Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Riepilogo

Le RASopatie sono sindromi genetiche multisistemiche causate dall'iperattivazione della via RAS-MAPK. Varianti potenzialmente patogene in attesa di convalida emergono continuamente, mentre le scarse evidenze precliniche limitano la terapia. Qui, descriviamo il nostro protocollo in vivo per testare e convalidare in modo incrociato i livelli di attivazione ERK associati alla RASopathy e la sua modulazione farmacologica durante l'embriogenesi mediante imaging FRET dal vivo in zebrafish teen-reporter.

Abstract

Le RASopatie sono sindromi genetiche causate dall'iperattivazione di ERK e che provocano malattie multisistemiche che possono anche portare alla predisposizione al cancro. Nonostante un'ampia eterogeneità genetica, la maggior parte dei casi è alla base di mutazioni germinali con guadagno di funzione nei regolatori chiave della via RAS-MAPK e, grazie a tecniche avanzate di sequenziamento, continuano ad essere identificate varianti potenzialmente patogene che influenzano la via RAS-MAPK. La validazione funzionale della patogenicità di queste varianti, essenziale per una diagnosi accurata, richiede protocolli rapidi e affidabili, preferibilmente in vivo. Data la scarsità di trattamenti efficaci nella prima infanzia, tali protocolli, soprattutto se scalabili in modelli animali economicamente vantaggiosi, possono essere strumentali nell'offrire un terreno preclinico per il riposizionamento/riposizionamento dei farmaci.

Qui descriviamo passo dopo passo il protocollo per la generazione rapida di modelli transitori di RASopathy in embrioni di zebrafish e l'ispezione diretta dei cambiamenti di attività ERK associati alla malattia che si verificano già durante la gastrulazione attraverso l'imaging FRET (Förster resonance energy transfer) multispettrale in tempo reale. Il protocollo utilizza un reporter ERK transgenico di recente costituzione e integrato con l'hardware dei microscopi commerciali. Forniamo un esempio di applicazione per i modelli di zebrafish della sindrome di Noonan (NS) ottenuti dall'espressione di Shp2^D61G. Descriviamo un metodo semplice che consente la registrazione del cambiamento del segnale ERK nel modello di pesce NS prima e dopo la modulazione farmacologica del segnale da parte degli inibitori MEK a basso dosaggio disponibili. Descriviamo in dettaglio come generare, recuperare e valutare i segnali FRET raziometrici da acquisizioni multispettrali prima e dopo il trattamento e come convalidare in modo incrociato i risultati tramite l'immunofluorescenza classica su embrioni interi nelle fasi iniziali. Descriviamo quindi come, attraverso l'esame di parametri morfometrici standard, interrogare i cambiamenti tardivi nella forma dell'embrione, indicativi di una conseguente compromissione della gastrulazione, negli stessi embrioni la cui attività ERK è valutata mediante FRET vivo a 6 ore dopo la fecondazione.

Introduzione

Le RASopatie sono sindromi genetiche che compromettono il normale sviluppo e colpiscono vari organi e tessuti. Queste condizioni sono spesso causate da mutazioni germinali con guadagno di funzione (GoF) nei geni chiave e negli attori coinvolti nella segnalazione RAS/MAK, con conseguente iperattivazione (aumento della fosforilazione) della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK). ERK regola alcuni processi fondamentali importanti durante lo sviluppo - crescita dei tessuti - traslocando nel nucleo ^1,2. Le mutazioni somatiche nei geni coinvolti nella via RAS-MAPK sono gli eventi più comuni che portano al cancro³. Pertanto, non sorprende che la predisposizione al cancro si osservi anche nelle RASopatie. La sindrome di Noonan (NS), caratterizzata da ritardo dello sviluppo, bassa statura, deficit cognitivi di gravità variabile e cardiomiopatia, è la forma più comune di^{RASopathy 2}. Nella maggior parte dei casi, la malattia è causata da mutazioni di GoF in PTPN11, il primo gene RASopathy ad essere scoperto all'inizio del 2000⁴ che codifica per la proteina tirosina fosfatasi SHP2, che agisce come regolatore positivo della via.

Da allora, grazie all'uso esponenziale di approcci di sequenziamento dell'esoma in pazienti non diagnosticati, varianti potenzialmente patogene che influenzano i fattori coinvolti nella RAS-MAPK, e probabilmente legate a varie forme di RASopatie, continuano ad essere scoperte e attendono una caratterizzazione funzionale per un'efficiente stratificazione dei pazienti². Per raggiungere questo obiettivo, sono necessari protocolli sperimentali che garantiscano una rapida e informativa validazione funzionale a livello di organismo. L'impiego di modelli di mammiferi classici e standardizzati per testare varianti con significato sconosciuto sarebbe costoso, estremamente dispendioso in termini di tempo e richiederebbe metodi invasivi in animali di grandi dimensioni non trasparenti. Tale strategia non è chiaramente compatibile con l'obbligo di test rapidi, dato l'onere sociale rappresentato dai pazienti con RASopathy poveri o non diagnosticati, attualmente privi di gestione o trattamento. I protocolli per la valutazione quantitativa dei tratti fenotipici chiave e dei correlati molecolari in interi organismi servirebbero anche ad accelerare la possibile traduzione clinica di farmaci possibilmente disponibili per i pazienti con RASopathy mediante riposizionamento/riposizionamento.

Il pesce zebra è un modello di vertebrato ideale per studiare le malattie che influenzano lo sviluppo precoce. Per cominciare, il pesce zebra condivide un alto livello di omologia genetica con gli esseri umani. L'elevata fecondità dei pesci adulti si traduce in una grande produzione di embrioni che sono piccoli e si sviluppano rapidamente. Gli embrioni sono trasparenti nelle fasi iniziali, in modo tale che i principali processi di sviluppo - epibolia, gastrulazione, assi e formazione del piano corporeo - possono essere visualizzati senza sforzo utilizzando la microscopia standard. Inoltre, la disponibilità di linee transgeniche che possono essere utilizzate per tracciare il comportamento cellulare specifico e gli eventi molecolari dinamici nello spazio e nel tempo durante lo sviluppo, in combinazione con tecniche avanzate per generare modelli genetici, è imbattibile. Inoltre, le letture fenotipiche possono essere valutate a più livelli nel pesce zebra (dai difetti dell'organismo a quelli cellulari) e sono già stati stabiliti test dedicati per diverse malattie, tra cui le RASopatie⁵. Inoltre, metodi relativamente semplici di immersione in bagno per la somministrazione di farmaci durante le fasi iniziali, almeno per i composti idrosolubili, consentono lo screening di farmaci ad alto rendimento in vivo in un formato a 96 pozzetti.

Da un punto di vista molecolare, gli studi che utilizzano approcci standard, come l'immunoistochimica e l'immunoblot, dimostrano in modo robusto la correlazione tra l'attivazione di ERK e i difetti di sviluppo associati alla RASopathy negli embrioni di pesce ^6,7. Il biosensore FRET di tipo EKAR, sviluppato di recente nel pesce zebra (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) fornisce uno strumento affidabile in vivo per registrare l'attivazione di ERK durante l'embriogenesi in modo spazio-temporalmente risolto. Pertanto, potrebbe essere utile per una migliore valutazione delle alterazioni dinamiche di ERK e delle modulazioni farmacologiche nei modelli di pesce RASopathy.

