ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

要約

RASopathyiesは、RAS-MAPK経路の過剰活性化によって引き起こされる多系統遺伝性症候群です。検証を待っている潜在的に病原性の多様体が次々と出現する一方で、前臨床のエビデンスが乏しいため治療が制限されています。ここでは、Teen-reporter ZebrafishのライブFRETイメージングにより、RASopathy関連ERK活性化レベルとその薬理学的調節を胚発生時に試験および交差検証するためのin vivoプロトコルについて説明します。

要約

RASopathiesは、ERKの過剰活性化によって引き起こされ、がんの素因にもつながる可能性のある多系統性疾患を引き起こす遺伝性疾患です。広範な遺伝的不均一性にもかかわらず、RAS-MAPK経路の主要な調節因子における生殖細胞系の機能獲得型変異が症例の大部分の根底にあり、高度なシーケンシング技術のおかげで、RAS-MAPK経路に影響を与える可能性のある病原性多様体が引き続き同定されています。これらの変異体の病原性の機能検証は、正確な診断に不可欠であり、できれば in vivo での迅速で信頼性の高いプロトコルが必要です。幼児期の効果的な治療法が不足していることを考えると、このようなプロトコルは、特に費用対効果の高い動物モデルでスケーラブルであれば、薬物のリポジショニング/リパーパシングの前臨床的な根拠を提供するのに役立つ可能性があります。

ここでは、ゼブラフィッシュの胚における一過性RASopathyモデルの迅速な生成のためのプロトコルと、リアルタイムのマルチスペクトルFörster共鳴エネルギー移動(FRET)イメージングを通じて、原腸陥入中にすでに発生している生きた疾患関連ERK活性変化の直接検査のためのプロトコルを段階的に説明します。このプロトコルは、最近設立され、市販の顕微鏡のハードウェアと統合されたトランスジェニックERKレポーターを使用します。Shp2^D61Gの発現により得られたヌーナン症候群(NS)ゼブラフィッシュモデルの例を提供します。ここでは、利用可能な低用量MEK阻害剤による薬理学的シグナル調節の前後に、NS魚モデルにERKシグナルの変化を登録できる簡単な方法について説明します。治療前後のマルチスペクトル取得からレシオメトリックFRETシグナルを生成、取得、評価する方法、および初期段階で全胚に対する古典的な免疫蛍光法による結果を交差検証する方法について詳しく説明します。次に、標準的な形態測定パラメータを調べることにより、受精後6時間でERK活性が生きたFRETによって評価される同じ胚において、原腸陥入の結果として生じる障害を示す胚形状の後期変化を照会する方法を説明します。

概要

RASopathiesは、正常な発達を損ない、さまざまな臓器や組織に影響を与える遺伝的症候群です。これらの疾患は、RAS/MAKシグナル伝達に関与する主要な遺伝子やプレーヤーの生殖細胞系の機能獲得(GoF)変異によって引き起こされることが多く、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)の過剰活性化(リン酸化の増加)を引き起こします。ERKは、発生過程で重要な組織成長のいくつかの基本的なプロセスを、核^1,2に移動することによって制御します。RAS-MAPK経路に関与する遺伝子の体細胞変異は、がんにつながる最も一般的なイベントです³。したがって、当然のことながら、がんの素因はRASopathiesでも観察されます。ヌーナン症候群(NS)は、発達遅延、低身長、さまざまな重症度を伴う認知障害、および心筋症を特徴とする、RASopathy²の最も一般的な形態です。ほとんどの場合、この疾患は、2000年初頭に発見された最初のRASopathy遺伝子であるPTPN11のGoF変異によって引き起こされます。^これは、経路の正の調節因子として機能するタンパク質チロシンホスファターゼSHP2をコードしています。

それ以来、診断されていない患者におけるエクソームシーケンシングアプローチの指数関数的な使用のおかげで、RAS-MAPKに関与する因子に影響を与え、さまざまな形態のRASopathiesに関連している可能性のある病原性変異が発見され続け、効率的な患者の層別化のための機能的特性評価を待っています²。この目標を達成するためには、生物レベルでの迅速で有益な機能検証を保証する実験プロトコルが必要です。古典的で標準化された哺乳類モデルを使用して、重要性が不明な変異体を試験することは、コストと非常に時間がかかり、不透明な大型動物に対する侵襲的な方法が必要になります。このような戦略は、現在管理や治療を受けていない、貧しいまたは診断されていないRASopathy患者に代表される社会的負担を考えると、迅速な検査の要件と明らかに両立しません。主要な表現型特性の定量的評価のためのプロトコルと、生物全体の分子相関は、再利用/再配置により、RASopathy患者が利用できる可能性のある薬物の臨床翻訳を加速するのにも役立ちます。

ゼブラフィッシュは、初期発生に影響を与える疾患を研究するための理想的な脊椎動物モデルです。まず、ゼブラフィッシュはヒトと高い遺伝的相同性を共有しています。成魚の高い繁殖力は、小さくて急速に成長する胚の大量生産をもたらします。胚は初期段階では透明であるため、主要な発生プロセス(エピボリー、原腸陥入、軸、ボディプラン形成)は、標準的な顕微鏡法を使用して簡単に視覚化できます。さらに、発生中の空間的および時間的な特定の細胞挙動および動的分子イベントを追跡するために使用できるトランスジェニック系統の利用可能性は、遺伝子モデルを生成する高度な技術と組み合わせて、他の追随を許しません。さらに、ゼブラフィッシュでは表現型の読み出しを複数のレベル(生物の欠陥から細胞の欠陥まで)で評価することができ、RASopathies⁵を含むいくつかの疾患に対して専用のアッセイがすでに確立されています。さらに、比較的簡便な浴漬漬法による薬物投与の初期段階、少なくとも水溶性化合物の場合、96ウェルフォーマットでのin vivo でのハイスループット薬物スクリーニングが可能になります。

分子的な観点からは、免疫組織化学やイムノブロットなどの標準的なアプローチを用いた研究は、魚の胚におけるERK活性化とRASopathy関連の発生障害との相関関係を強く示しています^6,7。最近開発されたゼブラフィッシュのEKAR型FRETバイオセンサー(Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen)は、胚形成中のERK活性化を時空間的に分解して登録するための信頼性の高いin vivoツールを提供します。したがって、RASopathy魚モデルにおける動的ERK変化と薬理学的調節のより良い評価に役立つ可能性があります。

