estoque de vermelho de fenol como marcador de microinjeção.
   6. Carregue a agulha com 2 μL de material de injeção usando uma pipeta de microcarregador. Injete a solução no estágio de uma célula de embriões de peixe-zebra adolescentes usando um dispositivo de microinjeção de pressão disponível comercialmente, ajustando manualmente as configurações de pressão e tempo para calibrar cada injeção com base na agulha e na qualidade do embrião. Consulte os protocolos padrão de microinjeção de peixe-zebra disponíveis na literatura^11,12.
   7. Crie embriões adolescentes microinjetados sob condições controladas de criação (temperatura: 28 °C, umidade: 70%, ciclo claro/escuro: 14/10 h) para um desenvolvimento ideal e limpe todos os ovos que pareçam turvos ou degenerados nas próximas 3 horas após a deposição.
   8. Em ~ 4 h após a fertilização (hpf), rastreie os embriões quanto à fluorescência (expressão repórter) usando um estereomicroscópio de fluorescência padrão com configurações apropriadas de lâmpada e filtro (465-500 nm). Use peixes adolescentes positivos para imagens FRET e irmãos negativos para avaliações imuno-histoquímicas (IHQ) (veja abaixo).
      NOTA: Dada a variabilidade conhecida na expressão de transgenes baseados em Tol2¹³, os embriões podem apresentar níveis variáveis de fluorescência adolescente . Recomenda-se inspecionar irmãos não injetados para controlar a variabilidade interindividual na fluorescência dentro de um lote e, considerando a baixa faixa dinâmica da imagem FRET, descartar embriões com níveis extremamente baixos de fluorescência basal.
6. Tratamento de embriões de peixe-zebra com o inibidor de MEK (MEKi) (Dia 4)
   1. Preparar uma solução intermédia de PD0325901 MEKi (1 mM) diluindo 1 μl de solução-mãe 10 mM com 9 μl com meio E3. Utilizar a solução intermédia para obter soluções finais de baixa dose. Prepare uma dose baixa (0,25 μM) do PD0325901 MEKi em um volume total de 3 mL misturando 0,75 μL da solução intermediária de 1 mM com 2,25 μL de meio E3. Diluir 0,75 μL de DMSO a 10% com 2,25 mL de meio E3 para obter a solução de controle (Ctrl).
   2. Coloque pools de embriões de igual número em diferentes poços de uma placa de 6 poços e inicie o tratamento por imersão em banho: para cada poço, troque o meio E3 por meio E3 contendo controle de veículo (0,0025% DMSO) ou drogas diluídas na concentração desejada (0,25 μM, 0,0025% DMSO) conforme mencionado anteriormente. Use 3 mL de solução do medicamento por poço.
      NOTA: Para eliminar quaisquer efeitos causados por concentrações variáveis do transportador (DMSO), é importante garantir que as soluções de controle e tratamento tenham a mesma concentração final de DMSO.
   3. Manter os embriões tratados a 28 °C antes de os recolher até à fase de desenvolvimento desejada para ensaios de acompanhamento (aqui: análise morfométrica e validação IHC).

2. Imagem FRET multiespectral ao vivo de modelos de peixe-zebra RASopatia no estágio de gástrula e análise de dados

1. Montagem de gástrulas para imagens ao vivo (Dia 4) (Figura 2A)
   1. Prepare o meio de montagem para embriões vivos dissolvendo 1,5 g de agarose de baixo ponto de fusão (LMA) em 1x PBS para fazer 1,5% de LMA/E3.
      NOTA: Escolha a concentração de agarose de 0,8 a 1,5%, dependendo do estágio de desenvolvimento e da necessidade específica de conter os peixes. Distribua a solução LMA recém-feita em alíquotas do formato desejado e armazene LMA em estado polimerizado em RT (estável por alguns meses). Isso minimiza a contaminação bacteriana e fúngica, mas verifique a qualidade da alíquota LMA regularmente antes de usar.
