Эффективный протокол для оценки модуляции активности ERK на ранних моделях синдрома данио-рерио Нунан с помощью живой FRET-микроскопии и иммунофлуоресценции

Резюме

RASopathies — это мультисистемные генетические синдромы, вызванные гиперактивацией пути RAS-MAPK. Потенциально патогенные варианты, ожидающие валидации, появляются постоянно, в то время как слабые доклинические данные ограничивают терапию. В этой статье мы описываем наш протокол in vivo для тестирования и перекрестной проверки уровней активации ERK, ассоциированных с RASopathy, и ее фармакологической модуляции во время эмбриогенеза с помощью визуализации FRET в реальном времени у рыбок-репортеров-подростков.

Аннотация

РАСопатии — это генетические синдромы, вызванные гиперактивацией ЭРК и приводящие к мультисистемным заболеваниям, которые также могут привести к предрасположенности к раку. Несмотря на широкую генетическую гетерогенность, в основе большинства случаев лежат мутации зародышевой линии в ключевых регуляторах пути RAS-MAPK, и, благодаря передовым методам секвенирования, продолжают выявляться потенциально патогенные варианты, влияющие на путь RAS-MAPK. Функциональная валидация патогенности этих вариантов, необходимая для точной диагностики, требует быстрых и надежных протоколов, предпочтительно in vivo. Учитывая нехватку эффективных методов лечения в раннем детстве, такие протоколы, особенно если они масштабируемы на экономически эффективных животных моделях, могут сыграть важную роль в обеспечении доклинической основы для перераспределения/перепрофилирования лекарств.

Здесь мы пошагово описываем протокол быстрого создания моделей транзиторной RASopathy у эмбрионов рыбок данио-рерио и непосредственного изучения изменений активности ERK в живых заболеваниях, происходящих уже во время гаструляции, с помощью мультиспектральной визуализации резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) в реальном времени. В протоколе используется трансгенный репортер ERK, недавно созданный и интегрированный с аппаратным обеспечением коммерческих микроскопов. Приведен пример применения моделей данио-рерио с синдромом Нунан (NS), полученных путем экспрессии Shp2^D61G. Описан простой метод, позволяющий регистрировать изменение сигнала ERK в модели NS fish до и после модуляции фармакологического сигнала доступными ингибиторами MEK в низких дозах. Мы подробно описываем, как генерировать, извлекать и оценивать ратиометрические сигналы FRET из мультиспектральных наблюдений до и после лечения, а также как проводить перекрестную проверку результатов с помощью классической иммунофлуоресценции на целых эмбрионах на ранних стадиях. Затем мы описываем, как, изучая стандартные морфометрические параметры, исследовать поздние изменения формы эмбриона, указывающие на результирующее нарушение гаструляции, у тех же эмбрионов, чья активность ERK оценивается с помощью живого FRET через 6 ч после оплодотворения.

Введение

РАСопатии – это генетические синдромы, которые нарушают нормальное развитие и поражают различные органы и ткани. Эти состояния часто вызваны мутациями зародышевой линии в ключевых генах и участниках, участвующих в передаче сигналов RAS/MAK, что приводит к гиперактивации (повышенному фосфорилированию) внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK). ERK регулирует некоторые фундаментальные процессы, важные во время развития - рост тканей - путем перемещения в ядро ^1,2. Соматические мутации в генах, участвующих в пути RAS-MAPK, являются наиболее распространенными событиями, приводящими к раку³. Таким образом, неудивительно, что предрасположенность к раку наблюдается и при РАСопатиях. Синдром Нунана (НС), характеризующийся задержкой развития, низким ростом, когнитивным дефицитом различной степени тяжести и кардиомиопатией, является наиболее распространенной формой РАСопатии². В большинстве случаев заболевание вызвано мутациями GoF в PTPN11, первом гене RASopathy, который был обнаружен в начале 2000 года4 и кодирует протеин тирозинфосфатазу SHP2, который действует как положительный регулятор этого пути.

С тех пор, благодаря экспоненциальному использованию подходов к секвенированию экзома у недиагностированных пациентов, потенциально патогенные варианты, влияющие на факторы, участвующие в RAS-MAPK, и, вероятно, связанные с различными формами RASopathies, продолжают обнаруживаться и ожидают функциональной характеристики для эффективной стратификации^{пациентов.} Для достижения этой цели необходимы экспериментальные протоколы, гарантирующие быструю и информативную функциональную валидацию на уровне организма. Использование классических и стандартизированных моделей млекопитающих для тестирования вариантов с неизвестным значением было бы дорогостоящим, чрезвычайно трудоемким и потребовало бы инвазивных методов на непрозрачных крупных животных. Такая стратегия явно несовместима с требованием о быстром тестировании, учитывая социальную нагрузку, которую представляют плохие или недиагностированные пациенты с RASopathy, в настоящее время не имеющие ведения или лечения. Протоколы количественной оценки ключевых фенотипических признаков и молекулярных коррелятов в целых организмах также послужат ускорению возможной клинической трансляции лекарств, которые могут быть доступны пациентам с RASopathy, путем перепрофилирования/перепозиционирования.

Рыбки данио являются идеальной моделью позвоночных для изучения заболеваний, влияющих на раннее развитие. Начнем с того, что рыбки данио имеют высокий уровень генетической гомологии с человеком. Высокая плодовитость взрослых рыб приводит к большому производству эмбрионов, которые малы и быстро развиваются. Эмбрионы прозрачны на ранних стадиях, так что основные процессы развития — эпиболия, гаструляция, оси и формирование плана тела — могут быть легко визуализированы с помощью стандартной микроскопии. Кроме того, наличие трансгенных линий, которые можно использовать для отслеживания специфического клеточного поведения и динамических молекулярных событий в пространстве и времени во время развития, в сочетании с передовыми методами создания генетических моделей, является непревзойденным. Кроме того, фенотипические показания могут быть оценены на нескольких уровнях у рыбок данио (от организменных до клеточных дефектов), и уже разработаны специальные анализы для нескольких заболеваний, включая RASopathies⁵. Более того, относительно простые методы погружения в ванну для введения лекарств на ранних стадиях, по крайней мере, для водорастворимых соединений, позволяют проводить высокопроизводительный скрининг лекарств in vivo в формате 96 лунок.

С молекулярной точки зрения, исследования с использованием стандартных подходов, таких как иммуногистохимия и иммуноблоттинг, убедительно демонстрируют корреляцию между активацией ERK и RASopathy-ассоциированными дефектами развития у эмбрионов рыб ^6,7. Недавно разработанный биосенсор FRET типа EKAR у рыбок данио (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) представляет собой надежный инструмент in vivo для регистрации активации ERK во время эмбриогенеза с пространственно-временным разрешением. Следовательно, это может быть полезно для лучшей оценки динамических изменений ERK и фармакологических модуляций в моделях рыб RASopathy.