Teenセンサーでは、ERKの活性化により、レポーター内の特定のERK基質がリン酸化され、蛍光CFPドナー(D)と蛍光Ypet(改善されたYFP)アクセプター(A)に近接する構造変化が引き起こされます。Dの発光スペクトルがAの吸収スペクトルとかなり重なると、FRETが発生する可能性があります(DからAへのエネルギー吸収)。これは D と A の間の距離に比例するため、Teen では ERK のアクティブ化ステータスに比例します。標準顕微鏡または共焦点顕微鏡の標準および高度なイメージングモジュールの両方を使用して、生サンプルと固定サンプルの両方で、さまざまなイメージングプロトコルを設定できます。D励起時には、CFPからYFPへの定義された発光スペクトル(λ)に沿ったマルチスペクトルスキャンの取得と、それに続くスペクトルの「アンミキシング」アルゴリズムは、FRET^{データの登録}と定量化に最も信頼性の高い方法の1つです8。また、生きたゼブラフィッシュの標本にも適用して、生体内の組織動態を記録することができます。

以前のレポート^6,9と最近のアプリケーション⁷に続いて、ここでは、原腸陥入の開始時にNSモデルの動物極の縁にある細胞内のERK活性化を評価し、それを発達の後半にのみ見える特徴的な体軸欠陥と相関させるためのTeenfishを使用した段階的なワークフローについて詳しく説明します。利用可能なMEKiによる処理の前後に、生きたNS原腸から定量的なFRETデータを取得して調べる方法、およびリン酸化(活性)ERKに対する標準的な免疫組織化学を介して結果を交差検証する方法、または胚伸長欠損の相関形態測定分析を行う方法を示します。

このワークフローは、RASopathiesと推定される新たな変異体や疾患遺伝子の機能試験を強化し、脊椎動物の発生中の空間的および時間的なERK活性化ダイナミクスと胚の形態学的欠陥との相関関係についての洞察を得るために適用できる可能性があります。このプロトコルは、ERK活性化を調節するように作用する候補薬の有効性をテストするためにも使用できます。

プロトコル

動物の飼育と繁殖に関するすべての実験手順は、動物研究におけるゼブラフィッシュの使用に関するARRIVEガイドラインに従って実施され、イタリア保健省(Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF)によって承認されました。すべてのDNA/RNA反応およびイメージングセッションは、必要な最終材料や試験する遺伝子およびバリアントの数に応じて、必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができます。

1. 一過性ゼブラフィッシュRASopathyモデルの作製と薬物治療

注:RASopathy関連バリアントの発現をモニターするために、目的のタンパク質の所望のコード配列(cds)を小さな非蛍光タグ(mycなど)のcdsとフレームに保持する特定の構築物を使用することができる。このようにして、変異タンパク質の発現レベルを、タグに対する標準的なウェスタンブロットで評価することができます。目的の特定のタンパク質に対する抗体が利用可能な場合、タグを回避できます。免疫蛍光法は、標準的なプロトコルに従って胚組織内のタンパク質発現を評価するためにも使用できます。このタイプのコントロール実験は、変異タンパク質の発現を誘導されたERK活性化レベルと相関させるのに有用です。蛍光タグの使用は、顕微鏡観察中に蛍光発光クロストークが発生する可能性があるため、FRETイメージングと組み合わせて使用することはお勧めできません。