Nel sensore Teen , uno specifico substrato di ERK nel reporter viene fosforilato all'attivazione di ERK, innescando un cambiamento conformazionale che porta nelle immediate vicinanze il donatore fluorescente di CFP (D) e l'accettore fluorescente Ypet (YFP migliorato) (A). Se lo spettro di emissione D si sovrappone considerevolmente allo spettro di assorbimento dell'A, può verificarsi FRET (assorbimento di energia da D ad A). Questo è proporzionale alla distanza tra D e A e, quindi, in Teen, allo stato di attivazione dell'ERK. È possibile impostare diversi protocolli di imaging utilizzando moduli di imaging standard e avanzati di microscopi standard o confocali sia in campioni vivi che fissi. Dopo l'eccitazione D, l'acquisizione di scansioni multispettrali lungo uno spettro definito di emissione (λ) da CFP a YFP seguita da algoritmi spettrali di "unmixing" è tra i metodi più affidabili per registrare e quantificare i dati FRET⁸. Può essere applicato anche a esemplari vivi di zebrafish per registrare in vivo la dinamica dei tessuti.

Seguendo i precedenti rapporti ^6,9 e la nostra recente applicazione⁷, qui, descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro passo-passo utilizzando Teen fish per valutare l'attivazione di ERK nelle cellule al margine del polo animale dei modelli NS all'inizio della gastrulazione e correlarla con i difetti caratteristici degli assi corporei visibili solo più tardi nello sviluppo. Mostriamo come ottenere ed esaminare i dati quantitativi di FRET da gastrule NS vive prima e dopo il trattamento con un MEKi disponibile e come convalidare i risultati tramite immunoistochimica standard contro ERK fosforilato (attivo) o eseguire analisi morfometriche correlate dei difetti di allungamento dell'embrione.

Il flusso di lavoro potrebbe essere applicato per potenziare il test funzionale delle varianti emergenti e dei geni malattia putativamente associati alle RASopatie e per ottenere informazioni sulla correlazione delle dinamiche di attivazione delle ERK spazialmente e temporalmente durante lo sviluppo dei vertebrati e sui difetti morfologici negli embrioni. Dimostriamo che questo protocollo può essere utilizzato anche per testare l'efficacia di farmaci candidati che agiscono per modulare l'attivazione di ERK.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che hanno coinvolto la stabulazione e l'allevamento degli animali sono state condotte secondo le linee guida ARRIVE per l'utilizzo del pesce zebra nella ricerca animale e autorizzate dalla Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF. Tutte le reazioni DNA/RNA e le sessioni di imaging possono essere aumentate o ridotte a piacere, a seconda del materiale finale richiesto o del numero di geni e varianti testate.

1. Generazione e trattamento farmacologico di modelli transitori di RASopathy di zebrafish

NOTA: Per monitorare l'espressione di varianti associate alla RASopathy, possono essere utilizzati costrutti specifici che ospitano la sequenza codificante desiderata (cds) della proteina di interesse in frame con i cds di piccoli tag non fluorescenti (come myc o simili). In questo modo, i livelli di espressione della proteina mutante possono essere valutati mediante western blot standard rispetto al tag. Se sono disponibili anticorpi contro la proteina specifica di interesse, i tag possono essere evitati. L'immunofluorescenza può essere utilizzata anche per valutare l'espressione proteica all'interno del tessuto embrionale seguendo protocolli standard. Questo tipo di esperimento di controllo può essere utile per correlare l'espressione di proteine mutanti con i livelli di attivazione indotti di ERK. L'uso di tag fluorescenti non è consigliabile in combinazione con l'imaging FRET, data la possibile interazione tra le emissioni di fluorescenza durante la microscopia.