   2. Antes da montagem da amostra, derreta a alíquota LMA a 1,5% em um termomisturador ou banho-maria estéril a 50 °C. Uma vez dissolvido, diminua a temperatura do termomisturador para aproximadamente 30 °C.
   3. Posicione um único embrião Teen⁺ injetado (aqui uma gástrula expressando Shp^D61G) no centro de um prato com fundo de vidro de 35 mm de diâmetro para imagens ao vivo e oriente-o usando um cabelo fino. Remova o excesso de meio E3 e imobilize o embrião colocando uma gota de LMA por cima e deixando-o polimerizar em RT.
      NOTA: No início do processo de polimerização, o peixe pode ser orientado para a posição desejada. É estritamente recomendado usar o LMA a uma temperatura não superior a 35 °C para evitar danos aos tecidos.
2. Definir parâmetros de microscopia e realizar imagens FRET multiespectrais de gastrulas (Dia 4) (Figura 2B)
   NOTA: O protocolo se aplica ao uso de qualquer plataforma de microscopia confocal equipada com todo o hardware e software necessários para realizar imagens FRET. Aqui usamos um microscópio confocal equipado com um laser de íons de argônio com linhas de comprimento de onda de 458-476-488-496-514 nm, um divisor de feixe acústico-óptico programável (AOBS) que separa a excitação e a emissão de luz, dois detectores híbridos espectrais (HyD) e uma incubadora de estágio para manter condições estáveis de temperatura (a 28 ° C) e umidade durante a imagem ao vivo das amostras.
   O protocolo de imagem FRET multiespectral vivo, conforme descrito, pode ser aplicado a embriões em diferentes estágios de desenvolvimento além das gástrulas iniciais, conforme mostrado por Fasano et al.⁷. Uma pilha z maior deve ser considerada para estágios de desenvolvimento posteriores (por exemplo, 24 hpf), bem como configurações apropriadas de intervalos z e t para permitir etapas de detecção multiespectral durante a aquisição de imagens FRET espectrais.
   1. Ligue o controlador da incubadora pelo menos 1 h antes de iniciar a aquisição e ajuste a temperatura para 28 °C para manter os embriões de peixe-zebra em um estado saudável. Assim que a temperatura da incubadora se estabilizar, coloque a placa de imagem com o embrião no suporte da amostra e use uma objetiva de 10x/seco (abertura numérica de 0,4) para visualizar rapidamente a amostra.
   2. Na configuração do laser do software referenciado, ligue o laser de íons de argônio e use o controle deslizante para ajustar a potência do laser para 50%. Em Configurações de hardware, escolha a resolução de profundidade de 8 bits na qual as imagens serão adquiridas.
   3. Selecione o modo de varredura XYλZ de detecção espectral no painel de aquisição e defina os seguintes parâmetros de aquisição: formato da imagem: 512 x 512 px; velocidade de varredura de 400 Hz; zoom óptico de 0,75.
   4. Ative a linha de laser de 458 nm do laser de íons de argônio e defina seu valor de intensidade, normalmente <10% (aqui 8.5%).
   5. Selecione um detector HyD e ajuste a sensibilidade do detector (ganho) inserindo o valor desejado (aqui 500).
      NOTA: Para amostras vivas e fracamente fluorescentes e para acumular menos ruído de fundo, é aconselhável usar detectores híbridos em vez de tubos fotomultiplicadores (PMTs).
      No software referenciado, a exibição do espectro de emissão de um corante requer a ativação de um detector.
   6. Para começar, ative o primeiro detector (HyD) e selecione a proteína de fluorescência ciano (CFP) para exibir sua curva de emissão. Abra o menu suspenso da barra do detector do software para abrir a lista de seleção para a curva de emissão CFP. Agora, ative um segundo detector para exibir a curva de emissão da segunda proteína de fluorescência amarela (YFP). Para exibir também a curva de emissão Ypet , ative um segundo detector e, em seguida, selecione a curva de emissão YFP que aparecerá na imagem do espectro, após desligar o segundo detector.
      NOTA: Uma vez concluída esta etapa, o segundo detector deve ser desativado, pois apenas um detector é utilizado no modo de aquisição espectral.