1. プラスミドの線形化(1〜2日目)(図1A)
   注:特定の遺伝子に影響を与えるGoF変異によって引き起こされるゼブラフィッシュ(ここではRAsopathy)の一過性疾患モデルを生成する場合、迅速なアプローチは、野生型(WT)と目的の変異タンパク質をコードするmRNAを調製することであり、その後、以下の手順に従ってゼブラフィッシュの胚に注入する必要があります。mRNAを転写するためのテンプレートとして使用されるプラスミドには、T7、Sp6、またはT3ポリメラーゼプロモーターの下流およびポリアデニル化(polyA)シグナルの上流にクローニングされた目的遺伝子の目的の完全長CDS(コード配列)が含まれている必要があります。利用できない場合、最初のステップは、ゼブラフィッシュまたはヒトの所望のCDSを適切な^{ベクター10} にクローニングして作製し、SANGERシーケンシングにより検証することである。クローニングについては、追加の時間を考慮してください(クローニング、コロニーのスクリーニング、正しいクローンの分離と拡大を含めて平均1週間)。
   1. 適切な制限酵素を用いてプラスミドを線状化し、polyAシグナル(ここでは KpnI)の下流を一度だけ切断します。効率的なプラスミドの直鎖化を実現するには、3 γ(μg/μL)のプラスミドDNA、2 μLの制限酵素(20,000 Unit/mL)、および10x反応バッファー10 μLをヌクレアーゼフリー水で最終容量100 μLに混合します。数回ピペッティングして成分を完全に混合し、反応混合物を37°Cで2〜4時間インキュベートします。
   2. 1.5%アガロースゲル上での電気泳動による直鎖化の結果を確認します。
      1. TBEの10倍原液(トリス48.5 g、氷酢酸11.4 mL、0.5 M EDTA[pH 8.0]20 mL)をヌクレアーゼフリー水で希釈します。
      2. アガロースゲルを調製するには、アガロース1.5 gを最終容量の1x TBE溶液100 mLに溶解します。次に、3.5 μLの色素ゲル染色液を添加します。
      3. アガロース溶液を条件/プラスミドの数に応じて適切なサイズのチャンバーに注いでゲルをキャストします。コームをセットし、ゲルが固まるまで約1時間待ちます。次に、コームを取り外し、重合ゲルを電気泳動に適したゲルトレイに配置します。
      4. 消化したプラスミドを数 μL (「カット」) と 6x ローディングバッファー (電気泳動をモニターするための色素を含む) 1.5 μL を、最終容量の 10 μL のヌクレアーゼフリー水に混合します。同様に、未消化プラスミドを含む別のコントロールサンプル(「アンカット」)も調製します。サンプルをアガロースレーンにロードし、最初のレーンに1 Kb DNAラダーをロードします。DNA電気泳動を100Vで30分間行います。
      5. 標準的なUVトランスイルミネーターでの実行から得られたDNAバンドを視覚化し、文書化します。DNAバンドのパターンを「カット」と「アンカット」で比較し、プラスミドの直鎖化の効率を確認します。
         注:十分に線形化されたプラスミドは、1つのシャープバンドほど高速に動作するはずです。転写反応の開始は、環状プラスミド形態の存在によって妨げられ、mRNAの収量が低下する可能性のある重要な制限ステップであるため、DNAの切断が完了していることを確認してください。
   3. 市販のスピンカラムベースのDNA精製キットを使用して直鎖状プラスミドを精製し、精製したDNA調製物を必要になるまで-20°Cで保存します。
      注:直鎖化の代わりに、PCR産物をmRNA転写のテンプレートとして使用することが可能であり、それが上流のポリメラーゼプロモーター配列と終止コドンの下流のpolyAシグナル配列を含む場合です。PCR産物は、先に進む前にアガロースゲルで精製および検査する必要があります。
2. In vitro mRNAの転写、精製、品質管理(2-3日目)(図1A)
   注:作業領域とピペットは、RNAse除染液で慎重に清掃してください。ヌクレアーゼフリーの材料と試薬を使用してください。手袋を着用してください。これにより、RNaseのコンタミネーションが最小限に抑えられ、完全長mRNAの収量が向上します。
   直鎖状プラスミドからWTおよび変異タンパク質をコードするキャップ付きおよびポリアデニル化mRNAを、in vitro mRNA転写用の標準キットを使用し、製造元の指示に従って転写します。
   1. 精製した直鎖状プラスミドを17,949 × g で数秒間遠心分離し、デブリがチューブの底に集まり、転写反応に移らないようにします。
   2. 氷上に保管されているNTPアナログとCAPアナログの混合物を除くすべてのコンポーネントを室温(RT)で解凍します。ポリメラーゼは使用時まで-20°Cに保ちます。
   3. 試薬の損失や偶発的な汚染を防ぐために、 使用前にすべての 試薬を17,949 g×で短時間遠心分離し、10x反応バッファーとすぐに使用できるNTP/CAPアナログ混合物を完全に溶液中になるまで短時間ボルテックスします。10x Reaction BufferはRTに保ちます。
   4. ヌクレアーゼフリーの水で構成された最終容量20 μLの20 μLに、10 μLの2x NTP/CAPアナログ混合物、2 μLの10x 反応バッファー、2 μLのSP6、T7、またはT3酵素(プラスミド中のCDSの上流の特定のプロモーターによって異なります)を含む溶液に、600〜800 ngの直鎖化精製プラスミドを加えて、RTで転写反応を準備します。数回ピペッティングして完全に混合します。
   5. 転写反応を37°Cでサーモサイクラーでインキュベートします。また、蓋の温度を37°Cに設定し、反応を2時間実行してください。
   6. 反応中に転写されなかった残留プラスミドを除去するには、標準DNAse溶液1 μL(2 Units/μL)を加えます。数回ピペッティングして反応物を完全に混合し、37°Cでさらに30分間インキュベートします。
   7. 先に進む前に、in vitro で合成されたmRNAの品質と完全性をTBE/ホルムアミドアガロース電気泳動で確認してください。1.0 gのアガロースを50 mLの1x TBE溶液に溶解し、5.5 mLの37%ホルムアミドと3.5 μLの色素ゲル染色を加えて混合し、上記のようにゲルをキャストします。