1. Linearizzazione plasmidi (giorni 1-2) (Figura 1A)
   NOTA: Quando si genera un modello di malattia transitoria nel pesce zebra (RAsopathy qui) causata da una mutazione GoF che colpisce un gene specifico, un approccio rapido consiste nel preparare l'mRNA che codifica per il wild-type (WT) e la proteina mutante di interesse, che dovrebbe poi essere iniettato in embrioni di zebrafish seguendo i passaggi seguenti. Il plasmide utilizzato come stampo per trascrivere l'mRNA dovrebbe contenere il CDS (sequenza codificante) a lunghezza intera desiderato per il gene di interesse clonato a valle di un promotore della polimerasi T7, Sp6 o T3 e a monte del segnale di poliadenilazione (polyA). Se non disponibile, il primo passo consiste nel produrlo clonando il pesce zebra o il CDS desiderato dall'uomo in un vettore adatto¹⁰ e convalidarlo mediante sequenziamento SANGER. Per la clonazione, considerare un tempo extra (in media 1 settimana compresa la clonazione, lo screening delle colonie e l'isolamento e l'espansione dei cloni corretti).
   1. Linearizzare il plasmide con opportuni enzimi di restrizione tagliando una sola volta a valle il segnale della poliA (qui KpnI). Per ottenere un'efficiente linearizzazione plasmidica, mescolare 3 γ (μg/μL) di DNA plasmidico, 2 μL di enzima di restrizione (20.000 Unità/mL) e 10 μL di tampone di reazione 10x in un volume finale di 100 μL in acqua priva di nucleasi. Miscelare accuratamente i componenti pipettandoli alcune volte e incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2-4 ore.
   2. Verificare l'esito della linearizzazione mediante elettroforesi su un gel di agarosio all'1,5%.
      1. Diluire 10 volte la soluzione madre di TBE (48,5 g di Tris, 11,4 mL di acido acetico glaciale, 20 mL di EDTA 0,5 M [pH 8,0]) con acqua priva di nucleasi.
      2. Preparare il gel di agarosio sciogliendo nel microonde 1,5 g di agarosio in un volume finale di 100 ml di soluzione 1x TBE. Quindi, aggiungere 3,5 μL di colorante in gel.
      3. Colare, il gel versando la soluzione di agarosio in camere di dimensioni adeguate, a seconda del numero di condizioni/plasmidi. Fissare i pettini e attendere circa 1 ora fino a quando il gel non si sarà solidificato; Quindi, rimuovere i pettini e posizionare il gel polimerizzato nell'apposito vassoio per gel per l'elettroforesi.
      4. Mescolare alcuni μL del plasmide digerito ("taglio") e 1,5 μL di tampone di caricamento 6x (contenente un colorante per monitorare l'elettroforesi) in un volume finale di 10 μL di acqua priva di nucleasi. Preparare allo stesso modo anche un campione di controllo separato con il plasmide non digerito ("non tagliato"). Caricare i campioni nelle corsie dell'agarosio e, nella prima corsia, caricare una scala del DNA da 1 Kb. Eseguire l'elettroforesi del DNA a 100 V per 30 minuti.
      5. Visualizzare e documentare le bande di DNA risultanti dalla corsa su un transilluminatore UV standard. Verificare l'efficienza della linearizzazione dei plasmidi ispezionando il modello delle bande di DNA confrontando "taglio" e "non tagliato".
         NOTA: I plasmidi sufficientemente linearizzati dovrebbero funzionare più velocemente come una banda affilata. Assicurarsi che la scissione del DNA sia completa perché l'inizio della reazione di trascrizione è un passaggio limitante chiave che può essere ostacolato dalla presenza di forme plasmidiche circolarizzate, con conseguente scarsa resa dell'mRNA.
   3. Procedere alla purificazione del plasmide linearizzato utilizzando i kit di purificazione del DNA basati su colonna di rotazione disponibili in commercio e conservare la preparazione di DNA purificato a -20 °C fino al momento del bisogno.
      NOTA: Invece della linearizzazione, è possibile utilizzare un prodotto della PCR come stampo per la trascrizione dell'mRNA, a condizione che includa la sequenza del promotore della polimerasi a monte e la sequenza del segnale della poliA a valle del codone di stop. I prodotti PCR devono anche essere purificati e ispezionati su un gel di agarosio prima di procedere.
2. In vitro Trascrizione, purificazione e controllo di qualità dell'mRNA (Giorni 2-3) (Figura 1A)
   NOTA: pulire accuratamente l'area di lavoro e le pipette con soluzioni di decontaminazione a base di RNAsi. Utilizzare materiali e reagenti privi di nucleasi; Indossare i guanti. Ciò ridurrà al minimo la contaminazione da RNasi e consentirà una migliore resa di mRNA a lunghezza intera.
   Trascrivi mRNA capped e poliadenilati che codificano per WT e proteine mutanti da plasmidi linearizzati utilizzando kit standard per la trascrizione di mRNA in vitro e seguendo le istruzioni del produttore.
   1. Centrifugare il plasmide linearizzato purificato per alcuni secondi a 17.949 × g per assicurarsi che i detriti vengano raccolti sul fondo della provetta e non trasferiti nella reazione di trascrizione.
   2. Scongelare tutti i componenti a temperatura ambiente (RT) ad eccezione della miscela di analoghi NTP e CAP, che vengono mantenuti in ghiaccio. Mantenere la polimerasi a -20 °C fino al momento dell'uso.
   3. Centrifugare brevemente tutti i reagenti a 17.949 × g prima dell'uso per evitare la perdita di reagenti o la contaminazione accidentale e agitare brevemente il tampone di reazione 10x e la miscela analogica NTP/CAP pronta all'uso fino a quando non sono completamente in soluzione. Mantieni il tampone di reazione 10x su RT.
   4. Preparare la reazione di trascrizione a RT aggiungendo 600-800 ng del plasmide linearizzato e purificato a una soluzione contenente 10 μL di miscela analogica 2x NTP/CAP, 2 μL di tampone di reazione 10x, 2 μL di enzima SP6, T7 o T3 (a seconda del promotore specifico a monte del CDS nel plasmide) in un volume finale di 20 μL costituito con acqua priva di nucleasi. Miscelare accuratamente pipettando su e giù alcune volte.
   5. Incubare la reazione di trascrizione a 37 °C in un termociclatore. Assicurati di impostare anche la temperatura del coperchio a 37 °C ed esegui la reazione per 2 ore.
   6. Per rimuovere il plasmide residuo che non è stato trascritto durante la reazione, aggiungere 1 μL di soluzione standard di DNAsi (2 Unità/μL). Miscelare accuratamente la reazione pipettando alcune volte e incubare a 37 °C per altri 30 minuti.
   7. Prima di procedere, verificare la qualità e l'integrità dell'mRNA sintetizzato in vitro mediante elettroforesi di agarosio TBE/formammide. Sciogliere 1,0 g di agarosio in 50 mL di soluzione 1x TBE, aggiungere 5,5 mL di formammide al 37% e 3,5 μL di colorante in gel, mescolare e fondere il gel come spiegato sopra.