   7. Para iniciar as aquisições ao vivo, posicione o cursor de detecção na faixa de emissão de sinal mais intensa (neste caso, a do YFP) para visualizar a amostra, decida e defina as posições inicial e final da espessura da amostra na janela z-stack LAS X.
   8. Para propriedades da faixa de λ-scan, defina os seguintes parâmetros: início (460 nm) e fim (570 nm) da faixa de detecção; Largura da banda de detecção: 5 nm; Tamanho do passo λ-scan: 5 nm. Inicie a aquisição de pilha z.
      NOTA: Os parâmetros indicados permitem que os usuários obtenham uma imagem relativamente rápida com resolução aceitável, mas configurações diferentes podem ser usadas. Nas configurações do disco fluorizador, o filtro NOTCH inserido automaticamente pode ser desmarcado para evitar perda de intensidade única.
   9. Para avaliar as mudanças de sinal em tempo real após a exposição ao MEKi, monte um único embrião mutante (aqui Shp2^D61G) em um prato de vidro e faça uma imagem antes e depois do tratamento medicamentoso. Para esses experimentos ao vivo, realizar diretamente o tratamento medicamentoso por imersão em banho durante a sessão de imagem com no máximo 2 mL da solução contendo o medicamento dissolvido.
3. Pós-processamento de imagem e separação de corante multiespectral para obtenção de imagens FRET raciométricas (Dia 5) (Figura 2C)
   1. Para separar a emissão do doador (CFP) e do aceptor (Ypet), certifique-se de eliminar a contribuição da emissão de fluorescência de ambas as moléculas no canal FRET, chamada de sangramento espectral (SBT).
      1. Consulte os bancos de dados de corantes/proteínas fluorescentes disponíveis publicamente para exibir e baixar o arquivo .cvs relativo a um espectro de emissão CFP padrão (espectros de excitação e emissão).
      2. No painel Dados do arquivo .cvs, escolha a opção Texto para colunas e divida os dados em colunas usando uma vírgula como delimitador. O arquivo resultante incluirá informações adicionais (por exemplo, excitação CFP, CFP 2P) que devem ser removidas. Reter apenas os dados da coluna relativos ao comprimento de onda e à emissão.
      3. Na coluna de emissões CFP, remover todos os dados de intensidade a partir de 501 nm.
      4. Guardar o ficheiro de espetro de emissão CFP adaptado de 460 nm a 500 nm no formato .xls (denominado «eCFP modificado» na figura 2C).
      5. Repita o mesmo procedimento para baixar e processar o espectro de emissão da proteína YFP e reter apenas os dados da coluna relativos ao comprimento de onda e à emissão. Remova todos os valores de emissão até 524 nm. Salve o arquivo de espectro de emissão YFP adaptado do formato in.xls de 525 a 650 nm (chamado "Ypet de 525 nm" na Figura 2C).
      6. Para permitir a exclusão do sangramento espectral (SBT) no banco de dados de corantes disponível na janela Configuração do software, insira e salve dois espectros de emissão de referência adaptados para CFP e YFP.
   2. Selecione o arquivo de imagem espectral resultante na sessão de geração de imagens, abra a janela Processo e selecione Separação de corante espectral na ferramenta Separação de corante. Defina as configurações para a separação de corantes da seguinte forma: nas listas suspensas no lado esquerdo da caixa de diálogo, selecione o novo espectro de emissão de CFP (eCFP modificado) na primeira posição e o novo espectro de emissão de YFP (Ypet de 525 nm) no banco de dados de espectro.
   3. Em Redimensionar, selecione Por canal para dimensionar os canais individualmente e, em seguida, no λ-scan das imagens, escolha aquele com a maior intensidade de sinal (correspondente à etapa 14 da varredura espectral no nível do pico de emissão do canal FRET, indicado pela seta branca no painel que mostra as etapas de detecção à direita da Figura 2B). Em seguida, mova-se ao longo da varredura Z da amostra e escolha a seção óptica que destaca a área de interesse na zona de margem.