      注意: ホルムアミドを取り扱うときは、個人用保護具(PPE)を着用し、化学フードを使用してください。
   8. 転写したmRNA1 μLを、ヌクレアーゼフリー水中の2.5 μLの2x Formamide Dye Loading Bufferと総容量5 μLで混合します。数回ピペッティングして成分を完全に混合し、サンプルをゲルレーンにロードします。ゲルを100 mVで10〜15分間、予め冷却した1x TBEバッファーで泳動します。また、1 kbのDNAおよび/またはRNAラダーも実行します。
   9. オプション:ラダーとmRNAを70°Cで10分間変性させます。
   10. 得られたmRNAバンドを標準的なUVトランスイルミネーターで可視化し、文書化します。
       注:長時間のランと高温は、RNA分解の可能性を高めます。
   11. 合成したキャップ付きRNAの完全性とサイズが最適な場合は、反応に36 μLのヌクレアーゼフリー水、20 μLの5倍変性ローディングバッファー、10 μLの25 mM MnCl₂、10 μLの10 μLの10 mM ATP、および4 μLのポリアデニル化酵素(精製された大 腸菌 ポリ(A)ポリメラーゼなど)を添加して、C末端のポリアデニル化を進めます。数回ピペッティングして反応物を完全に混合し、最終反応液100 μLを37°Cでさらに1時間インキュベートします。
       注:polyA反応後にゲル電気泳動でRNAの品質を確認することは、polyAテールによりRNAが汚れて見えるため、お勧めできません。
   12. LiClなどの適切な塩を用いて、合成したキャップ型およびポリアデニル化mRNAを沈殿させ、回収します。簡単に説明すると、等量のヌクレアーゼフリー水と標準的な2.5 M LiCl溶液(30 μL)を混合し、-20°Cで>30分間インキュベートします。
       注:効率的な沈殿は2時間後に得ることができますが、通常、一晩のインキュベーションによりmRNAの最終収量が増加します。
   13. 精製したmRNAをペレット化するには、反応液を4°C、17,949 × g で30分間遠心分離し、上清を除去します。次に、ペレットを 1 mL の 70% エタノール (EtOH) で ~1 mL 洗浄し、4 °C で 17,949 × g で 15 分間遠心分離して、反応から汚染物質と残留ヌクレオチドを除去します。
   14. ペレットを風乾し、20 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。RTで穏やかに繰り返しピペッティングしてRNAをよく溶解し、10分でインキュベートします。
       注:ペレットを5分ごとにチェックして、EtOHが蒸発することを確認します。再懸濁するときは、RNAの粘着性を考慮して、水に適切に溶解するまでピペットで固定してください。
   15. 分光光度計で260 nmおよび280 nm(260/280比)の吸光度を測定することにより、調製したmRNAの濃度と純度を評価します。RNA調製物のさまざまなスカラー希釈を測定して、正確な濃度推定を確保します。
       注:通常、合成されたRNAの濃度は1〜2μg/mLの範囲ですが、最終的な量はCDSの長さと出発物質の量によって異なります。
   16. 品質を評価する際には、mRNAストックを氷に保持し、5 μLのアリコートに分注し、注射に必要なまで-80°Cで保存します。
3. 胚注入および薬物治療のための標準溶液および材料の準備(2-3日目、 図1B)
   1. ゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション針を滅菌毛細血管(標準毛細血管寸法:1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm)を使用してプルします。市販のプーラー装置を使用し、出力電圧、引っ張りモード(1ステップまたは2ステップ)、引っ張り力など、お好みの設定を適用することで、先端の長さ、径、針形状を可変にすることができます。ゼブラフィッシュに一般的に使用される針の特徴については、Abdelrahmanら¹¹を参照してください。
      注:環境条件(湿度や室温など)が針引きの結果に影響を与える可能性があるため、最適な設定はラボによって異なる場合があります。設定は定期的に再テストおよび調整する必要があります。引っ張った針は、RTで清潔な容器に数ヶ月間保管できます。
   2. 101.7 gのNaCl、1.56 gのKCl、2.96 gのMgSO₄ x 7H₂O、4.25 gのCa(NO₃)₂、および35.75 gのHEPESを1 Lの二重蒸留(DD)水に溶解して、pH 7.6で30x「Danieau」ストック溶液を調製します。また、注入混合物の可視トレーサーとして使用するために、DD水に5%のフェノールレッドのストック溶液を調製します。
   3. 4 mLのNaCl(5 M)、680 μLのKCl(1 M)、1.32 mLのCaCl₂ x 2H₂O(1 M)、および1.32 mLのMgSO₄ (1 M)を最終容量の4 L逆浸透水に希釈して、胚増殖用のE3培地溶液を調製します。
   4. 製品データシートおよび溶解度(5 mgを1.036 mLのDMSOに溶解することにより、選択したMEKiの10 mM)に従って、目的の薬剤(この例ではMEK阻害剤[MEKi]PD032590)のストック溶液を調製します。よく混ぜて少量のアリコートを作製し、使用するまで-80°Cで保存します。
      注:DMSOは、極性化合物と非極性化合物の両方を溶解するために使用される一般的な溶媒であり、水だけでなく幅広い有機溶媒に溶解性を示します。
   5. アルテミア・サリーナのシストを孵化溶液(逆浸透水に溶解した30g/Lの海塩に2g/Lのアルテミア・サリーナ・シストを2g/L)で28-30°C以上18時間孵化させ、生きたブラインシュリンプ懸濁液を調製し、一定の通気を提供します。
      注:培養条件と孵化時間は、施設の環境条件と嚢胞ロットの影響を受ける可能性があるため、定期的に再テストし、必要に応じて再設定する必要があります。
4. Tg[ef1α:ERK biosensor-nes](10代)魚の育種ペアの準備(3日目)
   1. 交配の日は、承認された動物施設のプロトコルに従って、成体のペアに定期的に餌を与えます。