В сенсоре Teen специфический субстрат ERK в репортере фосфорилируется при активации ERK, вызывая конформационное изменение, которое приводит к тому, что донор флуоресцентного CFP (D) и акцептор флуоресцентного Ypet (улучшенный YFP) (A) находится в непосредственной близости друг от друга. Если спектр излучения D значительно перекрывается со спектром поглощения A, может произойти FRET (поглощение энергии от D к A). Это пропорционально расстоянию между D и A и, следовательно, у подростка — статусу активации ERK. Различные протоколы визуализации могут быть настроены с использованием как стандартных, так и усовершенствованных модулей визуализации стандартных или конфокальных микроскопов как в живых, так и в фиксированных образцах. При D-возбуждении получение мультиспектральных сканов вдоль определенного спектра излучения (λ) от CFP до YFP с последующим использованием спектральных алгоритмов «несмешивания» является одним из наиболее надежных методов регистрации и количественной^{оценки данных} FRET. Его можно применять и к живым образцам рыбок данио-рерио для записи динамики тканей in vivo .

В соответствии с предыдущими отчетами ^6,9 и нашим недавним приложением⁷, здесь мы подробно описываем пошаговый рабочий процесс с использованием рыб-подростков для оценки активации ERK в клетках на краю животного полюса NS моделей в начале гаструляции и соотнесения его с характерными дефектами осей тела, видимыми только на более поздних этапах развития. Мы показываем, как получить и изучить количественные данные FRET из живых гаструл NS до и после лечения доступным MEKi, а также как провести перекрестную валидацию результатов с помощью стандартной иммуногистохимии против фосфорилированного (активного) ERK или выполнить корреляционный морфометрический анализ дефектов удлинения эмбриона.

Рабочий процесс может быть применен для повышения функционального тестирования новых вариантов и генов заболеваний, предположительно связанных с RASopathies, а также для получения информации о корреляции динамики активации ERK в пространстве и во времени во время развития позвоночных и морфологических дефектов у эмбрионов. Мы показываем, что этот протокол также может быть использован для проверки эффективности препаратов-кандидатов, действующих на модулирование активации ERK.

протокол

Все экспериментальные процедуры, связанные с содержанием и разведением животных, проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE, касающимися использования рыбок данио в исследованиях на животных, и одобрены Министерством здравоохранения Италии (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF). Все реакции ДНК/РНК и сеансы визуализации могут быть увеличены или уменьшены по желанию, в зависимости от требуемого конечного материала или количества тестируемых генов и вариантов.

1. Создание и медикаментозное лечение транзиентных моделей РАСопатии данио-рерио

Примечание: Для мониторинга экспрессии RASopathy-ассоциированных вариантов можно использовать специфические конструкции, содержащие желаемую кодирующую последовательность (cds) интересующего белка в кадре с компакт-дисками небольших нефлуоресцентных меток (таких как myc или аналогичные). Таким образом, уровни экспрессии мутантного белка могут быть оценены с помощью стандартного вестерн-блоттинга на метке. Если антитела против конкретного белка, представляющего интерес, доступны, можно избежать меток. Иммунофлюоресценция также может быть использована для оценки экспрессии белка в ткани эмбриона в соответствии со стандартными протоколами. Этот тип контрольного эксперимента может быть полезен для корреляции экспрессии мутантного белка с уровнями индуцированной активации ERK. Использование флуоресцентных меток не рекомендуется в сочетании с FRET-визуализацией, учитывая возможные перекрестные помехи флуоресцентного излучения во время микроскопии.