   4. Use o modo de seleção de ROI na zona de margem do poste animal para definir a área com o melhor espectro. Clique em ROICrosshair indicado na parte superior da janela de exibição para acessar a mira e ajustar o tamanho do ROI de referência inserindo o valor de 40 voxels na área de medições. Defina com precisão a área de interesse pelo ROICrosshair. No diagrama de imagem, escolha normalização de dados e clique em Aplicar para realizar a separação de corantes com as configurações definidas.
   5. Abra este arquivo recém-gerado obtido com os dois canais separados e produza uma imagem de projeção bidimensional da série de imagens tridimensionais (projeção de intensidade máxima) para visualização de dados.
   6. Na janela Processo , selecione Cortar para separar os canais em dois arquivos separados, os canais CH1 e CH2 (ou FRET).
   7. Na janela Processo , selecione Combinar imagens, selecione o arquivo CH2 e insira-o na primeira opção e, em seguida, selecione o arquivo CH1 e insira-o na segunda opção. Defina um redimensionamento com fator 5 e escolha a operação Ratio. Em seguida, clique em Aplicar para gerar o novo arquivo contendo a imagem raciométrica (YFP/CFP). Salve o arquivo para análise de dados de acompanhamento.
4. Análise quantitativa de sinais FRET e renderização de imagem (dias 5-6) (Figura 2D)
   1. Para medições quantitativas dos sinais FRET a partir de imagens raciométricas FRET/CFP, realizar o experimento em embriões N>2 (replicados), dependendo de uma avaliação estatística a priori baseada no efeito esperado. Empregue um pacote de processamento de imagem, como o software de código aberto Fiji. Importe os arquivos de imagem obtidos da imagem espectral e da separação de corantes para um pacote de análise de imagem, como o Fiji de código aberto.
   2. Antes de iniciar a seleção de ROI nas imagens de gastrulas, defina os parâmetros como medições de leitura usando a função Analisar | Definir Medidas | selecione os parâmetros de interesse, como Área, Densidade integrada e Valor médio de cinza.
   3. Selecione a região de interesse (neste estudo específico: a margem da gástrula) usando a ferramenta de seleção de polígonos na barra de ferramentas. Salve as especificações de ROI x,y clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI.
   4. Para realizar medições em um ROI selecionado, clique em Analisar | Medir. Repita essas etapas para cada ROI e imagem/condição.
      NOTA: Se necessário, salve a imagem como . TIFF. É possível salvar todas as medições de ROI derivadas de várias imagens como um arquivo de ROI. Renomeie cada medida na lista do gerenciador de ROI com o nome correto em relação a cada amostra/imagem.
   5. Para cada condição (mutante e mutante + tratamento aqui), extraia todos os valores da razão FRET/CFP para cada ROI selecionado obtido e organize-os em uma planilha organizando, por exemplo, grupos experimentais em colunas e cada valor bruto em linhas.
   6. Use qualquer software adequado para avaliar as diferenças estatísticas dos sinais FRET entre diferentes condições experimentais e para geração de gráficos e visualização de dados.
      NOTA: Software de código aberto e licenciado está disponível para soluções de análise de dados e gráficos.
   7. Organizar um projeto específico para a avaliação estatística considerando todas as medições brutas e o número de repetições para cada condição experimental. Para a análise estatística de um único replicado biológico, crie uma tabela de colunas com uma variável de agrupamento, com cada grupo definido por uma coluna. Para a análise estatística de mais de uma réplica biológica, crie tabelas agrupadas com pelo menos duas variáveis de agrupamento, uma definida por colunas (por exemplo, condições experimentais) e outra definida por linhas (por exemplo, valores médios de réplicas).
   8. Após organizar adequadamente os grupos experimentais na planilha, avalie a distribuição dos dados (teste de normalidade, por exemplo, D'Agostino-Pearson, Anderson-Darling) e, com base no resultado, escolha o teste estatístico mais adequado.