      1. 孵化したブラインシュリンプを含む培養物を、フィルターサイズの異なる2つのストレーナー(フィルターステップI:180μm、フィルターステップII:112μm)で孵化していないまたは空の嚢胞をろ過して洗浄します。
      2. ろ過したブラインシュリンプを200mLの逆浸透水に集めて洗浄し、約5〜10mLのブラインシュリンプ溶液を10〜15匹の成魚に供給します。
         注:孵化したブラインシュリンプ溶液の品質をチェックして、活力、運動性、サイズ、色を確認し、魚にとって消化できず、魚の胃腸管に害を及ぼす可能性のある孵化していないまたは空の嚢胞を必ず取り除いてください。繁殖ペアの場合、食物の消化を可能にし、高い水質レベルを維持するために、繁殖タンクでペアを分離する少なくとも3時間前にその日の最後の食事を提供することが望ましいです。
   2. (少なくとも)過去2週間に交尾のためにペアになっていない魚のペアを選択して、苦痛を最小限に抑え、配偶子の発達を可能にします。選択した成魚の ティー ンフィッシュペア(通常はこの組成:1 ♂:2 ♀)を適切な繁殖タンクに順応させます。翌朝までタンクの仕切りを使ってメスとオスを分けます。14/10時間の標準的な明暗サイクルを確保します。
      注:グループクロスも手配できます。しかし、この場合、産卵は異なる時期に発生する可能性があり、混合クラッチから同じ段階で胚を選択することはより困難になります。暗い状態から明るい状態への移行は、交配を成功させるために重要です。
5. WTおよび変異型mRNAの胚採取とマイクロインジェクション(4日目)
   1. 施設内の照明が点灯したらすぐに、オスとメスを隔てる水槽の仕切りを取り外し、必要に応じて水槽の水の約20%を再循環養殖システムの真水と交換することで、魚が放出するホルモンを過度に希釈することなく水質を高く保ちます。
   2. 魚を邪魔せずに、産卵を定期的にチェックします(通常は日光の最初の30分から1時間)。卵(2〜3 mm)を産み、大人が食べられないように格子で区切られた水槽の底に落ちます。繁殖に成功した成虫を分離し、卵を含むタンクの水を標準的なストレーナー(茶こし器など)で濾して卵を保持します。
      注:同じ魚を別の交配ラウンドのために繁殖タンクに戻すか、魚を元のハウジングタンクに戻して、交配ペア、日付、およびパフォーマンスを記録することができます。
   3. 採取した胚を新鮮なE3培地で洗い、パスツールピペットを使用して、未受精、変性卵、糞便、その他の種類の破片をペアから取り除きます。
      注:胚の過密を避けるために、直径90mmのペトリ皿に~n = 100個の受精 したティーン の卵を収集します。
   4. 受精 した10代の 卵子を、E3培地で2%アガロースを成形して得られたカスタムマイクロインジェクションプレートに配置し、位置合わせして、マイクロインジェクション中に卵子を封じ込め、制限する必要がある適切なレーンを生成します。
      注:この目的のために、カスタムメイドまたは市販の金型を使用することができます。
   5. 以下のように変異胚を生成するための新鮮なマイクロインジェクションミックスを準備します:キャップを施したポリアデニル化mRNA(ここではshp2)の30-60 pgを0.3倍Danieau溶液(ストック溶液から希釈)に溶解し、最終容量20μL.マイクロインジェクショントレーサーとしてフェノールレッドストック溶液0.2μL(0.05%)を加えます。
   6. マイクロローダーピペットを使用して、2 μLの注入材料でニードルをバックロードします。市販の圧力マイクロインジェクションデバイスを使用して、10代のゼブラフィッシュ胚の1細胞ステージに溶液を注入し、圧力と時間の設定を手動で調整して、針と胚の品質に基づいて各注入をキャリブレーションします。文献^11,12に記載されている標準的なゼブラフィッシュマイクロインジェクションプロトコルを参照してください。
   7. マイクロインジェクションした Teen の胚を、制御された飼育条件(温度:28°C、湿度:70%、明暗サイクル:14/10時間)で育て、最適な発育のために、沈着後3時間以内に曇った卵や退化した卵子を洗い流します。
   8. 受精後~4時間後(hpf)に、適切なランプとフィルターの設定(465-500 nm)を備えた標準的な蛍光実体顕微鏡を使用して、胚の蛍光(レポーター発現)をスクリーニングします。FRETイメージングには 10代陽性の魚を使用し、免疫組織化学(IHC)評価には陰性の兄弟を使用します(以下を参照)。
      注:Tol2ベースの導入遺伝子¹³の発現における既知の変動性を考慮すると、胚は変動レベルの Teen 蛍光を示すことができる。注入されていない兄弟を検査して、バッチ内の蛍光の個人間変動を制御し、FRETイメージングのダイナミックレンジが低いことを考慮して、基礎蛍光のレベルが極めて低い胚を廃棄することをお勧めします。
6. MEK阻害剤(MEKi)によるゼブラフィッシュ胚の治療(4日目)
   1. MEKi PD0325901 (1 mM) の中間溶液を調製するには、10 mM ストック溶液 1 μL を E3 培地で 9 μL で希釈します。中間溶液を使用して、最終的な低用量溶液を取得します。.0.75 μL の 1 mM 中間溶液と 2.25 μL の E3 培地を混合して、総容量 3 mL の低用量 (0.25 μM) の MEKi PD0325901を調製します。0.75 μL の 10% DMSO を 2.25 mL の E3 培地で希釈して、コントロール溶液 (Ctrl) を得ます。
   2. 6ウェルプレートの異なるウェルに同数の胚プールを置き、浴浸漬による治療を開始します:各ウェルについて、E3培地をビヒクルコントロール(0.0025% DMSO)または前述のように所望の濃度(0.25 μM、0.0025% DMSO)で希釈した薬物を含むE3培地と交換します。ウェルあたり3mLの薬液を使用してください。
      注:キャリア(DMSO)の濃度の変化によって引き起こされる影響を排除するには、コントロール溶液と処理溶液の両方が同じ最終DMSO濃度を持つことを確認することが重要です。
   3. 処理した胚を28°Cに保ってから、フォローアップアッセイ(ここでは形態測定分析とIHC検証)のために目的の発生段階まで収集してください。