1. Линеаризация плазмид (дни 1-2) (Рисунок 1A)
   ПРИМЕЧАНИЕ: При создании модели транзиторного заболевания у рыбок данио (в данном случае RAsopathy), вызванного мутацией GoF, влияющей на определенный ген, быстрым подходом является получение мРНК, кодирующей дикий тип (WT) и мутантный белок, представляющий интерес, которые затем следует ввести эмбрионам рыбок данио, выполнив следующие шаги. Плазмида, используемая в качестве матрицы для транскрибирования мРНК, должна содержать желаемую полноразмерную CDS (кодирующую последовательность) для интересующего гена, клонированного ниже промотора полимеразы T7, Sp6 или T3 и выше сигнала полиаденилирования (полиА). Если он недоступен, первым шагом является его получение путем клонирования рыбки данио или желаемого человеком CDS в подходящем векторе¹⁰ и валидации с помощью секвенирования по Сэнгеру. Для клонирования учитывайте дополнительное время (в среднем 1 неделя, включая клонирование, скрининг колоний, а также изоляцию и расширение правильных клонов).
   1. Линеаризируйте плазмиду подходящими ферментами рестрикции, разрезая ее только один раз после сигнала polyA (в данном случае KpnI). Для достижения эффективной линеаризации плазмид смешайте 3 γ (мкг/мкл) плазмидной ДНК, 2 мкл фермента рестрикции (20 000 ЕД/мл) и 10 мкл 10-кратного реакционного буфера в конечном объеме 100 мкл в воде, не содержащей нуклеаз. Тщательно перемешайте компоненты с помощью пипетирования несколько раз и инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 °C в течение 2-4 часов.
   2. Проверьте результат линеаризации методом электрофореза на 1,5% агарозном геле.
      1. Развести 10-кратный исходный раствор КЭ (48,5 г триса, 11,4 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл 0,5 М ЭДТА [pH 8,0]) водой, не содержащей нуклеаз.
      2. Приготовьте агарозный гель, растворив в микроволновой печи 1,5 г агарозы в конечном объеме 100 мл 1x раствора TBE. Затем добавьте 3,5 мкл красителя в виде геля.
      3. Отливайте гель, заливая раствор агарозы в камеры подходящего размера, в зависимости от количества условий/плазмид. Установите расчески и подождите примерно 1 час, пока гель застынет; Затем снимите расчески и поместите полимеризованный гель в соответствующий гелевый лоток для электрофореза.
      4. Смешайте несколько мкл переваренной плазмиды («разреза») и 1,5 мкл 6-кратного загрузочного буфера (содержащего краситель для контроля электрофореза) в конечном объеме 10 мкл воды, не содержащей нуклеаз. Таким же образом подготовьте отдельный контрольный образец с непереваренной плазмидой («неразрезанной»). Загрузите образцы в агарозные дорожки, а в первую полосу загрузите лестницу ДНК объемом 1 Кб. Проведите электрофорез ДНК при напряжении 100 В в течение 30 мин.
      5. Визуализируйте и задокументируйте полосы ДНК, полученные в результате прогона на стандартном УФ-трансиллюминаторе. Проверьте эффективность линеаризации плазмид, изучив структуру полос ДНК, сравнивая «разрезанные» и «неразрезанные».
         ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно линеаризованные плазмиды должны двигаться быстрее как одна острая полоса. Убедитесь, что расщепление ДНК завершено, потому что начало реакции транскрипции является ключевым ограничивающим этапом, которому может препятствовать присутствие циркуляризованных форм плазмид, что приводит к низкому выходу мРНК.
   3. Приступайте к очистке линеаризованной плазмиды с помощью имеющихся в продаже наборов для очистки ДНК на основе спин-колонок и храните очищенный препарат ДНК при температуре -20 °C до тех пор, пока не потребуется.
      Примечание: Вместо линеаризации можно использовать продукт ПЦР в качестве матрицы для транскрипции мРНК, при условии, что он включает последовательность промотора полимеразы до и сигнальную последовательность полиА ниже стоп-кодона. Продукты ПЦР также должны быть очищены и проверены на агарозном геле, прежде чем продолжить.
2. In vitro Транскрипция, очистка и контроль качества мРНК (дни 2-3) (Рисунок 1А)
   ПРИМЕЧАНИЕ: тщательно очистите рабочую зону и пипетки растворами для обеззараживания РНКазы. Использовать безнуклеазные материалы и реагенты; Надевайте перчатки. Это сведет к минимуму загрязнение РНКазой и позволит увеличить выход полноразмерной мРНК.
   Транскрибируйте и полиаденилированные мРНК, кодирующие WT и мутантные белки из линеаризованных плазмид, используя стандартные наборы для транскрипции мРНК in vitro и следуя инструкциям производителя.
   1. Центрифугируйте очищенную линеаризованную плазмиду в течение нескольких секунд при давлении 17949 × g , чтобы убедиться, что мусор собирается на дне пробирки и не попадает в реакцию транскрипции.
   2. Разморозьте все компоненты при комнатной температуре (RT) за исключением смеси аналогов NTP и CAP, которые хранятся на льду. Держите полимеразу при температуре -20 °C до использования.
   3. Перед использованием все реагенты кратковременно центрифугируются в концентрифуге в концентрации 17 949 × г , чтобы предотвратить потерю реагентов или случайное загрязнение, а также кратковременно перемешайте 10-кратный реакционный буфер и готовую к использованию аналоговую смесь NTP/CAP до тех пор, пока они полностью не окажутся в растворе. Держите 10-кратный реакционный буфер на RT.
   4. Приготовьте реакцию транскрипции в RT, добавив 600-800 нг линеаризованной и очищенной плазмиды в раствор, содержащий 10 мкл 2x аналоговой смеси NTP/CAP, 2 мкл 10x реакционного буфера, 2 мкл фермента SP6, T7 или T3 (в зависимости от конкретного промотора перед CDS в плазмиде) в конечном объеме 20 мкл, составленном из воды, не содержащей нуклеаз. Тщательно перемешайте, несколько раз перемешав пипеткой вверх и вниз.
   5. Инкубируйте реакцию транскрипции при 37 °C в термоциклере. Обязательно установите температуру крышки на 37 °C и запустите реакцию в течение 2 часов.
   6. Для удаления остаточной плазмиды, которая не была транскрибирована в ходе реакции, добавьте 1 мкл стандартного раствора ДНКазы (2 ЕД/мкл). Тщательно перемешайте реакцию с помощью пипетирования несколько раз и инкубируйте при 37 °C еще 30 минут.
   7. Прежде чем продолжить, проверьте качество и целостность синтезированной in vitro мРНК методом электрофореза TBE/formamide agarose. Растворите 1,0 г агарозы в 50 мл 1x раствора TBE, добавьте 5,5 мл 37% формамида и 3,5 мл красителя для геля, перемешайте и отлите гель, как описано выше.
      ВНИМАНИЕ: При работе с формамидом надевайте средства индивидуальной защиты (СИЗ) и используйте капюшон для химикатов.