      1. Realize uma ANOVA unidirecional para dados paramétricos (seguindo a distribuição gaussiana) e teste de Kruskal-Wallis para dados não paramétricos. Se mais fatores estiverem presentes (concentrações genéticas e de drogas), considere uma ANOVA bidirecional. Compare o valor médio de FRET para cada condição entre si (comparações múltiplas) e corrija para comparações múltiplas usando um teste post hoc (por exemplo, teste de Tukey e Dunn para dados paramétricos e não paramétricos, respectivamente).

3. Validação IHC dos resultados do FRET e análise morfométrica correlativa de defeitos de gastrulação

1. Preparação de soluções e fixação e montagem de embriões para IHQ contra tERK e pERK (Dia 7) (Figura 3A)
   1. Prepare as soluções de trabalho necessárias para IHC.
      1. Prepare uma solução estoque de 10x PBS dissolvendo 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na₂HPO₄ e 2,4 g de KH₂PO₄ em 1 L de água DD. Autoclave a solução para mantê-la estéril.
      2. Prepare uma solução de PBS-Triton a 0,8% (PBSTr) dissolvendo 8 mL de Triton X-100 a 10% em um volume final de 100 mL de 1x PBS.
      3. Prepare soluções de glicerol a 20%, 50% e 80% diluindo 3 mL, 7,5 mL e 12 mL de glicerol a 100%, respectivamente, em um volume final de 15 mL de 1x PBS.
   2. Prepare paraformaldeído a 4% (PFA) / 0,25% PBSTr (solução fixadora) misturando 2,5 mL de PFA a 16% em 250 μL de Triton X-100 a 10% previamente dissolvido em um volume final de 10 mL de 1x PBS. Use esta solução para fixar embriões a 6 hpf durante a noite a 4 °C. Use tubos de 2 mL e no máximo cinco embriões por tubo para permitir uma fixação e lavagens eficientes.
      NOTA: Recomenda-se preparar um novo fixador para cada rodada de fixação. CUIDADO: Ao manusear formaldeído a 16%, use Equipamento de Proteção Individual (EPI) e sob um capuz químico.
   3. Lave os embriões nos tubos de 2 mL enchendo os tubos com 1,5 mL de PBSTr a 0,8% por algumas vezes. Transfira os embriões para novos tubos de 2 mL e armazene os embriões em 1x PBS até o uso.
      NOTA: Se não estiver familiarizado com o manuseio de embriões iniciais de peixe-zebra, trabalhe sob um estereomicroscópio para evitar a perda de embriões durante a pipetagem. Use plástico de "baixa ligação" para reduzir a possível viscosidade dos embriões na parede do tubo.
2. Permeabilização tecidual e IHQ contra pERK e tERK (dias 7-9)
   NOTA: Os resultados do IHC dependem de várias variáveis que podem diferir entre os laboratórios e a otimização específica dos protocolos pode ser necessária.
   1. Lave os embriões fixos de peixe-zebra em 1 mL de PBSTr a 0,8% por 3 x 10 min em RT.
   2. Permeabilize as amostras com 2 μL de proteinase K diluída em PBSTr a 0,8% (1:1.000) por 2 min em RT.
   3. Pare a permeabilização do tecido lavando as amostras em 1 mL de PBSTr a 0,8% por 3 x 10 min e fixe as amostras em 500 μL de PFA a 4% / 1x PBS por 20 min em RT. Em seguida, lave as amostras em 1 mL de PBSTr a 0,8% por 3 x 10 min.
      NOTA: O método e o tempo usados para permeabilização tecidual são etapas críticas que podem ser influenciadas pelo tipo de antígeno, pela qualidade da preservação do tecido e por fatores ambientais. Otimize o protocolo antes de aplicá-lo em amostras preciosas.
   4. Incubar as amostras com 1x tampão bloqueador (BB) contendo 5% de soro de cabra normal (NGS), 1% de albumina de soro bovino (BSA), 1% de DMSO, preparados da seguinte forma: 75 μL de 100% de NGS, 150 μL de 10% de BSA e 15 μL de 100% de DMSO em um volume final de 1,5 mL de 0,8% de PBSTr. Use 200 μL da solução por tubo e incube os embriões por 20-30 min em RT na solução.