      ATTENZIONE: Quando si maneggia la formammide, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) e utilizzare un cappuccio chimico.
   8. Miscelare 1 μL di mRNA trascritto con 2,5 μL di tampone di caricamento colorante 2x Formamide in acqua priva di nucleasi in un volume totale di 5 μL. Miscelare accuratamente i componenti pipettandoli alcune volte e caricare i campioni nelle corsie di gel. Far funzionare il gel a 100 mV per 10-15 minuti in un tampone preraffreddato 1x TBE. Eseguire anche una scala di DNA e/o RNA da 1 kb.
   9. Opzionale: Denaturare la scala e l'mRNA a 70 °C per 10 minuti.
   10. Visualizza e documenta le bande di mRNA risultanti su un transilluminatore UV standard.
       NOTA: Lunghe tirature e alte temperature aumentano la probabilità di degradazione dell'RNA.
   11. Se l'integrità e le dimensioni dell'RNA incappucciato sintetizzato sono ottimali, procedere con la poliadenilazione del C-terminale aggiungendo alla reazione: 36 μL di acqua priva di nucleasi, 20 μL di tampone di carico denaturante 5x, 10 μL di 25 mM MnCl₂, 10 μL di 10 mM ATP e 4 μL di enzima di poliadenilazione (come la Poli(A) Polimerasi purificata di E. coli ). Miscelare accuratamente la reazione pipettandola alcune volte e incubare i 100 μl della reazione finale a 37 °C per un'ulteriore 1 ora.
       NOTA: Non è consigliabile controllare la qualità dell'RNA tramite elettroforesi su gel dopo la reazione polyA perché l'RNA apparirà macchiato a causa delle code polyA.
   12. Precipitare e recuperare l'mRNA sintetizzato, incappucciato e poliadenilato utilizzando sali appropriati come LiCl. In breve, mescolare volumi uguali di acqua priva di nucleasi e una soluzione standard di LiCl 2,5 M (30 μL) e incubare per >30 minuti a -20 °C.
       NOTA: Una precipitazione efficiente può essere ottenuta dopo 2 ore, ma l'incubazione notturna in genere aumenta la resa finale dell'mRNA.
   13. Per pellettare l'mRNA purificato, centrifugare la reazione per 30 minuti a 4 °C a 17.949 × g e rimuovere il surnatante. Ora, lavare il pellet con ~1 mL di etanolo al 70% (EtOH) e centrifugare per 15 minuti a 4 °C a 17.949 × g per rimuovere i contaminanti e i nucleotidi residui dalla reazione.
   14. Asciugare il pellet all'aria e poi rimetterlo in sospensione in 20 μL di acqua priva di nucleasi. Sciogliere bene l'RNA pipettandolo delicatamente e ripetutamente a RT e incubare a 10 minuti.
       NOTA: Controllare il pellet ogni 5 minuti per garantire l'evaporazione dell'EtOH. Durante la risospensione, data la viscosità dell'RNA, pipettarlo fino a quando non è adeguatamente sciolto in acqua.
   15. Valutare la concentrazione e la purezza dell'mRNA preparato misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nm (rapporto 260/280) in uno spettrofotometro. Misurare diverse diluizioni scalari della preparazione di RNA per garantire una corretta stima della concentrazione.
       NOTA: Normalmente, la concentrazione dell'RNA sintetizzato varia da 1 a 2 μg/mL, ma la quantità finale può variare a seconda della lunghezza del CDS e della quantità di materiale di partenza.
   16. Durante la valutazione della qualità, mantenere lo stock di mRNA in ghiaccio, quindi aliquotarlo in aliquote da 5 μL e conservarlo a -80 °C fino al momento dell'iniezione.
3. Preparazione di soluzioni e materiali standard per l'iniezione di embrioni e il trattamento farmacologico (giorni 2-3, Figura 1B)
   1. Aghi per microiniezione per embrioni di zebrafish utilizzando capillari sterili (dimensioni standard dei capillari: 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm). Utilizzare un estrattore disponibile in commercio e applicare le impostazioni desiderate, in termini di tensione di uscita, modalità di trazione (uno o due passaggi) e forza di trazione per ottenere lunghezza, diametro e forma dell'ago della punta variabili. Per le caratteristiche dell'ago comunemente usate per il pesce zebra, fare riferimento ad Abdelrahman e colleghi¹¹.
      NOTA: Le impostazioni ottimali possono variare da un laboratorio all'altro perché le condizioni ambientali (come l'umidità o la temperatura ambiente) possono influenzare i risultati dell'estrazione dell'ago. Le impostazioni devono essere regolarmente ritestate e calibrate. Gli aghi estratti possono essere conservati presso RT in contenitori puliti per diversi mesi.
   2. Preparare la soluzione madre 30x "Danieau" a pH 7,6 sciogliendo 101,7 g di NaCl, 1,56 g di KCl, 2,96 g di MgSO₄ x 7H₂O, 4,25 g di Ca(NO₃)₂ e 35,75 g di HEPES in 1 L di acqua a doppia distillazione (DD) per preparare la soluzione di microiniezione. Preparare anche una soluzione madre di rosso fenolo al 5% in acqua DD da utilizzare come tracciante visibile della miscela iniettabile.
   3. Preparare la soluzione di terreno E3 per la crescita embrionale diluendo 4 mL di NaCl (5 M), 680 μL di KCl (1 M), 1,32 mL di CaCl₂ x 2H₂O (1 M) e 1,32 mL di MgSO₄ (1 M) in un volume finale di 4 L di acqua ad osmosi inversa.
   4. Preparare le soluzioni madre dei farmaci desiderati (in questo esempio: l'inibitore MEK [MEKi] PD032590) come soluzioni madre secondo la scheda tecnica del prodotto e la solubilità (10 mM del MEKi di scelta sciogliendo 5 mg in 1,036 mL di DMSO). Mescolare accuratamente e generare piccole aliquote da conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
      NOTA: Il DMSO è un solvente comune utilizzato per dissolvere composti sia polari che non polari e mostra solubilità in un'ampia gamma di solventi organici e in acqua.
   5. Preparare una sospensione di artemia salina viva lasciando schiudere le cisti di Artemia salina in soluzione di schiusa (2 g/L di cisti di Artemia salina in 30 g/L di sale oceanico precedentemente disciolto in acqua ad osmosi inversa) a 28-30 °C per almeno 18 ore, garantendo un'aerazione costante.
      NOTA: Le condizioni di coltura e il tempo di schiusa potrebbero essere influenzati dalle condizioni ambientali dell'impianto e dai lotti di cisti e dovrebbero essere riesaminati regolarmente e reimpostati se necessario.
4. Preparazione delle coppie riproduttive per i pesci Tg[ef1α:ERK biosensor-nes] (Teen) (Giorno 3)
   1. Il giorno dell'accoppiamento, nutrire regolarmente le coppie adulte secondo il protocollo approvato della struttura animale.
      1. Pulire la coltura contenente artemia salina schizzata filtrando le cisti non schiuse o vuote con due filtri di diverse dimensioni (fase di filtro I: 180 μm, fase di filtro II: 112 μm).
      2. Raccogliere e lavare i gamberetti in salamoia filtrati in 200 ml di acqua ad osmosi inversa per nutrire 10-15 pesci adulti con circa 5-10 ml di soluzione di artemia salina.