2. 原腸期のRASopathyゼブラフィッシュモデルのライブマルチスペクトルFRETイメージングとデータ解析

1. ライブイメージングのための原腸の取り付け(4日目)(図2A)
   1. 1.5 gの低融点アガロース(LMA)を1x PBSに溶解して1.5% LMA/E3を調製することにより、生きた胚用の封入培地を調製します。
      注:アガロース濃度は、発生段階と魚を抑制する特定の必要性に応じて、0.8〜1.5%から選択します。新たに調製したLMA溶液を所望のフォーマットのアリコートで分配し、LMAを重合状態でRTで保存します(数ヶ月間安定)。これにより、細菌や真菌の汚染が最小限に抑えられますが、使用前にLMAアリコートの品質を定期的に確認してください。
   2. サンプルをマウントする前に、1.5% LMAアリコートをサーモミキサーまたは滅菌水浴で50°Cに溶かします。 溶解したら、サーモミキサーの温度を約30°Cに下げます。
   3. 単一の注入されたTeen ⁺胚(ここではShp^D61Gを発現する原腸)を、ライブイメージング用の直径35mmのガラス底皿の中央に配置し、細い毛を使用して向きを変えます。余分なE3培地を取り除き、LMAを上に一滴垂らして胚を固定し、RTで重合させます。
      注:重合プロセスの開始時には、魚を目的の位置に向けることができます。組織の損傷を避けるために、LMAを35°C以下の温度で使用することを固く推奨します。
2. 顕微鏡パラメータの設定と原腸のマルチスペクトルFRETイメージングの実施(4日目)(図2B)
   注:このプロトコルは、FRETイメージングを実行するために必要なすべてのハードウェアとソフトウェアを備えた共焦点顕微鏡プラットフォームの使用に適用されます。ここでは、波長線458-476-488-496-514nmのアルゴンイオンレーザー、励起光と発光を分離するプログラマブル光学ビームスプリッター(AOBS)、2つのスペクトルハイブリッド(HyD)検出器、およびサンプルのライブイメージング中に温度(28°C)と湿度の安定した条件を維持するためのステージインキュベーターを備えた共焦点顕微鏡を使用しました。
   記載されているライブマルチスペクトルFRETイメージングプロトコルは、Fasanoらによって示されているように、初期の原腸を超えるさまざまな発生段階の胚に適用できます。⁷.後の発達段階(24 hpfなど)では、より大きなzスタックを検討し、スペクトルFRET画像取得中にマルチスペクトル検出ステップを可能にするために、適切なz間隔とt間隔の設定を検討する必要があります。
   1. 捕獲開始の少なくとも1時間前にインキュベーターコントローラーをオンにし、ゼブラフィッシュの胚を健康な状態に保つために温度を28°Cに設定します。インキュベーターの温度が安定したら、胚を入れたイメージングディッシュをサンプルホルダーに置き、10倍/乾燥対物レンズ(開口数0.4)を使用してサンプルを迅速に視覚化します。
   2. 参照されているソフトウェアの レーザー構成 で、アルゴンイオンレーザーのスイッチをオンにし、スライダーを使用して レーザー出力 を 50%に調整します。 [ハードウェア設定] で、画像が取得される 8 ビット深度解像度 を選択します。
   3. 取得パネルでスペクトル検出XYλZスキャンモードを選択し、次の取得パラメータを設定します:画像のフォーマット:512 x 512 px、スキャン速度400 Hz;光学ズーム は0.75。
   4. アルゴンイオンレーザーの458nmレーザーラインをアクティブにし、その強度値を通常<10%(ここでは8.5%)に設定します。
   5. HyD検出器を選択し、目的の値(ここでは500)を入力して検出器の感度(ゲイン)を調整します。
      注:蛍光の弱い生サンプルの場合、およびバックグラウンドノイズの蓄積を少なくするために、光電子増倍管(PMT)ではなくハイブリッド検出器を使用することをお勧めします。
      参照されているソフトウェアでは、色素の発光スペクトルを表示するには、検出器をアクティブにする必要があります。
   6. まず、最初の検出器(HyD)をアクティブにし、 シアン蛍光タンパク質(CFP) を選択してその発光曲線を表示します。ソフトウェアの 検出器 バーのドロップダウンメニューを開いて、 CFP排出曲線の選択リストを開きます。次に、2 番目の検出器をアクティブにして、2 番目の色素 である黄色蛍光タンパク質 (YFP) の発光曲線を表示します。 Ypet 発光曲線も表示するには、2 つ目の検出器をアクティブにし、2 つ目の検出器をオフにした後、スペクトル画像に表示される YFP 発光曲線 を選択します。
      注:この手順が完了したら、スペクトル取得モードで使用される検出器は1つだけであるため、2番目の検出器を非アクティブ化する必要があります。
   7. ライブ取得を開始するには、検出カーソルを最も強い信号放射の範囲(この場合はYFPの放射)に置き、サンプルを可視化し、z-stack LAS Xウィンドウでサンプルの厚さの開始位置と終了位置を決定して設定します。
   8. λ-スキャン範囲のプロパティについては、次のパラメータを設定します:検出範囲の開始(460 nm)と終了(570 nm)。 検出バンド幅:5 nm; λ-スキャンステップサイズ:5nm。z-stack の取得を開始します。
      注意: 示されているパラメータにより、ユーザーは許容できる解像度で比較的高速なイメージングを取得できますが、異なる設定を使用することができます。 フッ素化剤ディスク設定では、自動的に挿入されたNOTCHフィルターの選択を解除して、単一の強度損失を回避できます。
   9. MEKi曝露時のシグナル変化をリアルタイムで評価するには、単一の変異胚(ここではShp2^D61G)をガラス皿にマウントし、薬物治療の前後に画像化します。これらのライブ実験では、イメージングセッション中に、溶解した薬物を含む溶液を最大2mLの状態で浴に浸すことにより、薬物治療を直接行います。
3. レシオメトリックFRET画像を取得するための画像後処理とマルチスペクトル色素分離(5日目)(図2C)
   1. ドナー(CFP)とアクセプター(Ypet)の発光を分離するには、 スペクトルブリードスルー(SBT)と呼ばれるFRETチャネル内の両方の分子の蛍光発光の寄与を確実に排除してください。
      1. 公開されている色素/蛍光タンパク質データベースを参照して、標準のCFP発光スペクトル(励起および発光スペクトル)に関連する.cvsファイルを表示およびダウンロードしてください。