   8. Смешайте 1 мкл транскрибируемой мРНК с 2,5 мкл 2x буфера для загрузки красителя Formamide в воде, не содержащей нуклеаз, в общем объеме 5 мкл. Тщательно перемешайте компоненты с помощью пипетирования несколько раз и загрузите образцы в гелевые дорожки. Запустите гель при напряжении 100 мВ в течение 10-15 минут в предварительно охлажденном буфере 1x TBE. Также запустите лестницу ДНК и/или РНК размером 1 кб.
   9. Дополнительно: Денатурируйте лестницу и мРНК при температуре 70 °C в течение 10 минут.
   10. Визуализируйте и задокументируйте полученные полосы мРНК на стандартном УФ-трансиллюминаторе.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Длительные работы и высокие температуры увеличивают вероятность деградации РНК.
   11. Если целостность и размер синтезированной РНК являются оптимальными, следует продолжить полиаденилирование С-концевого концевого слоя, добавив в реакцию: 36 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 20 мкл 5-кратного денатурирующего буфера, 10 мкл 25 мМ MnCl₂, 10 мкл 10 мМ АТФ и 4 мкл фермента полиаденилирования (например, очищенной поли(А) полимеразы E. coli ). Тщательно перемешайте реакцию с помощью пипетирования несколько раз и инкубируйте 100 мкл конечной реакции при 37 °C в течение еще 1 ч.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется проверять качество РНК с помощью гель-электрофореза после реакции полиА, потому что РНК будет выглядеть размазанной из-за хвостов полиА.
   12. Осаждение и восстановление синтезированной кэпированной и полиаденилированной мРНК с использованием соответствующих солей, таких как LiCl. Вкратце смешайте равные объемы воды, не содержащей нуклеаз, и стандартный 2,5 М раствор LiCl (30 мкл) и инкубируйте в течение >30 мин при -20 °C.
       Примечание: Эффективное осаждение может быть получено через 2 часа, но ночная инкубация обычно увеличивает конечный выход мРНК.
   13. Чтобы гранулировать очищенную мРНК, центрифугируйте реакцию в течение 30 мин при 4 °C при 17 949 × г и удалите надосадочную жидкость. Теперь промойте гранулу ~1 мл 70% этанола (EtOH) и центрифугируйте в течение 15 минут при 4 °C при 17 949 × г , чтобы удалить загрязнения и остаточные нуклеотиды из реакции.
   14. Высушите гранулу на воздухе, а затем снова суспендируйте в 20 μл воды, не содержащей нуклеаз. Хорошо растворите РНК путем осторожного и многократного пипетирования в режиме RT и инкубируйте через 10 минут.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Проверяйте гранулы каждые 5 минут, чтобы убедиться в испарении этиленоксида. При повторном введении, учитывая липкость РНК, пипетку пипетку до тех пор, пока она должным образом не растворится в воде.
   15. Оценить концентрацию и чистоту полученной мРНК путем измерения поглощения на длинах 260 нм и 280 нм (соотношение 260/280) в спектрофотометре. Измеряйте различные скалярные разведения препарата РНК, чтобы обеспечить правильную оценку концентрации.
       Примечание: В норме концентрация синтезированной РНК колеблется от 1 до 2 г/мл, но конечное количество может варьироваться в зависимости от длины CDS и количества исходного материала.
   16. Оценивая качество, храните запас мРНК в льду, затем аликвотируйте его в 5 μL аликвоты и храните при -80 °C до тех пор, пока не потребуется для инъекции.
3. Приготовление стандартных растворов и материалов для инъекций эмбрионов и медикаментозного лечения (2-3 дни, рисунок 1Б)
   1. Вытягивайте иглы для микроинъекций эмбрионов рыбок данио-рерио с использованием стерильных капилляров (стандартные размеры капилляров: 1,0 OD x 0,58 ID x 100 л мм). Используйте имеющийся в продаже съемник и примените желаемые настройки с точки зрения выходного напряжения, режима вытягивания (один или два шага) и усилия вытягивания для получения переменной длины наконечника, диаметра и формы иглы. О часто используемых особенностях игл для рыбок данио см. Абдельрахман и коллеги¹¹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные настройки могут варьироваться в зависимости от лаборатории, поскольку условия окружающей среды (такие как влажность или температура в помещении) могут влиять на результаты вытягивания иглы. Настройки следует регулярно перепроверять и калибровать. Выдернутые иголки можно хранить в РТ в чистых контейнерах в течение нескольких месяцев.
   2. Приготовьте 30x стоковый раствор "Danieau" при pH 7,6, растворив 101,7 г NaCl, 1,56 г KCl, 2,96 г MgSO₄ x 7H₂O, 4,25 г Ca(NO₃)₂ и 35,75 г HEPES в 1 л дважды дистиллированной (DD) воды для приготовления раствора для микроинъекций. Приготовьте также стоковый раствор фенолового красного в концентрации 5% в воде DD для использования в качестве видимого индикатора инъекционной смеси.
   3. Приготовьте раствор среды Е3 для роста эмбрионов, разбавив 4 мл NaCl (5 М), 680 мкл KCl (1 М), 1,32 мл CaCl₂ x 2H₂O (1 М) и 1,32 мл MgSO₄ (1 М) в конечном объеме 4 л воды обратного осмоса.
   4. Приготовьте стоковые растворы желаемых лекарственных препаратов (в данном примере: ингибитор MEK [MEKi] PD032590) в виде стоковых растворов в соответствии с техническим описанием препарата и растворимостью (10 мМ MEKi выбора путем растворения 5 мг в 1,036 мл ДМСО). Тщательно перемешайте и сформируйте небольшие аликвоты для хранения при температуре -80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДМСО является распространенным растворителем, используемым для растворения как полярных, так и неполярных соединений и проявляет растворимость в широком спектре органических растворителей, а также в воде.
   5. Приготовьте живую суспензию артемии, дав цистам Artemia salina вылупиться в растворе для вылупления (2 г/л цист Artemia salina в 30 г/л океанической соли, предварительно растворенной в воде обратного осмоса) при температуре 28-30 °С в течение не менее 18 ч, обеспечивая постоянную аэрацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия культивирования и время вылупления могут зависеть от условий окружающей среды объекта и партий цист, поэтому их следует регулярно перепроверять и при необходимости переустанавливать.
4. Подготовка племенных пар для рыб Tg[ef1α:ERK biosensor-nes] (Teen) (День 3)
   1. В день случки кормите взрослые пары регулярно в соответствии с утвержденным протоколом содержания животных.
      1. Очистите культуру, содержащую вылупившихся артемий, отфильтровав невылупившиеся или пустые цисты с помощью двух фильтров разного размера (ступень фильтра I: 180 мкм, ступень фильтра II: 112 мкм).