   5. Remova o 1x BB da etapa anterior e incube as amostras em uma solução contendo uma mistura dos anticorpos primários desejados (aqui: diluindo 1 μL de anticorpo monoclonal primário de camundongo p44 / 42 MAPK, ERK total, tERK, + 1 μL de fosfo-p44 / 42 MAPK policlonal de coelho, ERK fosforilado, pERK) em 250 μL de solução 1x BB recém-preparada. Utilizar 200 μl da solução por tubo e incubar os embriões na solução durante a noite a 20 °C.
   6. Para eliminar a ligação inespecífica, lave as amostras com 1 mL de PBSTr a 0,8% várias vezes (primeiro lave a cada 10 minutos e depois a cada 30 minutos).
   7. Incubar as amostras em 1x BB recém-preparado por 20 min em RT. Use 200 μL por tubo.
   8. Remova o 1x BB da etapa anterior e incube as amostras com uma mistura de anticorpos secundários (1 μL de anti-camundongo de cabra conjugada fluorescentemente 488, + 1 μL de anti-coelho de cabra 633 conjugado fluorescentemente em 600 μL de solução de 1x BB). Deixe os embriões agitando suavemente durante a noite a 20 °C.
      NOTA: Realizamos IHQ em peixes adolescentes negativos (não transgênicos) do mesmo lote usado para imagens FRET. Alternativamente, peixes Teen⁺ também podem ser usados, mas, neste caso, anticorpos secundários conjugados a fluoróforos que não se sobrepõem aos espectros de emissão de CFP ou YFP devem ser empregados.
   9. Elimine a associação inespecífica, conforme descrito acima.
   10. Lave as amostras em um gradiente de glicerol / 1x PBS (20%, 50%, 80%) por 15 min por cada solução em RT. Armazene as amostras em glicerol 90% / 1x PBS a 4 ° C.
       NOTA: Para minimizar o possível decaimento da fluorescência, armazene as amostras no escuro.
3. Microscopia confocal de tecido imunomarcado e análise quantitativa (Dias 10-11) (Figura 3B-E)
   1. Monte os embriões conforme descrito anteriormente.
   2. Defina os parâmetros de aquisição de microscopia confocal da seguinte forma: laser branco a 80%, faixa de emissão de fluorescência a 507 - 551 nm para anti-camundongo de cabra conjugado fluorescentemente (neste caso com o espectro de emissão de 488 nm, usado para tERK), 644 - 740 nm para anti-coelho de cabra conjugado fluorescentemente (neste caso com o espectro de emissão de 633 nm, usado para pERK). Selecione o modo sequencial de aquisição, uma varredura de formato de 512 x 512 px e uma velocidade de 400 Hz. Defina o início e o fim da varredura com uma espessura de tamanho de passo z de 4 a 5 μm e zoom digital padrão de 1. Use a objetiva de imersão em água 25x (com abertura numérica de 0,05) para adquirir a gástrula inteira a 6 hpf
      CUIDADO: Este protocolo inclui a aplicação de lasers que podem ser prejudiciais; portanto, requer treinamento de pessoal de acordo com os requisitos nacionais específicos.
   3. Após a aquisição da imagem confocal, inspecione o arquivo de imagem bruta obtido usando um pacote de processamento de imagem, como o software de código aberto Fiji.
      1. Em Fiji, use o comando Dividir canais do menu Imagem e submenu Cor para obter uma imagem de canal único (total ERK: canal = 0, C = 0; pERK: canal = 1, C = 1) e gere uma imagem de projeção z de intensidade máxima para ambos os canais clicando em Imagem | Pilhas | Projeto Z.
      2. Repita o procedimento para medições de intensidade de ROI conforme descrito anteriormente e extraia os dados para uma planilha.
      3. Para inferir as mudanças na intensidade do sinal p-ERK no ROI desejado entre os grupos experimentais, calcule a razão p-ERK / t-ERK dividindo os valores brutos de densidade integrada da coloração p-ERK pela densidade bruta integrada do sinal t-ERK. Proceder à avaliação da significância estatística como no passo 2.4.