      2. .cvs ファイルの [データ] パネルで 、[ テキストから列へ ] オプションを選択し、区切り文字としてコンマを使用してデータを列に分割します。結果のファイルには、削除する必要がある追加情報(CFP励起、CFP 2Pなど)が含まれます。波長と発光に対するカラムデータのみを保持します。
      3. CFP emission カラムで、501 nm 以降のすべての強度データを削除します。
      4. 460 nmから500 nmまでのCFP発光スペクトルファイルを.xls形式で保存します( 図2Cでは「eCFP modified」と呼んでいます)。
      5. 同じ手順を繰り返して、YFPタンパク質の発光スペクトルをダウンロードして解析し、波長と発光に対するカラムデータのみを保持します。524 nm までのすべての発光値を削除します。適合したYFP発光スペクトルファイルを525〜650 nmのin.xls形式( 図2Cでは「525nmからのYpet」と呼びます)に保存します。
      6. ソフトウェアの [設定 ]ウィンドウで使用可能な色素データベースでスペクトルブリードスルー(SBT)を除外するには、CFPとYFPの2つの適合参照発光スペクトルを挿入して保存します。
   2. イメージングセッションから結果のスペクトル画像ファイルを選択し、[解析]ウィンドウを開いて、[Dye Separation]ツールで[Spectral Dye Separation]を選択します。色素分離の設定を次のように構成します:ダイアログの左側にあるドロップダウンリストで、最初の位置にある新しいCFP発光スペクトル(eCFP変更)を選択し、スペクトルデータベースから新しいYFP発光スペクトル(525nmからのYpet)を選択します。
   3. 「Rescale」で「Per Channel」を選択してチャンネルを個別にスケールし、画像のλ-スキャンで信号強度が最も高いものを選択します(FRETチャンネルの発光ピークのレベルでスペクトルスキャンのステップ14に対応、図2Bの右側の検出ステップを示すパネルの白い矢印で示されています)).次に、サンプルのZスキャンに沿って移動し、マージンゾーン上の関心領域を強調表示する光学セクションを選択します。
   4. 動物極のマージンゾーンでROI選択モードを使用して、最適なスペクトルを持つ領域を定義します。表示ウィンドウの上部に示されているROICrosshairをクリックして十字線を呼び出し、測定領域に40ボクセルの値を入力して参照ROIのサイズを調整します。ROICrosshair によって対象領域を正確に定義します。イメージダイアグラムで、データの正規化を選択し、「適用」をクリックして、構成した設定で色素の分離を実行します。
   5. 2つのチャネルを分離して取得したこの新しく生成されたファイルを開き、3次元画像シリーズから2次元投影画像(最大強度投影)を生成してデータを視覚化します。
   6. 「処理」ウィンドウで「クロップ」を選択して、チャンネルを CH1 チャンネルと CH2 (または FRET) チャンネルの 2 つのファイルに分けます。
   7. [処理] ウィンドウで、[画像の結合] を選択し、CH2 ファイルを選択して最初のオプションに挿入し、次に CH1 ファイルを選択して 2 番目のオプションに挿入します。係数 5 で再スケールを設定し、比率操作を選択します。次に、[適用]をクリックして、レシオメトリック画像(YFP / CFP)を含む新しいファイルを生成します。フォローアップデータ分析のためにファイルを保存します。
4. FRET信号の定量解析と画像レンダリング(5-6日目)(図2D)
   1. FRET/CFPレシオメトリック画像からのFRETシグナルの定量的測定には、期待される効果に基づく先験的な統計的評価に応じて、N>2胚(複製)で実験を行います。オープンソースソフトウェアFijiなどの画像処理パッケージを採用します。スペクトルイメージングと色素分離から得られた画像ファイルを、オープンソースのFijiなどの画像解析パッケージにインポートします。
   2. 原腸腫画像のROI選択を開始する前に、Analyze関数 |測定値の設定 |[面積]、[積分密度]、[平均グレー値] など、目的のパラメータを選択します。
   3. ツールバーの多角形選択ツールを使用して、関心領域(この特定の研究では原腸の縁)を選択します。ROIのx、yの仕様を保存するには、[Analyze |ツール |ROIマネージャー。
   4. 選択したROIで測定を実行するには、 Analyze |測定します。ROI と画像/条件ごとにこれらの手順を繰り返します。
      注: 必要に応じて、イメージを .TIFF形式。複数の画像から派生したすべてのROI測定値を1つのROIファイルとして保存することができます。ROI マネージャー リストの各メジャーの名前を、各サンプル/イメージに対して正しい名前に変更します。
   5. 各条件(ここでは変異体と変異体+治療)について、得られた選択した各ROIのFRET/CFP比のすべての値を抽出し、たとえば、実験グループを列に、各生の値を行に整理してワークシートに整理します。
   6. 適切なソフトウェアを使用して、異なる実験条件間でのFRET信号の統計的差異を評価し、グラフ生成とデータの視覚化を行います。
      注:オープンソースおよびライセンスソフトウェアは、データ分析およびグラフ作成ソリューションに利用できます。
   7. 統計的評価のための特定のプロジェクトを編成し、すべての生の測定値と各実験条件の反復回数を考慮します。1 つの生物学的レプリケートの統計解析では、1 つのグループ化変数を持つカラムテーブルを作成し、各グループはカラムで定義されます。複数の生物学的複製の統計解析を行うには、少なくとも 2 つのグループ化変数 (1 つは列 (実験条件など) で定義され、もう 1 つは行 (反復の平均値など) で定義されるグループ化テーブルを作成します。
   8. ワークシート内の実験グループを適切に配置した後、データ分布を評価し(正規性検定、D'Agostino-Pearson、Anderson-Darlingなど)、その結果に基づいて、最も適切な統計的検定を選択します。
      1. パラメトリック データ (ガウス分布に従う) の 1 因子分散分析とノンパラメトリック データに対する Kruskal-Wallis 検定を実行します。より多くの要因(遺伝的および薬物濃度)が存在する場合は、二元配置分散分析(ANOVA)を検討してください。各条件の平均FRET値を相互に比較し(多重比較)、 事後 検定を使用して多重比較を補正します(たとえば、パラメトリックデータとノンパラメトリックデータについてはそれぞれテューキー検定とダン検定)。