      2. Соберите и промойте отфильтрованные соленые креветки в 200 мл воды обратного осмоса, чтобы накормить 10-15 взрослых рыб примерно 5-10 мл раствора артемии.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте качество вылупившегося раствора артемии, глядя на их жизнеспособность, подвижность, размер и цвет, и обязательно удалите невылупившиеся или пустые цисты, которые неперевариваются рыбами и могут нанести вред желудочно-кишечному тракту рыб. Для размножающихся пар предпочтительно обеспечивать последний прием пищи в день не менее чем за 3 часа до изоляции пар в аквариуме для разведения, чтобы обеспечить переваривание пищи и поддерживать высокий уровень качества воды.
   2. Выбирайте пары рыб, которые не были спарены для спаривания в течение (по крайней мере) предыдущих 2 недель, чтобы свести к минимуму дистресс и дать возможность развиться гаметам. Акклиматизируйте выбранные взрослые пары рыб-подростков (обычно с этим составом: 1 ♂ : 2 ♀) в соответствующих аквариумах для разведения. Отделите самок от самцов с помощью разделителя бака до следующего утра. Обеспечьте стандартный цикл освещения/темноты 14/10 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут быть организованы групповые кроссы. Однако в этом случае нерест может происходить в разное время и отбор эмбрионов на одном и том же этапе из смешанных кладок становится более сложным. Переход от темного к светлому имеет решающее значение для успешного спаривания.
5. Сбор эмбрионов и микроинъекция WT и мутантных мРНК (день 4)
   1. Как только в помещении загорится свет, снимите разделитель аквариума, разделяющий самцов и самок, и, при необходимости, замените примерно 20% воды в аквариуме свежей водой из системы замкнутого водоснабжения, чтобы поддерживать высокое качество воды без чрезмерного разбавления гормонов, выделяемых рыбами.
   2. Оставьте рыбу в покое и регулярно проверяйте ее на наличие яиц (обычно в первые 30 минут до 1 часа дневного света). Яйца (2-3 мм) откладываются и падают на дно емкости, отделенное сеткой, такой, чтобы взрослые особи не могли их есть. Изолируйте взрослых особей, которые успешно развелись, и процедите воду из аквариума, содержащую яйца, через стандартное ситечко (например, ситечко для чая), чтобы удержать яйца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно поместить ту же рыбу обратно в аквариум для разведения для еще одного раунда спаривания или вернуть рыб в исходные резервуары, записывая пару спаривания, дату и производительность.
   3. Собранные эмбрионы промойте свежей средой Е3 и удалите неоплодотворенные, дегенерировавшие яйцеклетки, фекалии и другие виды мусора из пар с помощью пипетки Пастера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите ~n = 100 оплодотворенных яиц подростка в чашке Петри диаметром 90 мм, чтобы избежать перенаселения эмбрионов.
   4. Расположите и выровняйте оплодотворенные яйцеклетки подростков в специальной пластине для микроинъекций, полученной путем формования 2% агарозы в среде E3, для создания соответствующих полос, которые должны содержать и ограничивать яйцеклетки во время микроинъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой цели могут быть использованы индивидуальные или коммерческие формы.
   5. Приготовьте свежую смесь для микроинъекций для получения мутантных эмбрионов следующим образом: 30-60 пг закрытой и полиаденилированной мРНК (в данном случае shp2) растворите в 0,3x растворе Данио (разбавленном из исходного раствора) для получения конечного объема 20 μл. Добавьте 0,2 μл (0,05%) исходного раствора Phenol Red в качестве микроинъекционного индикатора.
   6. Загрузите в иглу 2 мкл инъекционного материала с помощью микрозагрузочной пипетки. Введите раствор в одноклеточную стадию эмбрионов подростка данио-рерио с помощью имеющегося в продаже устройства для микроинъекций под давлением, вручную регулируя настройки давления и времени для калибровки каждой инъекции в зависимости от качества иглы и эмбриона. Обратитесь к стандартным протоколам микроинъекций рыбок данио, доступным в литературе^11,12.
   7. Выращивайте микроинъекционные эмбрионы подросткового возраста в контролируемых условиях содержания (температура: 28 °C, влажность: 70%, цикл света/темноты: 14/10 часов) для оптимального развития и очистите все яйца, которые выглядят мутными или дегенерированными в течение следующих 3 часов после депонирования.
   8. Через ~4 ч после оплодотворения (HPF) проведите скрининг эмбрионов на флуоресценцию (репортерную экспрессию) с помощью стандартного флуоресцентного стереомикроскопа с соответствующими настройками лампы и фильтра (465-500 нм). Используйте подростковых рыб для визуализации FRET и отрицательных братьев и сестер для иммуногистохимических (ИГХ) оценок (см. ниже).
      Примечание: Учитывая известную вариабельность экспрессии трансгенов¹³ на основе Tol2, эмбрионы могут демонстрировать различные уровни подростковой флуоресценции. Рекомендуется осматривать неинъекционных братьев и сестер для контроля межиндивидуальной вариабельности флуоресценции в партии и, учитывая низкий динамический диапазон визуализации FRET, отбраковывать эмбрионы с чрезвычайно низким уровнем базальной флуоресценции.
6. Лечение эмбрионов рыбок данио ингибитором MEK (MEKi) (день 4)
   1. Приготовьте промежуточный раствор MEKi PD0325901 (1 мМ) путем разбавления 1 мкл 10 мМ стокового раствора с 9 мкл со средой Е3. Используйте промежуточный раствор для получения окончательных растворов с низкими дозами. Приготовьте низкую дозу (0,25 мкМ) PD0325901 MEKi в общем объеме 3 мл, смешав 0,75 мкл промежуточного раствора 1 мМ с 2,25 мкл среды Е3. Разведите 0,75 мкл 10% ДМСО с 2,25 мл среды Е3 до получения контрольного раствора (Ctrl).
   2. Поместите пулы эмбрионов в одинаковом количестве в разные лунки 6-луночного планшета и начните лечение погружением в ванну: для каждой лунки замените среду Е3 на среду Е3, содержащую средство контроля (0,0025% ДМСО) или разведенные препараты в желаемой концентрации (0,25 мкМ, 0,0025% ДМСО), как упоминалось ранее. Используйте 3 мл раствора препарата на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для устранения любых эффектов, вызванных различными концентрациями носителя (ДМСО), важно убедиться, что как контрольные, так и лечебные растворы имеют одинаковую конечную концентрацию ДМСО.
   3. Перед сбором обработанных эмбрионов необходимо хранить при температуре 28 °C до достижения желаемой стадии развития для последующих анализов (здесь: морфометрический анализ и валидация ИГХ).