         NOTA: Controlla la qualità della soluzione di artemia salina schiusa osservando la loro vitalità, motilità, dimensioni e colore e assicurati di rimuovere le cisti non schiuse o vuote, che sono indigeribili per i pesci e possono causare danni al tratto gastrointestinale dei pesci. Per le coppie riproduttive, è preferibile fornire l'ultimo pasto della giornata almeno 3 ore prima di isolare le coppie nella vasca di riproduzione per consentire la digestione del cibo e mantenere alti i livelli di qualità dell'acqua.
   2. Seleziona coppie di pesci che non sono state accoppiate per l'accoppiamento (almeno) nelle 2 settimane precedenti, per ridurre al minimo l'angoscia e consentire lo sviluppo dei gameti. Acclimatare le coppie di pesci adolescenti adulti selezionate (normalmente con questa composizione: 1 ♂ : 2 ♀ ) in vasche di riproduzione appropriate. Separa le femmine dai maschi usando un divisorio fino al mattino successivo. Garantire un ciclo di luce/buio standard di 14/10 h.
      NOTA: È possibile organizzare anche croci di gruppo. Tuttavia, in questo caso, la deposizione delle uova può avvenire in momenti diversi e la selezione degli embrioni nella stessa fase da covate miste diventa più difficile. Il passaggio dal buio alla luce è fondamentale per il successo dell'accoppiamento.
5. Raccolta di embrioni e microiniezione di mRNA WT e mutanti (Giorno 4)
   1. Non appena si accende la luce all'interno dell'impianto, rimuovere il divisorio della vasca che separa i maschi e le femmine e, se necessario, sostituire circa il 20% dell'acqua della vasca con acqua dolce proveniente dal sistema di acquacoltura a ricircolo per mantenere alta la qualità dell'acqua senza diluire eccessivamente gli ormoni rilasciati dai pesci.
   2. Lasciare il pesce indisturbato e controllare regolarmente la deposizione delle uova (di solito nei primi 30 minuti a 1 ora di luce diurna). Le uova (2-3 mm) vengono deposte e cadono sul fondo della vasca separate da una griglia tale che gli adulti non possono mangiarle. Isolare gli adulti che si sono riprodotti con successo e filtrare l'acqua della vasca contenente le uova attraverso un colino standard (come un colino da tè) per trattenere le uova.
      NOTA: È possibile rimettere lo stesso pesce nella vasca di riproduzione per un altro giro di accoppiamento o riportare il pesce nelle vasche di stabulazione originali, registrando la coppia di accoppiamento, la data e le prestazioni.
   3. Lavare gli embrioni raccolti con terreno E3 fresco e rimuovere le uova non fecondate e degenerate, le feci e altri tipi di detriti dalle coppie utilizzando una pipetta Pasteur.
      NOTA: Raccogli ~n = 100 uova di adolescenti fecondate in una capsula di Petri di 90 mm di diametro per evitare la sovrappopolazione di embrioni.
   4. Disporre e allineare gli ovuli di adolescenti fecondati in una piastra di microiniezione personalizzata ottenuta modellando agarosio al 2% in terreno E3 per generare corsie appropriate che devono contenere e limitare gli ovuli durante la microiniezione.
      NOTA: A questo scopo possono essere utilizzati stampi su misura o commerciali.
   5. Preparare una miscela di microiniezione fresca per generare embrioni mutanti come segue: 30-60 pg di mRNA incappucciato e poliadenilato (qui shp2) disciolto in una soluzione di Danieau 0,3x (diluita dalla soluzione madre) per un volume finale di 20 μL. Aggiungere 0,2 μL (0,05%) di soluzione madre di Rosso Fenolo come tracciante per microiniezione.
   6. Caricare l'ago con 2 μL di materiale per iniezione utilizzando una pipetta microloader. Iniettare la soluzione nello stadio monocellulare di embrioni di pesce zebra adolescente utilizzando un dispositivo di microiniezione a pressione disponibile in commercio, regolando manualmente le impostazioni di pressione e tempo per calibrare ogni iniezione in base alla qualità dell'ago e dell'embrione. Fare riferimento ai protocolli standard di microiniezione di zebrafish disponibili in letteratura^11,12.
   7. Allevare embrioni adolescenti microiniettati in condizioni di allevamento controllate (temperatura: 28 °C, umidità: 70%, ciclo luce/buio: 14/10 h) per uno sviluppo ottimale e ripulire le uova che appaiono torbide o degenerate nelle successive 3 ore dopo la deposizione.
   8. A ~4 ore dopo la fecondazione (hpf), esaminare gli embrioni per la fluorescenza (espressione reporter) utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza standard con lampade e filtri appropriati (465-500 nm). Utilizzare pesci adolescenti positivi per l'imaging FRET e fratelli negativi per le valutazioni immunoistochimiche (IHC) (vedi sotto).
      NOTA: Data la nota variabilità nell'espressione dei transgeni¹³ basati su Tol2, gli embrioni possono mostrare livelli variabili di fluorescenza Teen . Si raccomanda di ispezionare i fratelli non iniettati per controllare la variabilità interindividuale della fluorescenza all'interno di un lotto e, considerando la bassa gamma dinamica dell'imaging FRET, scartare gli embrioni con livelli estremamente bassi di fluorescenza basale.
6. Trattamento di embrioni di zebrafish con l'inibitore MEK (MEKi) (Giorno 4)
   1. Preparare una soluzione intermedia di MEKi PD0325901 (1 mM) diluendo 1 μl di soluzione madre da 10 mM con 9 μl con terreno E3. Utilizzare la soluzione intermedia per ottenere soluzioni finali a basso dosaggio. Preparare una dose bassa (0,25 μM) del PD0325901 MEKi in un volume totale di 3 mL mescolando 0,75 μL della soluzione intermedia 1 mM con 2,25 μL di terreno E3. Diluire 0,75 μl di DMSO al 10% con 2,25 ml di terreno E3 per ottenere la soluzione di controllo (Ctrl).
   2. Posizionare pool di embrioni di numero uguale in pozzetti diversi di una piastra a 6 pozzetti e iniziare il trattamento mediante immersione nel bagno: per ogni pozzetto, sostituire il terreno E3 con un terreno E3 contenente il veicolo di controllo (0,0025% DMSO) o farmaci diluiti alla concentrazione desiderata (0,25 μM, 0,0025% DMSO) come menzionato in precedenza. Utilizzare 3 ml di soluzione farmacologica per pozzetto.
      NOTA: Per eliminare gli effetti causati dalla variazione delle concentrazioni del vettore (DMSO), è importante assicurarsi che sia la soluzione di controllo che quella di trattamento abbiano la stessa concentrazione finale di DMSO.
   3. Conservare gli embrioni trattati a 28 °C prima di raccoglierli fino allo stadio di sviluppo desiderato per i saggi di follow-up (qui: analisi morfometrica e convalida IHC).