3. FRET結果のIHCバリデーションと原腸陥入欠損の相関形態解析

1. tERKおよびpERKに対するIHCの溶液の調製と胚固定およびマウント(7日目)(図3A)
   1. IHCに必要な作業溶液を準備します。
      1. 80 gのNaCl、2 gのKCl、14.4 gのNa₂HPO₄、および2.4 gのKH₂PO₄ を1 LのDD水に溶解して、10x PBSのストック溶液を調製します。溶液をオートクレーブして無菌状態に保ちます。
      2. 10% Triton X-100 8 mL を 1x PBS 100 mL の最終容量に溶解して、0.8% PBS-Triton (PBSTr) 溶液を調製します。
      3. 20%、50%、80%のグリセロール溶液を、それぞれ3 mL、7.5 mL、12 mLの100%グリセロール溶液を、最終容量の15 mL 1x PBSで希釈して調製します。
   2. 16% PFA 2.5 mL を 10% Triton X-100 の最終容量 10 mL に溶解して 16% PFA 2.5 mL を混合し、4% パラホルムアルデヒド (PFA)/0.25% PBSTr (固定液) を調製します。この溶液を使用して、胚を6 hpf、4°Cで一晩固定します。 2 mLのチューブとチューブあたり最大5つの胚を使用して、効率的な固定と洗浄を可能にします。
      注:固定ラウンドごとに新しい固定液を調製することをお勧めします。注意: ホルムアルデヒドを16%で取り扱う場合は、個人用保護具(PPE)を着用し、化学フードの下に保管してください。
   3. 2 mLチューブに1.5 mLの0.8% PBSTrを数回充填して、胚を洗浄します。胚を新しい2 mLチューブに移し、使用するまで胚を1x PBSに保存します。
      注:初期のゼブラフィッシュの胚の取り扱いに詳しくない場合は、ピペッティング中の胚の損失を避けるために、実体顕微鏡で作業してください。「低結合」のプラスチック製品を使用して、胚がチューブ壁に付着する可能性を減らします。
2. pERKおよびtERKに対する組織透過化およびIHC(7〜9日目)
   注:IHCの結果は、ラボ間で異なる可能性のある複数の変数に依存し、プロトコルの特定の最適化が必要になる場合があります。
   1. 固定したゼブラフィッシュの胚を0.8% PBSTrの1 mLでRTで10分間3回洗浄します。
   2. 0.8% PBSTr(1:1,000)で希釈した2 μLのProteinase Kを室温で2分間、サンプルを透過処理します。
   3. 0.8% PBSTr 1 mL で 10 x 3 分間サンプルを洗浄し、4% PFA/1x PBS の 500 μL で RT で 20 分間サンプルを洗浄して、組織の透過処理を停止します。次に、サンプルを0.8% PBSTrの1 mLで10 x 3分間洗浄します。
      注:組織の透過化に使用される方法と時間は、抗原の種類、組織保存の品質、および環境要因によって影響を受ける可能性のある重要なステップです。貴重なサンプルに適用する前に、プロトコールを最適化してください。
   4. 5%正常ヤギ血清(NGS)、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、1%DMSOを含む1xブロッキングバッファー(BB)でサンプルをインキュベートし、次のように調製します:75 μLの100% NGS、150 μLの10% BSA、および15 μLの100% DMSOを最終容量の0.8% PBSTrで1.5 μL使用します。 チューブあたり200 μLの溶液を使用し、溶液中のRTで胚を20〜30分間インキュベートします。
   5. 前のステップで1x BBを取り出し、調製したばかりの1x BB溶液250 μLに目的の一次抗体(ここでは、1 μLの一次マウスモノクローナル抗体p44/42 MAPKを希釈、総ERK、tERK、+ 1 μLのウサギポリクローナルリン酸化-p44/42 MAPKを希釈、リン酸化ERK、pERK)を混合した溶液でサンプルをインキュベートします。チューブあたり200μLの溶液を使用し、溶液中で胚を20°Cで一晩インキュベートします。
   6. 非特異的結合を排除するには、サンプルを 1 mL の 0.8% PBSTr で数回洗浄します (最初は 10 分ごとに、次に 30 分ごとに洗浄します)。
   7. 調製したばかりの1x BBでサンプルを室温で20分間インキュベートし、チューブあたり200 μLを使用します。
   8. 前のステップで1x BBを取り出し、二次抗体(蛍光488ヤギ抗マウス1 μL、+ 蛍光633ヤギ抗ウサギ1 μL、1x BB溶液600 μLに1 μL)を混合してサンプルをインキュベートします。胚を20°Cで一晩静かに振とうしておきます。
      注:FRETイメージングに使用したのと同じバッチの陰性(トランスジェニックではない) ティーン フィッシュに対してIHCを実施しました。あるいは、 Teen⁺ フィッシュも使用できますが、この場合、CFPまたはYFPの発光スペクトルと重複しない蛍光色素に結合した二次抗体を代わりに使用する必要があります。
   9. 上記のように非特異的結合を排除します。
   10. グリセロール/1x PBS溶液(20%、50%、80%)のグラジエントでサンプルを室温で各溶液ごとに15分間洗浄し、サンプルを90%グリセロール/1x PBSで4°Cで保存します。
       注:蛍光減衰の可能性を最小限に抑えるために、サンプルを暗所に保管してください。
3. 免疫染色組織の共焦点顕微鏡法と定量分析(10-11日目)(図3B-E)
   1. 前に説明したように胚をマウントします。
   2. 共焦点顕微鏡取得パラメータを次のように設定します:白色レーザーを 80%、蛍光標識ヤギ抗マウス(この場合、tERKに使用、発光スペクトル488nm)、蛍光標識ヤギ抗ウサギに644-740nm(この場合、pERKに使用、633nmの発光スペクトル)に蛍光標識ヤギ抗ウサギ用。シーケンシャル集録モード、512 x 512 px のフォーマットスキャン、400 Hz の速度を選択します。スキャンの開始と終了を、zステップサイズの厚さを4〜5μm、標準デジタルズームを1で定義します。水浸25倍対物レンズ(開口数0.05)を使用して、6 hpfで原腸全体を取得します
      注意: このプロトコルには、有害な可能性のあるレーザーの適用が含まれています。したがって、特定の国の要件に応じた人材育成が必要です。
   3. 共焦点画像取得後、オープンソースソフトウェア Fijiなどの画像処理パッケージを使用して取得した生画像ファイルを検査します。
      1. フィジーでは、メニュー [画像] とサブメニューの [色] から [チャンネルを分割] コマンドを使用して、1 つのチャンネル画像 (合計 ERK: チャンネル = 0、C = 0; pERK: チャンネル =1、C = 1) を取得し、[画像] |スタック |Zプロジェクト。
      2. 前に説明したようにROI強度測定の手順を繰り返し、データをワークシートに抽出します。
      3. 実験グループ間での所望のROIにおけるp-ERKシグナル強度の変化を推測するには、p-ERK染色の生の積分密度値をt-ERKシグナルの生の積分密度で割ることにより、p-ERK/t-ERK比を計算します。ステップ 2.4 と同様に、統計的有意性の評価に進みます。
         注:イメージングパラメータの設定は、特定のニーズに基づいて、各サンプルの時間、画像の望ましい品質、および取得する平面の数を考慮して変更できます。
4. 11 hpf胚の軸測定(胚固定は4日目、データ取得と分析は12日目)(図4A-D)
   1. 原腸陥入(11 hpf)の終了時に、胚を1x PBS中の4% PFAで室温で20分間固定し、1x PBSで数回洗浄し、画像取得まで4°Cで保存します。
   2. パスツールピペットを使用して、新鮮な1x PBSを含む12ウェルプレートの1ウェルで胚を横方向に向けます。
   3. ゼブラフィッシュの特徴的なラソパシー表現型である楕円形(Y/X胚軸比>1)の存在、治療効果の結果としての胚軸比の形態学的救出を評価するには、 倍率3.4倍対物レンズ(走査対物レンズ0.63倍×ズーム倍率8.60倍)の実体顕微鏡を用いて 、明視野モードで画像を撮影するだけで全胚の画像を取得します。
   4. 画像ファイルをオープン ソースの Fiji などの画像分析パッケージにインポートします。
      1. 胚の軸の長さ(x、短軸、y、長軸)を測定するには、ツールバーから 直線ツール を選択し、 分析|測定します。選択した測定を実行した後、それらをROIマネージャーリストに追加し、上記のFRETイメージング解析で説明したようにROIファイルを保存します。
         注:各胚画像についてこれらの手順を繰り返します。
   5. ワークシートでデータをエクスポートし、長軸の長さ(y)を短軸の長さ(x)で割って軸の比率を計算します。平均、平均の標準偏差、または異なる反復の平均の標準誤差を計算します。
   6. ステップ 2.4 の統計データ分析に進みます。

結果

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚で一過性のRASopathyモデルを迅速に生成し、最近確立されたERKゼブラフィッシュ^{センサー6,9}に適用される標準的なライブFRETイメージング法を使用して、初期変異体のERK変動を評価するための簡単なワークフローを示しています。最近示された^ように、^6,7

ディスカッション

何十年にもわたる研究と無数の突然変異が高度に不均一なRASopathiesの形態を現在マッピングしているにもかかわらず、診断されていない患者のシーケンシングの取り組みから、意義不明の遺伝的変異が出現し続けています。実際、多くの場合、臨床的特徴のみに基づく診断は困難であり、シーケンシング結果を検証するための機能的なゲノムアプローチは依然として?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Mini-sub Cell GT Horiziontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1704406	Gel Elecrophoresis
PC-100 Vertical puller	Narishige	-	Needle puller
PowerPac Universal Power Supply	Bio-Rad	1645070	Gel Elecrophoresis
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Plasmid preparation
Softwares
Biorender	Biorender	CC-BY 4.0 license	Cartoon elaboration for Figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Data analyses
Fiji software	ImageJ	15.3t	Imaging rendering and quantitative analyses (FRET signals measurements, ERK fluorescence intensity in IHC assay, embryo axes lenght)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Statistical data analyses
iControl spectrophotometer software	Tecan	v. 2.0	RNA quantification
Illustrator	Adobe	26.0.3 (64-bit)	Figure assembling
LASX software	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Imaging acquisition for spectral FRET experiments and embryo imaging for axes lenght measurements
Q9 Mini 18.02-SN software	Uvitec	-	Gel image acquisition