2. Живая мультиспектральная визуализация FRET моделей рыбок данио рерио RASopathy на стадии гаструлы и анализ данных

1. Монтажные гаструлы для визуализации в реальном времени (День 4) (Рисунок 2A)
   1. Приготовьте монтажную среду для живых эмбрионов, растворив 1,5 г легкоплавкой агарозы (LMA) в 1x PBS до получения 1,5% LMA/E3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте концентрацию агарозы от 0,8 до 1,5% в зависимости от стадии развития и конкретной потребности в сдерживании рыб. Раздайте свежеприготовленный раствор ЛМА в аликвотах нужного формата и храните ЛМА в полимеризованном состоянии при РТ (стабильно в течение нескольких месяцев). Это сводит к минимуму бактериальное и грибковое загрязнение, но регулярно проверяйте качество аликвоты LMA перед использованием.
   2. Перед установкой образца растопите 1,5% аликвоту LMA в термомиксере или стерильной водяной бане при 50 °C. После растворения уменьшите температуру термомиксера примерно до 30 °C.
   3. Поместите один введенный эмбрион Teen⁺ (в данном случае гаструлу, экспрессирующую Shp^D61G) в центр стеклянной нижней чашки диаметром 35 мм для визуализации в реальном времени и сориентируйте его с помощью тонкого волоса. Удалите излишки среды E3 и обездвижьте эмбрион, нанеся сверху каплю LMA и оставив его полимеризоваться при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В начале процесса полимеризации рыбу можно ориентировать в нужное положение. Строго рекомендуется использовать ЛМА при температуре не выше 35 °С во избежание повреждения тканей.
2. Настройка параметров микроскопии и выполнение мультиспектральной FRET визуализации гаструл (День 4) (Рисунок 2B)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол распространяется на использование любых платформ конфокальной микроскопии, оснащенных всем необходимым аппаратным и программным обеспечением для выполнения FRET-визуализации. В работе был использован конфокальный микроскоп, оснащенный аргон-ионным лазером с линиями длин волн 458-476-488-496-514 нм, программируемым акустооптическим светоделителем (AOBS), разделяющим возбуждающий и испускающий свет, двумя спектральными гибридными (HyD) детекторами, а также ступенчатым инкубатором для поддержания стабильных условий температуры (на уровне 28 °C) и влажности при визуализации образцов в реальном времени.
   Описанный протокол визуализации FRET в реальном времени может быть применен к эмбрионам на различных стадиях развития, выходящих за рамки ранних гаструл, как показано в работе Fasano et al.⁷. Для более поздних стадий разработки следует рассмотреть возможность использования более крупного z-стека (например, 24 hpf), а также соответствующих настроек z- и t-интервалов, чтобы обеспечить возможность многоспектрального детектирования во время получения спектрального изображения FRET.
   1. Включите контроллер инкубатора не менее чем за 1 час до начала приобретения и установите температуру 28 °C, чтобы сохранить эмбрионы данио-рерио в здоровом состоянии. Как только температура в инкубаторе стабилизируется, поместите чашку для визуализации с эмбрионом на держатель образца и используйте объектив 10x/сухой (числовая апертура 0,4) для быстрой визуализации образца.
   2. В конфигурации лазера указанного программного обеспечения включите аргон-ионный лазер и с помощью ползунка отрегулируйте мощность лазера до 50%. В настройках оборудования выберите 8-битное разрешение глубины, при котором будут получены изображения.
   3. Выберите режим сканирования спектрального детектирования XYλZ на панели сбора данных и установите следующие параметры сканирования: формат изображения: 512 x 512 пикселей; скорость сканирования 400 Гц; оптический зум 0,75.
   4. Активируйте лазерную линию аргон-ионного лазера с длиной волны 458 нм и установите значение ее интенсивности, обычно <10% (здесь 8,5%).
   5. Выберите HyD детектор и отрегулируйте чувствительность детектора (усиление), введя нужное значение (здесь 500).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для живых, слабофлуоресцентных образцов и для накопления меньшего фонового шума рекомендуется использовать гибридные детекторы, а не фотоумножители (ФЭУ).
      В указанном программном обеспечении для отображения спектра излучения красителя требуется активация детектора.
   6. Для начала активируйте первый детектор (HyD) и выберите голубой флуоресцентный белок (CFP) для отображения его кривой излучения. Откройте выпадающее меню панели детектора программного обеспечения, чтобы открыть список выбора для кривой излучения CFP. Теперь активируйте второй детектор для отображения кривой излучения второго красителя желтого флуоресцентного белка (YFP). Чтобы отобразить также кривую излучения Ypet , активируйте второй детектор, затем выберите кривую излучения YFP , которая появится на спектральном изображении после выключения второго детектора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения этого шага второй детектор должен быть деактивирован, так как только один детектор используется в режиме спектрального захвата.
   7. Чтобы начать сбор данных в реальном времени, поместите курсор детектирования в диапазон наиболее интенсивного излучения сигнала (в данном случае YFP) для визуализации выборки, определите и установите начальное и конечное положения толщины образца в окне z-stack LAS X.
   8. Для свойств диапазона λ-сканирования задайте следующие параметры: начало (460 нм) и конец (570 нм) диапазона обнаружения; Ширина полосы обнаружения: 5 нм; λ-сканирование Шаг Размер: 5 нм. Запустите получение z-стека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные параметры позволяют пользователям получать относительно быстрое изображение с приемлемым разрешением, но могут использоваться и другие настройки. В настройках диска флюорификатора можно отменить выбор автоматически вставленного фильтра NOTCH, чтобы избежать потери однократной интенсивности.
   9. Чтобы оценить изменения сигнала в реальном времени при воздействии MEKi, поместите один мутантный эмбрион (в данном случае Shp2^D61G) в стеклянную чашку и получите изображение до и после лечения препаратом. Для этих экспериментов в реальных условиях непосредственно проводите медикаментозное лечение путем погружения в ванну во время сеанса визуализации с максимум 2 мл раствора, содержащего растворенный препарат.
3. Постобработка изображений и мультиспектральное разделение красителей для получения ратиометрических изображений FRET (День 5) (Рисунок 2C)
   1. Чтобы разделить донорское (CFP) и акцепторное (Ypet) излучение, обязательно исключите вклад флуоресцентного излучения обеих молекул в канал FRET, называемый спектральным просвечиванием (SBT).
      1. Обратитесь к общедоступным базам данных красителей/флуоресцентных белков для отображения и загрузки файла .cvs относительно стандартного спектра излучения CFP (спектры возбуждения и излучения).
      2. На панели «Данные » файла .cvs выберите опцию «Текст в столбцы » и разделите данные на столбцы, используя запятую в качестве разделителя. Полученный файл будет содержать дополнительную информацию (например, возбуждение CFP, CFP 2P), которую следует удалить. Сохраняйте только данные столбца относительно длины волны и излучения.
      3. В столбце CFP emission удалите все данные об интенсивности, начиная с 501 нм.
      4. Сохраните адаптированный файл спектра излучения CFP от 460 до 500 нм в формате .xls (на рисунке 2C он называется "eCFP modified").
      5. Повторите ту же процедуру для загрузки и обработки спектра излучения белка YFP и сохраните только данные столбца относительно длины волны и излучения. Удалите все значения излучения до 524 нм. Сохраните адаптированный файл спектра излучения YFP от 525 до 650 нм in.xls формате (на рисунке 2C он называется "Ypet from 525 nm").
      6. Чтобы исключить спектральные просвечивания (SBT) в базе данных красителей, доступной в окне «Конфигурация » программного обеспечения, вставьте и сохраните два адаптированных эталонных спектра излучения для CFP и YFP.
   2. Выберите полученный файл спектрального изображения из сеанса обработки изображений, откройте окно «Процесс » и выберите «Спектральное разделение красителей » в инструменте «Разделение красителей». Настройте параметры разделения красителей следующим образом: в выпадающих списках в левой части диалогового окна выберите новый спектр излучения CFP (eCFP modified) в первой позиции и новый спектр излучения YFP (Ypet от 525 нм) из базы данных спектра.
   3. В разделе Изменить масштаб выберите Per Channel , чтобы масштабировать каналы по отдельности, а затем при λ-сканировании изображений выберите тот, который имеет наибольшую интенсивность сигнала (соответствует шагу 14 спектрального сканирования на уровне пика излучения канала FRET, обозначенного белой стрелкой на панели, показывающей шаги обнаружения справа от рисунка 2B.). Затем перейдите по Z-скану образца и выберите оптический участок, который выделяет область интереса в краевой зоне.
   4. Используйте режим выбора ROI в краевой зоне полюса животного, чтобы определить область с наилучшим спектром. Нажмите на ROICrosshair , указанный в верхней части окна отображения, чтобы вызвать перекрестие и отрегулировать размер эталонного ROI, введя значение 40 вокселей в область измерений. Точное определение области интереса с помощью ROICrosshair. На диаграмме изображения выберите нормализацию данных, затем нажмите «Применить », чтобы выполнить разделение красителей с настроенными настройками.
   5. Откройте этот вновь сгенерированный файл, полученный с разделением двух каналов, и создайте двумерное проекционное изображение из серии трехмерных изображений (проекция максимальной интенсивности) для визуализации данных.
   6. В окне Процесс выберите Обрезать для разделения каналов на два отдельных файла: каналы CH1 и CH2 (или FRET).
   7. В окне «Процесс » выберите «Объединить изображения», выберите файл CH2 и вставьте его в первом варианте, а затем выберите файл CH1 и вставьте его во втором варианте. Установите перемасштаб с коэффициентом 5 и выберите операцию Ratio. Затем нажмите « Применить », чтобы создать новый файл, содержащий ратиометрическое изображение (YFP/CFP). Сохраните файл для последующего анализа данных.
4. Количественный анализ сигналов FRET и рендеринг изображений (Дни 5-6) (Рисунок 2D)
   1. Для количественного измерения сигналов FRET на ратиометрических изображениях FRET/CFP проводят эксперимент на N>2 эмбрионах (репликатах) в зависимости от априорной статистической оценки, основанной на ожидаемом эффекте. Используйте пакет обработки изображений, такой как программное обеспечение с открытым исходным кодом Fiji. Импортируйте файлы изображений, полученные в результате спектральной визуализации и разделения красителей, в пакет для анализа изображений, такой как Fiji с открытым исходным кодом.
   2. Прежде чем приступить к выбору ROI на изображениях гаструл, установите параметры в виде измерений считывания с помощью функции Анализ | Установить мерки | выберите интересующие параметры, такие как Площадь, Интегрированная плотность и Среднее значение серого.
   3. Выберите интересующую область (в данном конкретном исследовании — край гаструлы) с помощью инструмента выделения полигона на панели инструментов. Сохраните спецификации ROI x,y, нажав на кнопку «Анализ» | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций.
   4. Чтобы выполнить измерения в выбранном ROI, нажмите « Анализ» | Измерьте. Повторите эти шаги для каждого ROI и изображения/условия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости сохраните изображение как . Формат TIFF. Можно сохранить все измерения ROI, полученные из нескольких изображений, в одном файле ROI. Переименуйте каждый показатель в списке менеджера ROI, указав правильное имя относительно каждого образца или изображения.
   5. Для каждого условия (мутантный и мутантный + лечение здесь) извлеките все значения соотношения FRET/CFP для каждого выбранного ROI и организуйте их на листе, организовав, например, экспериментальные группы в столбцах, а каждое исходное значение в строках.
   6. Используйте любое подходящее программное обеспечение для оценки статистических различий сигналов FRET в различных экспериментальных условиях, а также для генерации графиков и визуализации данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доступно лицензионное программное обеспечение с открытым исходным кодом для анализа данных и построения графиков.
   7. Организуйте конкретный проект для статистической оценки с учетом всех исходных измерений и количества повторов для каждого экспериментального условия. Для статистического анализа одной биологической реплики создайте таблицу столбцов с одной группирующей переменной, каждая из которых определяется столбцом. Для статистического анализа более чем одной биологической репликации создайте сгруппированные таблицы, содержащие по крайней мере две группирующие переменные, одна из которых определяется столбцами (например, условия эксперимента), а другая — строками (например, средними значениями репликатов).
   8. После соответствующего расположения экспериментальных групп в рабочем листе оцените распределение данных (тест на нормальность, например, Д'Агостино-Пирсон, Андерсон-Дарлинг) и на основе результата выберите наиболее подходящий статистический тест.
      1. Выполните однофакторный ANOVA для параметрических данных (в соответствии с гауссовым распределением) и тест Краскела-Уоллиса для непараметрических данных. Если присутствует больше факторов (генетические и лекарственные концентрации), рассмотрите возможность проведения двустороннего ANOVA. Сравните среднее значение FRET для каждого условия друг с другом (множественные сравнения) и скорректируйте множественные сравнения с помощью апостериорного теста (например, тест Тьюки и тест Данна для параметрических и непараметрических данных соответственно).