2. Imaging FRET multispettrale dal vivo di modelli di zebrafish RASopathy allo stadio di gastrula e analisi dei dati

1. Montaggio di gastrule per l'imaging dal vivo (Giorno 4) (Figura 2A)
   1. Preparare il terreno di montaggio per embrioni vivi sciogliendo 1,5 g di agarosio a basso punto di fusione (LMA) in 1x PBS per ottenere l'1,5% di LMA/E3.
      NOTA: Scegliere la concentrazione di agarosio da 0,8 a 1,5% a seconda dello stadio di sviluppo e della necessità specifica di trattenere il pesce. Distribuire la soluzione di LMA appena prodotta in aliquote del formato desiderato e conservare l'LMA allo stato polimerizzato a RT (stabile per alcuni mesi). In questo modo si riduce al minimo la contaminazione batterica e fungina, ma si controlla regolarmente la qualità dell'aliquota LMA prima dell'uso.
   2. Prima di montare il campione, fondere l'aliquota LMA all'1,5% in un termomiscelatore o in un bagno d'acqua sterile a 50 °C. Una volta sciolto, diminuire la temperatura del termomiscelatore a circa 30 °C.
   3. Posizionare un singolo embrione Teen⁺ iniettato (in questo caso una gastrula che esprime Shp^D61G) al centro di un piatto di vetro con fondo di 35 mm di diametro per l'imaging dal vivo e orientarlo utilizzando un capello sottile. Rimuovere il terreno E3 in eccesso e immobilizzare l'embrione mettendo sopra una goccia di LMA e lasciandolo polimerizzare a RT.
      NOTA: All'inizio del processo di polimerizzazione, il pesce può essere orientato nella posizione desiderata. Si consiglia vivamente di utilizzare l'LMA a una temperatura non superiore a 35 °C per evitare danni ai tessuti.
2. Impostazione dei parametri di microscopia ed esecuzione dell'imaging FRET multispettrale delle gastrule (Giorno 4) (Figura 2B)
   NOTA: Il protocollo si applica all'uso di qualsiasi piattaforma di microscopia confocale dotata di tutto l'hardware e il software necessari per eseguire l'imaging FRET. Qui abbiamo utilizzato un microscopio confocale dotato di un laser a ioni argon con le linee di lunghezza d'onda di 458-476-488-496-514 nm, un divisore di fascio acusto-ottico programmabile (AOBS) che separa la luce di eccitazione e di emissione, due rivelatori ibridi spettrali (HyD) e un incubatore da palco per mantenere stabili le condizioni di temperatura (a 28 °C) e umidità durante l'imaging dal vivo dei campioni.
   Il protocollo di imaging FRET multispettrale dal vivo, come descritto, può essere applicato a embrioni in diversi stadi di sviluppo oltre alle gastrule precoci, come dimostrato da Fasano et al.⁷. Uno z-stack più grande dovrebbe essere preso in considerazione per le fasi di sviluppo successive (ad esempio, 24 hpf) così come le impostazioni appropriate degli intervalli z e t per consentire fasi di rilevamento multispettrale durante l'acquisizione di immagini FRET spettrali.
   1. Accendere il controller dell'incubatrice almeno 1 ora prima di iniziare l'acquisizione e impostare la temperatura a 28 °C per mantenere gli embrioni di zebrafish in uno stato sano. Una volta che la temperatura dell'incubatore si è stabilizzata, posizionare la piastra di imaging con l'embrione sul supporto del campione e utilizzare un obiettivo 10x/dry (apertura numerica di 0,4) per visualizzare rapidamente il campione.
   2. Nella configurazione laser del software di riferimento, accendere il laser agli ioni di argon e utilizzare il cursore per regolare la potenza del laser al 50%. In Impostazioni hardware, scegli la risoluzione di profondità a 8 bit con cui verranno acquisite le immagini.
   3. Selezionare la modalità di scansione XYλZ di rilevamento spettrale nel pannello di acquisizione e impostare i seguenti parametri di acquisizione: formato immagine: 512 x 512 px; velocità di scansione di 400 Hz; zoom ottico di 0,75.
   4. Attivare la linea laser a 458 nm del laser agli ioni di argon e impostarne il valore di intensità, normalmente <10% (qui 8,5%).
   5. Selezionare un rivelatore HyD e regolare la sensibilità del rivelatore (guadagno) inserendo il valore desiderato (qui 500).
      NOTA: Per campioni vivi, debolmente fluorescenti e per accumulare meno rumore di fondo, è consigliabile utilizzare rivelatori ibridi piuttosto che tubi fotomoltiplicatori (PMT).
      Nel software di riferimento, la visualizzazione dello spettro di emissione di un colorante richiede l'attivazione di un rivelatore.
   6. Per iniziare, attivare il primo rivelatore (HyD) e selezionare la proteina di fluorescenza ciano (CFP) per visualizzare la sua curva di emissione. Aprire il menu a tendina della barra del rivelatore del software per aprire l'elenco di selezione per la curva di emissione CFP. Ora, attivare un secondo rivelatore per visualizzare la curva di emissione della seconda proteina di fluorescenza gialla colorante (YFP). Per visualizzare anche la curva di emissione Ypet , attivare un secondo rivelatore, quindi selezionare la curva di emissione YFP che apparirà nell'immagine dello spettro, dopo aver spento il secondo rivelatore.
      NOTA: Una volta completato questo passaggio, il secondo rivelatore deve essere disattivato, poiché in modalità di acquisizione spettrale viene utilizzato un solo rivelatore.
   7. Per avviare le acquisizioni in tempo reale, posizionare il cursore di rilevamento nell'intervallo di emissione del segnale più intenso (in questo caso, quello di YFP) per visualizzare il campione, decidere e impostare le posizioni di inizio e fine dello spessore del campione nella finestra z-stack LAS X.
   8. Per le proprietà dell'intervallo di scansione λ, impostare i seguenti parametri: inizio (460 nm) e fine (570 nm) dell'intervallo di rilevamento; Larghezza della banda di rilevamento: 5 nm; λ-scan Dimensione del passo: 5 nm. Avvia l'acquisizione z-stack.
      NOTA: I parametri indicati consentono agli utenti di ottenere un'immagine relativamente veloce con una risoluzione accettabile, ma è possibile utilizzare impostazioni diverse. Nelle impostazioni del disco del fluorifier, il filtro NOTCH inserito automaticamente può essere deselezionato per evitare la perdita di intensità singola.
   9. Per valutare i cambiamenti del segnale in tempo reale dopo l'esposizione a MEKi, montare un singolo embrione mutante (qui Shp2^D61G) in un piatto di vetro e creare un'immagine prima e dopo il trattamento farmacologico. Per questi esperimenti dal vivo, eseguire direttamente il trattamento farmacologico mediante immersione in bagno durante la sessione di imaging con un massimo di 2 ml della soluzione contenente il farmaco disciolto.
3. Post-elaborazione delle immagini e separazione multispettrale dei coloranti per ottenere immagini FRET raziometriche (Giorno 5) (Figura 2C)
   1. Per separare l'emissione del donatore (CFP) e dell'accettore (Ypet), assicurarsi di eliminare il contributo dell'emissione di fluorescenza di entrambe le molecole nel canale FRET, chiamato bleedthrough spettrale (SBT).
      1. Fare riferimento ai database di coloranti/proteine fluorescenti disponibili al pubblico per visualizzare e scaricare il file .cvs relativo a uno spettro di emissione CFP standard (spettri di eccitazione ed emissione).