         NOTA: As configurações dos parâmetros de imagem podem ser modificadas com base nas necessidades específicas e considerando a duração de cada amostra, a qualidade desejada das imagens e o número de planos a serem adquiridos.
4. Medições de eixos em 11 embriões hpf (Dia 4 para fixação de embriões, Dia 12 para aquisição e análise de dados) (Figura 4A-D)
   1. Ao final da gastrulação (11 hpf), fixar os embriões com PFA 4% em PBS 1x por 20 min em RT, lavar várias vezes em PBS 1x e armazenar a 4 °C até a aquisição da imagem.
   2. Oriente os embriões lateralmente usando uma pipeta Pasteur em um único poço de uma placa de 12 poços contendo 1x PBS fresco.
   3. Para avaliar a presença de uma forma oval (razão de eixos de embrião Y/X > 1), um fenótipo característico de Rasopatia em peixe-zebra e proporção de resgate morfológico de eixos embrionários como resultado da eficácia do tratamento, adquira imagens de embriões inteiros usando um microscópio estéreo com uma objetiva de ampliação de 3,4x (objetiva de varredura de 0,63x x fator de zoom de 8,60) simplesmente capturando imagens em um modo de campo claro.
   4. Importe o arquivo de imagem para um pacote de análise de imagem, como o Fiji de software livre.
      1. Meça o comprimento dos eixos dos embriões (x, eixo menor; y, eixo maior) selecionando a ferramenta reta na barra de ferramentas e clicando em Analisar | Medir. Depois de realizar as medições selecionadas, adicione-as à lista do gerenciador de ROI e salve o arquivo ROI conforme explicado para a análise de imagem FRET acima.
         NOTA: Repita essas etapas para cada imagem de embrião.
   5. Prossiga para exportar os dados em uma planilha e calcule a proporção dos eixos dividindo o comprimento do eixo maior (y) pelo comprimento do eixo menor (x). Calcular a média, o desvio-padrão da média ou o erro-padrão da média das diferentes réplicas.
   6. Prossiga para a análise estatística dos dados como na etapa 2.4.

Resultados

Este protocolo mostra um fluxo de trabalho simples para gerar rapidamente modelos RASopatia transitórios em embriões de peixe-zebra e avaliar as flutuações de ERK em mutantes precoces com um método de imagem FRET ao vivo padrão aplicado a um sensor de peixe-zebra ERK recentemente estabelecido ^6,9. Como mostrado recentemente ^6,7 dentro do mesmo fluxo de trabalho exp...

Discussão

Apesar de décadas de pesquisa e miríades de mutações que levam a formas altamente heterogêneas de RASopatias agora mapeadas, variantes genéticas com significado desconhecido continuam a emergir dos esforços de sequenciamento em pacientes não diagnosticados. De fato, em muitos casos, o diagnóstico baseado apenas em características clínicas pode ser desafiador e as abordagens genômicas funcionais para validar os resultados do sequenciamento continuam sendo cruciais. Além disso...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Mini-sub Cell GT Horiziontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1704406	Gel Elecrophoresis
PC-100 Vertical puller	Narishige	-	Needle puller
PowerPac Universal Power Supply	Bio-Rad	1645070	Gel Elecrophoresis
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Plasmid preparation
Softwares
Biorender	Biorender	CC-BY 4.0 license	Cartoon elaboration for Figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Data analyses
Fiji software	ImageJ	15.3t	Imaging rendering and quantitative analyses (FRET signals measurements, ERK fluorescence intensity in IHC assay, embryo axes lenght)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Statistical data analyses
iControl spectrophotometer software	Tecan	v. 2.0	RNA quantification
Illustrator	Adobe	26.0.3 (64-bit)	Figure assembling
LASX software	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Imaging acquisition for spectral FRET experiments and embryo imaging for axes lenght measurements
Q9 Mini 18.02-SN software	Uvitec	-	Gel image acquisition