3. ИГХ-валидация результатов FRET и корреляционно-морфометрический анализ дефектов гаструляции

1. Приготовление растворов и фиксация и монтаж эмбрионов на ИГХ против tERK и pERK (7-й день) (рис. 3A)
   1. Подготовьте рабочие растворы, необходимые для ИГХ.
      1. Приготовьте исходный раствор 10x PBS, растворив 80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na₂HPO₄ и 2,4 г KH₂PO₄ в 1 л воды DD. Автоклавируйте раствор, чтобы сохранить его стерильным.
      2. Приготовьте 0,8% раствор PBS-Triton (PBSTr), растворив 8 мл 10% Triton X-100 в конечном объеме 100 мл 1x PBS.
      3. Приготовьте 20%, 50% и 80% растворы глицерина, разбавив 3 мл, 7,5 мл и 12 мл 100% глицерина соответственно в конечном объеме 15 мл 1x PBS.
   2. Приготовьте 4% параформальдегид (PFA)/0,25% PBSTr (фиксирующий раствор) путем смешивания 2,5 мл 16% PFA с 250 μл 10% Triton X-100, предварительно растворенных в конечном объеме 10 мл 1x PBS. Используйте этот раствор для фиксации эмбрионов при 6 hpf в течение ночи при 4 °C. Используйте 2 мл пробирок и максимум пять эмбрионов на пробирку для эффективной фиксации и промывания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить свежий фиксатор для каждого раунда фиксации. ВНИМАНИЕ: При работе с формальдегидом в концентрации 16% надевайте средства индивидуальной защиты (СИЗ) и под капюшон для химикатов.
   3. Промойте эмбрионы в пробирках объемом 2 мл, заполнив пробирки 1,5 мл 0,8% PBSTr на несколько раз. Перенесите эмбрионы в новые пробирки объемом 2 мл и храните эмбрионы в 1x PBS до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не знакомы с обращением с эмбрионами рыбок данио-рерио на ранних стадиях, работайте под стереомикроскопом, чтобы избежать потери эмбрионов во время пипетирования. Используйте пластиковую посуду с низким уровнем связывания, чтобы уменьшить возможное прилипание эмбрионов к стенке пробирки.
2. Пермеабилизация тканей и ИГХ в отношении pERK и tERK (дни 7-9)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты ИГХ зависят от множества переменных, которые могут различаться в разных лабораториях, и может потребоваться специальная оптимизация протоколов.
   1. Вымойте неподвижные эмбрионы данио-рерио в 1 мл 0,8% PBSTr в течение 3 x 10 минут при RT.
   2. Пермеабилизируйте образцы 2 мкл протеиназы К, разведенной в 0,8% PBSTr (1:1000), в течение 2 мин в режиме РТ.
   3. Остановите проникновение ткани, промыв образцы в 1 мл 0,8% PBSTr в течение 3 x 10 минут, и закрепите образцы в 500 μл 4% PFA/1x PBS в течение 20 минут на RT. Затем промойте образцы в 1 мл 0,8% PBSTr в течение 3 x 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод и время, затраченное на пермеабилизацию тканей, являются критически важными этапами, на которые могут влиять тип антигена, качество сохранности тканей и факторы окружающей среды. Оптимизируйте протокол, прежде чем применять его на ценных образцах.
   4. Инкубируйте образцы с 1x блокирующим буфером (BB), содержащим 5% нормальной козьей сыворотки (NGS), 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1% DMSO, приготовленных следующим образом: 75 мкл 100% NGS, 150 мкл 10% BSA и 15 мкл 100% DMSO в конечном объеме 1,5 мл 0,8% PBSTr. Используйте 200 мкл раствора на пробирку и инкубируйте эмбрионы в течение 20-30 мин при RT в растворе.
   5. Удалите 1x BB с предыдущей стадии и инкубируйте образцы в растворе, содержащем смесь желаемых первичных антител (в данном случае: разведение 1 мкл первичного мышиного моноклонального антитела p44/42 MAPK, общего ERK, tERK, + 1 мкл кроличьего поликлонального фосфо-p44/42 MAPK, фосфорилированного ERK, pERK) в 250 мкл свежеприготовленного 1x BB раствора. Используйте 200 мкл раствора на пробирку и инкубируйте эмбрионы в растворе в течение ночи при температуре 20 °C.
   6. Для устранения неспецифического связывания промывайте образцы 1 мл 0,8% PBSTr несколько раз (сначала промывайте каждые 10 минут, а затем каждые 30 минут).
   7. Инкубируйте образцы в свежеприготовленном 1x BB в течение 20 минут при RT. Используйте 200 μL на пробирку.
   8. Удалите 1x BB с предыдущей стадии и инкубируйте образцы со смесью вторичных антител (1 мкл флуоресцентно конъюгированного 488 козьего анти-мыши, + 1 мкл флуоресцентно конъюгированного козьего анти-кролика 633 в 600 мкл 1x BB-раствора). Оставьте эмбрионы осторожно встряхивать на ночь при температуре 20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы провели ИГХ на отрицательных (не трансгенных) рыбах-подростках из той же партии, которая использовалась для визуализации FRET. В качестве альтернативы также можно использовать рыбу Teen⁺ , но в этом случае вместо нее следует использовать вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, которые не перекрываются со спектрами излучения CFP или YFP.
   9. Исключите неспецифическое связывание, как описано выше.
   10. Промойте образцы в градиенте глицерин/1x растворы PBS (20%, 50%, 80%) в течение 15 минут на каждый раствор в RT. Храните образцы в 90% глицерине/1x PBS при 4 °C. Храните образцы в 90% глицерине/1x PBS при 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму возможное ослабление флуоресценции, храните образцы в темноте.
3. Конфокальная микроскопия иммуноокрашенных тканей и количественный анализ (10-11 дни) (Рисунок 3B-E)
   1. Установите эмбрионы, как описано выше.
   2. Параметры регистрации конфокальной микроскопии будут следующими: белый лазер на 80%, диапазон флуоресцентного излучения 507 - 551 нм для флуоресцентно сопряженного козьего анти-мыши (в этом случае со спектром излучения 488 нм, используется для tERK), 644 - 740 нм для флуоресцентно сопряженного козьего анти-кролика (в этом случае со спектром излучения 633 нм, используется для pERK). Выберите последовательный режим сканирования, формат сканирования 512 x 512 пикселей и скорость 400 Гц. Определение начала и конца сканирования с помощью толщины z-шага 4 - 5 μм и стандартного цифрового зума 1. Используйте объектив с водяным погружением 25x (с числовой апертурой 0,05) для получения всей гаструлы со скоростью 6 hpf
      ВНИМАНИЕ: Этот протокол включает применение лазеров, которые могут быть вредными; Поэтому она требует подготовки кадров в соответствии с конкретными национальными требованиями.
   3. После получения конфокального изображения проверьте файл необработанного изображения, полученный с помощью пакета обработки изображений, такого как программное обеспечение с открытым исходным кодом Fiji.
      1. На Фиджи используйте команду Разделить каналы из меню Изображение и подменю Цвет , чтобы получить изображение одного канала (общий ERK: канал = 0, C = 0; pERK: канал = 1, C = 1) и создать изображение максимальной интенсивности z-проекции для обоих каналов, нажав на Изображение | Стеки | Проект Z.
      2. Повторите процедуру измерения интенсивности ROI, описанную ранее, и извлеките данные на лист.
      3. Чтобы сделать вывод об изменениях интенсивности сигнала p-ERK в желаемом ROI среди экспериментальных групп, рассчитайте отношение p-ERK/t-ERK путем деления исходных значений интегральной плотности окрашивания p-ERK на исходную интегральную плотность сигнала t-ERK. Перейдите к оценке статистической значимости, как указано в шаге 2.4.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки параметров изображения могут быть изменены в зависимости от конкретных потребностей и с учетом продолжительности времени для каждого образца, желаемого качества изображений и количества плоскостей, которые необходимо получить.
4. Измерения осей у 11 эмбрионов HPF (4-й день для фиксации эмбриона, 12-й день для сбора и анализа данных) (Рисунок 4A-D)
   1. В конце гаструляции (11 hpf) зафиксировать эмбрионы с помощью 4% PFA в 1x PBS на 20 минут в RT, промыть несколько раз в 1x PBS и хранить при температуре 4 °C до получения изображения.
   2. Ориентируйте эмбрионы латерально с помощью пастеровской пипетки в одной лунке 12-луночного планшета, содержащего свежий 1x PBS.
   3. Чтобы оценить наличие овальной формы (отношение осей зародышей Y/X > 1), характерный фенотип разопатии у рыбок данио-рерио и морфологическое восстановление соотношения осей эмбрионов в результате лечения, получить изображения целых эмбрионов с помощью стереомикроскопа с объективом увеличения 3,4x (объектив сканирования 0,63x x коэффициент масштабирования 8,60) путем простой съемки изображений в режиме светлого поля.
   4. Импортируйте файл изображения в пакет анализа изображений, такой как Фиджи с открытым исходным кодом.
      1. Измерьте длину осей эмбрионов (x, малая ось; y, большая ось), выбрав инструмент «Прямой » на панели инструментов и нажав « Анализ | Измерьте. После выполнения выбранных измерений добавьте их в список менеджера ROI и сохраните файл ROI, как описано выше для анализа изображений FRET.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите эти шаги для каждого изображения эмбриона.
   5. Перейдите к экспорту данных на лист и рассчитайте соотношение осей , разделив длину большой оси (y) на длину малой оси (x). Вычислите среднее значение, стандартное отклонение от среднего значения или стандартную ошибку среднего значения различных реплик.
   6. Перейдите к статистическому анализу данных, как описано в пункте 2.4.