      2. Nel pannello Dati del file .cvs, scegli l'opzione Testo in colonne e suddividi i dati in colonne utilizzando una virgola come delimitatore. Il file risultante includerà informazioni aggiuntive (ad esempio, eccitazione CFP, CFP 2P) che dovrebbero essere rimosse. Conservare solo i dati della colonna relativi alla lunghezza d'onda e all'emissione.
      3. Nella colonna delle emissioni CFP, rimuovere tutti i dati sull'intensità a partire da 501 nm.
      4. Salvare il file dello spettro di emissione CFP adattato da 460 a 500 nm in formato .xls (denominato "eCFP modificato" nella Figura 2C).
      5. Ripetere la stessa procedura per scaricare ed elaborare lo spettro di emissione della proteina YFP e conservare solo i dati della colonna relativi alla lunghezza d'onda e all'emissione. Rimuovere tutti i valori di emissione fino a 524 nm. Salvare il file dello spettro di emissione YFP adattato da 525 a 650 nm in.xls formato (chiamato "Ypet da 525 nm" nella Figura 2C).
      6. Per consentire l'esclusione del bleed-through spettrale (SBT) nel database dei coloranti disponibile nella finestra di configurazione del software, inserire e salvare due spettri di emissione di riferimento adattati per CFP e YFP.
   2. Selezionare il file di immagine spettrale risultante dalla sessione di imaging, aprire la finestra Processo e selezionare Separazione colorante spettrale nello strumento Separazione colorante. Configurare le impostazioni per la separazione dei coloranti come segue: negli elenchi a discesa sul lato sinistro della finestra di dialogo, selezionare il nuovo spettro di emissione CFP (eCFP modificato) in prima posizione e il nuovo spettro di emissione YFP (Ypet da 525 nm) dal database dello spettro.
   3. In Riscala, selezionare Per canale per scalare i canali singolarmente quindi, nella scansione λ delle immagini, scegliere quello con la maggiore intensità del segnale (corrispondente al passo 14 della scansione spettrale a livello del picco di emissione del canale FRET, indicato dalla freccia bianca nel pannello che mostra i passi di rilevamento a destra della Figura 2B). Quindi, spostarsi lungo la scansione Z del campione e scegliere la sezione ottica che evidenzia l'area di interesse sulla zona del margine.
   4. Utilizzare la modalità di selezione del ROI sulla zona di margine del palo dell'animale per definire l'area con lo spettro migliore. Cliccare su ROICrosshair indicato in alto nella finestra di visualizzazione per richiamare il mirino e regolare la dimensione del ROI di riferimento inserendo il valore di 40 voxel nell'Area Misure. Definisci con precisione l'area di interesse dal ROICrosshair. Nel diagramma immagine, scegliere la normalizzazione dei dati, quindi fare clic su Applica per eseguire la separazione dei coloranti con le impostazioni configurate.
   5. Apri questo file appena generato ottenuto con i due canali separati e produci un'immagine di proiezione bidimensionale dalla serie di immagini tridimensionali (proiezione di massima intensità) per la visualizzazione dei dati.
   6. Nella finestra Processo , selezionare Ritaglia per separare i canali in due file separati, i canali CH1 e CH2 (o FRET).
   7. Nella finestra Processo , seleziona Combina immagini, seleziona il file CH2 e inseriscilo nella prima opzione, quindi seleziona il file CH1 e inseriscilo nella seconda opzione. Impostare una riscala con fattore 5 e scegliere l'operazione Rapporto. Quindi, fare clic su Applica per generare il nuovo file contenente l'immagine raziometrica (YFP/CFP). Salvare il file per l'analisi dei dati di follow-up.
4. Analisi quantitativa dei segnali FRET e resa delle immagini (Giorni 5-6) (Figura 2D)
   1. Per misure quantitative dei segnali FRET da immagini raziometriche FRET/CFP, eseguire l'esperimento su N>2 embrioni (repliche), sulla base di una valutazione statistica a priori basata sull'effetto atteso. Utilizza un pacchetto di elaborazione delle immagini come il software open source Fiji. Importa i file di immagine ottenuti dall'imaging spettrale e dalla separazione dei coloranti in un pacchetto di analisi delle immagini come l'open source Fiji.
   2. Prima di iniziare con la selezione della ROI sulle immagini delle gastrule, impostare i parametri come letture delle misure utilizzando la funzione Analizza | Imposta le misure | selezionare i parametri di interesse, ad esempio Area, Densità integrata e Valore medio di grigio.
   3. Selezionare la regione di interesse (in questo studio specifico: il margine della gastrula) utilizzando lo strumento di selezione dei poligoni dalla barra degli strumenti. Salva le specifiche ROI x,y facendo clic su Analizza | Strumenti | Responsabile del ROI.
   4. Per eseguire misurazioni in un ROI selezionato, fare clic su Analizza | Misurare. Ripeti questi passaggi per ogni ROI e immagine/condizione.
      NOTA: Se necessario, salvare l'immagine come . Formato TIFF. È possibile salvare tutte le misure di ROI derivanti da più immagini in un unico file ROI. Rinomina ogni misura nell'elenco di gestione ROI con il nome corretto relativo a ciascun campione/immagine.
   5. Per ogni condizione (mutante e mutante + trattamento qui), estrarre tutti i valori del rapporto FRET/CFP per ogni ROI selezionato ottenuto e organizzarli in un foglio di lavoro organizzando, ad esempio, i gruppi sperimentali in colonne e ogni valore grezzo in righe.
   6. Utilizzare qualsiasi software adatto per valutare le differenze statistiche dei segnali FRET tra diverse condizioni sperimentali e per la generazione di grafici e la visualizzazione dei dati.
      NOTA: Sono disponibili software open source e con licenza per l'analisi dei dati e le soluzioni grafiche.
   7. Organizzare un progetto specifico per la valutazione statistica considerando tutte le misure grezze e il numero di repliche per ogni condizione sperimentale. Per l'analisi statistica di una singola replica biologica, creare una tabella di colonne con una variabile di raggruppamento, con ogni gruppo definito da una colonna. Per l'analisi statistica di più di una replica biologica, creare tabelle raggruppate con almeno due variabili di raggruppamento, una definita da colonne (ad esempio, condizioni sperimentali) e l'altra definita da righe (ad esempio, valori medi delle repliche).
   8. Dopo aver organizzato in modo appropriato i gruppi sperimentali nel foglio di lavoro, valutare la distribuzione dei dati (test di normalità, ad esempio, D'Agostino-Pearson, Anderson-Darling) e, in base al risultato, scegliere il test statistico più appropriato.
      1. Eseguire un'ANOVA unidirezionale per i dati parametrici (seguendo la distribuzione gaussiana) e il test di Kruskal-Wallis per i dati non parametrici. Se sono presenti più fattori (concentrazioni genetiche e di farmaci), prendere in considerazione un'ANOVA a due vie. Confrontare il valore FRET medio per ciascuna condizione l'una con l'altra (confronti multipli) e correggere i confronti multipli utilizzando un test post hoc (ad esempio, il test di Tukey e quello di Dunn per dati parametrici e non parametrici, rispettivamente).

3. Validazione IHC dei risultati FRET e analisi morfometrica correlativa dei difetti di gastrulazione

1. Preparazione delle soluzioni e fissazione e montaggio dell'embrione per IHC contro tERK e pERK (Giorno 7) (Figura 3A)
   1. Preparare le soluzioni funzionanti necessarie per IHC.
      1. Preparare una soluzione madre di 10x PBS sciogliendo 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na₂HPO₄ e 2,4 g di KH₂PO₄ in 1 L di acqua DD. Autoclavare la soluzione in autoclave per mantenerla sterile.
      2. Preparare una soluzione di PBS-Triton allo 0,8% (PBSTr) sciogliendo 8 mL di Triton X-100 al 10% in un volume finale di 100 mL di 1x PBS.
      3. Preparare soluzioni di glicerolo al 20%, 50% e 80% diluendo rispettivamente 3 ml, 7,5 ml e 12 ml di glicerolo al 100% in un volume finale di 15 ml di 1x PBS.
   2. Preparare paraformaldeide al 4% (PFA)/PBSTr allo 0,25% (soluzione fissativa) mescolando 2,5 mL di PFA al 16% in 250 μL di Triton X-100 al 10% precedentemente disciolto in un volume finale di 10 mL di 1x PBS. Utilizzare questa soluzione per fissare gli embrioni a 6 hpf durante la notte a 4 °C. Utilizzare provette da 2 ml e un massimo di cinque embrioni per provetta per consentire una fissazione e un lavaggio efficienti.
      NOTA: Si consiglia di preparare un nuovo fissativo per ogni giro di fissaggio. ATTENZIONE: Quando si maneggia la formaldeide al 16%, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) e sotto un cappuccio chimico.
   3. Lavare gli embrioni nelle provette da 2 mL riempiendole con 1,5 mL di PBSTr allo 0,8% per alcune volte. Trasferire gli embrioni in nuove provette da 2 ml e conservare gli embrioni in 1x PBS fino al momento dell'uso.
      NOTA: Se non si ha familiarità con la manipolazione degli embrioni precoci di zebrafish, lavorare al microscopio stereoscopico per evitare la perdita di embrioni durante il pipettaggio. Utilizzare materiale plastico "a basso legante" per ridurre la possibile appiccicosità degli embrioni alla parete del tubo.
2. Permeabilizzazione tissutale e IHC contro pERK e tERK (giorni 7-9)
   NOTA: I risultati dell'IHC dipendono da più variabili che possono differire tra i laboratori e potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione specifica dei protocolli.
   1. Lavare gli embrioni di zebrafish fissati in 1 mL di PBSTr allo 0,8% per 3 x 10 minuti a RT.
   2. Permeabilizzare i campioni con 2 μl di proteinasi K diluita in PBSTr allo 0,8% (1:1.000) per 2 minuti a RT.
   3. Arrestare la permeabilizzazione del tessuto lavando i campioni in 1 mL di PBSTr allo 0,8% per 3 x 10 minuti e postfissare i campioni in 500 μL di PFA al 4%/1x PBS per 20 minuti a RT. Quindi, lavare i campioni in 1 mL di PBSTr allo 0,8% per 3 x 10 minuti.
      NOTA: Il metodo e il tempo utilizzato per la permeabilizzazione dei tessuti sono passaggi critici che possono essere influenzati dal tipo di antigene, dalla qualità della conservazione dei tessuti e dai fattori ambientali. Ottimizza il protocollo prima di applicarlo su campioni preziosi.
   4. Incubare i campioni con 1 tampone bloccante (BB) contenente il 5% di siero di capra normale (NGS), l'1% di albumina sierica bovina (BSA), l'1% di DMSO, preparati come segue: 75 μL di 100% NGS, 150 μL di 10% BSA e 15 μL di DMSO al 100% in un volume finale di 1,5 mL di 0,8% PBSTr. Utilizzare 200 μL di soluzione per provetta e incubare gli embrioni per 20-30 minuti a RT nella soluzione.
   5. Rimuovere 1x BB dal passaggio precedente e incubare i campioni in una soluzione contenente una miscela degli anticorpi primari desiderati (qui: diluendo 1 μL di anticorpo monoclonale primario di topo p44/42 MAPK, ERK totale, tERK, + 1 μL di fosfo-p44/42 MAPK policlonale di coniglio, ERK fosforilato, pERK) in 250 μL di soluzione 1x BB appena preparata. Utilizzare 200 μl di soluzione per provetta e incubare gli embrioni nella soluzione per una notte a 20 °C.
   6. Per eliminare il legame aspecifico, lavare i campioni con 1 mL di PBSTr allo 0,8% più volte (prima lavaggio ogni 10 minuti e poi ogni 30 minuti).
   7. Incubare i campioni in 1 BB appena preparato per 20 minuti a RT. Utilizzare 200 μl per provetta.
   8. Rimuovere 1x BB dal passaggio precedente e incubare i campioni con una miscela di anticorpi secondari (1 μL di anti-topo di capra coniugato fluorescente 488, + 1 μL di anti-coniglio di capra 633 coniugato fluorescente in 600 μL di soluzione di BB 1x). Lasciare gli embrioni agitati delicatamente per una notte a 20 °C.
      NOTA: Abbiamo eseguito l'IHC su pesci adolescenti negativi (non transgenici) dello stesso lotto utilizzato per l'imaging FRET. In alternativa, è possibile utilizzare anche il pesce Teen⁺ , ma in questo caso dovrebbero essere impiegati anticorpi secondari coniugati a fluorofori che non si sovrappongono agli spettri di emissione di CFP o YFP.
   9. Eliminare l'associazione non specifica come descritto in precedenza.
   10. Lavare i campioni in un gradiente di soluzioni di glicerolo/1x PBS (20%, 50%, 80%) per 15 minuti per ciascuna soluzione a RT. Conservare i campioni in glicerolo al 90%/1x PBS a 4 °C.
       NOTA: Per ridurre al minimo il possibile decadimento della fluorescenza, conservare i campioni al buio.
3. Microscopia confocale di tessuto immunocolorato e analisi quantitativa (Giorni 10-11) (Figura 3B-E)
   1. Monta gli embrioni come descritto in precedenza.
   2. Impostare i parametri di acquisizione al microscopio confocale come segue: laser bianco all'80%, intervallo di emissione della fluorescenza a 507 - 551 nm per anti-topo di capra coniugato fluorescentmente (in questo caso con lo spettro di emissione di 488 nm, utilizzato per tERK), 644 - 740 nm per capra coniugata fluorescentmente anti-coniglio (in questo caso con lo spettro di emissione di 633 nm, utilizzato per pERK). Seleziona la modalità di acquisizione sequenziale, un formato di scansione di 512 x 512 px e una velocità di 400 Hz. Definisci l'inizio e la fine della scansione con uno spessore della dimensione z-step di 4 - 5 μm e uno zoom digitale standard di 1. Utilizzare l'obiettivo 25x ad immersione in acqua (con apertura numerica di 0,05) per acquisire l'intera gastrula a 6 hpf
      ATTENZIONE: Questo protocollo include l'applicazione di laser che possono essere dannosi; Pertanto, richiede la formazione del personale secondo i requisiti nazionali specifici.
   3. Dopo l'acquisizione dell'immagine confocale, ispezionare il file di immagine grezzo ottenuto utilizzando un pacchetto di elaborazione delle immagini come il software open source Fiji.
      1. Nelle Figi, utilizzare il comando Dividi canali dal menu Immagine e dal sottomenu Colore per ottenere un'immagine di un singolo canale (totale ERK: canale = 0, C = 0; pERK: canale = 1, C = 1) e generare un'immagine di proiezione z di massima intensità per entrambi i canali facendo clic su Immagine | Pile | Progetto Z.
      2. Ripetere la procedura per le misurazioni dell'intensità del ROI come descritto in precedenza ed estrarre i dati in un foglio di lavoro.
      3. Per dedurre le variazioni di intensità del segnale p-ERK nel ROI desiderato tra i gruppi sperimentali, calcolare il rapporto p-ERK/t-ERK dividendo i valori grezzi di densità integrata della colorazione p-ERK per la densità grezza integrata del segnale t-ERK. Procedere alla valutazione della significatività statistica come al punto 2.4.
         NOTA: Le impostazioni dei parametri di imaging possono essere modificate in base alle esigenze specifiche e considerando la durata di ciascun campione, la qualità delle immagini desiderata e il numero di piani da acquisire.
4. Misure degli assi in 11 embrioni hpf (Giorno 4 per la fissazione dell'embrione, Giorno 12 per l'acquisizione e l'analisi dei dati) (Figura 4A-D)
   1. Al termine della gastrulazione (11 hpf), fissare gli embrioni con PFA al 4% in 1x PBS per 20 minuti a RT, lavare più volte in 1x PBS e conservare a 4 °C fino all'acquisizione dell'immagine.
   2. Orientare gli embrioni lateralmente utilizzando una pipetta Pasteur in un singolo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente 1x PBS fresco.
   3. Per valutare la presenza di una forma ovale (rapporto assi embrionali Y/X > 1), un fenotipo caratteristico della rasopatia nel pesce zebra e il rapporto di salvataggio morfologico degli assi embrionali come risultato dell'efficacia del trattamento, acquisire immagini di embrioni interi utilizzando uno stereomicroscopio con un obiettivo di ingrandimento 3,4x (obiettivo di scansione 0,63x x fattore di zoom 8,60) semplicemente catturando immagini in modalità campo chiaro.
   4. Importa il file immagine in un pacchetto di analisi delle immagini come l'open source Fiji.
      1. Misura la lunghezza degli assi degli embrioni (x, asse minore; y, asse maggiore) selezionando lo strumento dritto dalla barra degli strumenti e facendo clic su Analizza | Misurare. Dopo aver eseguito le misurazioni selezionate, aggiungerle all'elenco del ROI manager e salvare il file ROI come spiegato sopra per l'analisi dell'imaging FRET.
         NOTA: Ripetere questi passaggi per ogni immagine dell'embrione.
   5. Procedi con l'esportazione dei dati in un foglio di lavoro e calcola il rapporto degli assi dividendo la lunghezza dell'asse maggiore (y) per la lunghezza dell'asse minore (x). Calcola la media, la deviazione standard della media o l'errore standard della media di diverse repliche.
   6. Procedere all'analisi statistica dei dati come al punto 2.4.

Risultati

Questo protocollo mostra un flusso di lavoro semplice per generare rapidamente modelli di RASopathy transitori in embrioni di zebrafish e valutare le fluttuazioni ERK nei mutanti precoci con un metodo di imaging FRET live standard applicato a un sensore ERK zebrafish di recente costituzione ^6,9. Come recentemente dimostrato ^6,7 all'interno dello stesso flusso di lavoro s...

Discussione

Nonostante decenni di ricerca e miriadi di mutazioni che portano a forme altamente eterogenee di RASopatie ora mappate, varianti genetiche con significato sconosciuto continuano ad emergere dagli sforzi di sequenziamento su pazienti non diagnosticati. In effetti, in molti casi, la diagnosi basata esclusivamente sulle caratteristiche cliniche può essere impegnativa e gli approcci genomici funzionali per convalidare i risultati del sequenziamento rimangono fondamentali. Inoltre, nonostant...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Mini-sub Cell GT Horiziontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1704406	Gel Elecrophoresis
PC-100 Vertical puller	Narishige	-	Needle puller
PowerPac Universal Power Supply	Bio-Rad	1645070	Gel Elecrophoresis
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Plasmid preparation
Softwares
Biorender	Biorender	CC-BY 4.0 license	Cartoon elaboration for Figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Data analyses
Fiji software	ImageJ	15.3t	Imaging rendering and quantitative analyses (FRET signals measurements, ERK fluorescence intensity in IHC assay, embryo axes lenght)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Statistical data analyses
iControl spectrophotometer software	Tecan	v. 2.0	RNA quantification
Illustrator	Adobe	26.0.3 (64-bit)	Figure assembling
LASX software	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Imaging acquisition for spectral FRET experiments and embryo imaging for axes lenght measurements
Q9 Mini 18.02-SN software	Uvitec	-	Gel image acquisition