Результаты

Этот протокол демонстрирует простой рабочий процесс для быстрого создания моделей транзиентной RASopathy у эмбрионов данио-рерио и оценки колебаний ERK у ранних мутантов с помощью стандартного метода визуализации FRET в реальном времени, примененного к недавно установленн...

Обсуждение

Несмотря на десятилетия исследований и мириады мутаций, приводящих к крайне гетерогенным формам RASopathies, генетические варианты с неизвестным значением продолжают появляться в результате усилий по секвенированию у недиагностированных пациентов. Действительно, во мн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Mini-sub Cell GT Horiziontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1704406	Gel Elecrophoresis
PC-100 Vertical puller	Narishige	-	Needle puller
PowerPac Universal Power Supply	Bio-Rad	1645070	Gel Elecrophoresis
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Plasmid preparation
Softwares
Biorender	Biorender	CC-BY 4.0 license	Cartoon elaboration for Figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Data analyses
Fiji software	ImageJ	15.3t	Imaging rendering and quantitative analyses (FRET signals measurements, ERK fluorescence intensity in IHC assay, embryo axes lenght)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Statistical data analyses
iControl spectrophotometer software	Tecan	v. 2.0	RNA quantification
Illustrator	Adobe	26.0.3 (64-bit)	Figure assembling
LASX software	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Imaging acquisition for spectral FRET experiments and embryo imaging for axes lenght measurements
Q9 Mini 18.02-SN software	Uvitec	-	Gel image acquisition