Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Özet

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Özet

RASopatiler, ERK hiperaktivasyonunun neden olduğu ve kansere yatkınlığa da yol açabilen multisistemik hastalıklarla sonuçlanan genetik sendromlardır. Geniş bir genetik heterojenliğe rağmen, RAS-MAPK yolağının anahtar düzenleyicilerindeki germ hattı fonksiyon kazancı mutasyonları, vakaların çoğunun temelini oluşturur ve gelişmiş dizileme teknikleri sayesinde, RAS-MAPK yolunu etkileyen potansiyel olarak patojenik varyantlar tanımlanmaya devam etmektedir. Doğru tanı için gerekli olan bu varyantların patojenitesinin fonksiyonel olarak doğrulanması, tercihen in vivo olarak hızlı ve güvenilir protokoller gerektirir. Erken çocukluk döneminde etkili tedavilerin azlığı göz önüne alındığında, bu tür protokoller, özellikle uygun maliyetli hayvan modellerinde ölçeklenebilirse, ilacın yeniden konumlandırılması/yeniden kullanılması için klinik öncesi bir zemin sunmada etkili olabilir.

Burada, zebra balığı embriyolarında geçici RASopati modellerinin hızlı bir şekilde üretilmesi için protokolü ve gerçek zamanlı multispektral Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme yoluyla gastrulasyon sırasında meydana gelen canlı hastalıkla ilişkili ERK aktivite değişikliklerinin doğrudan incelenmesi için protokolü adım adım açıklıyoruz. Protokol, yakın zamanda kurulmuş ve ticari mikroskopların donanımı ile entegre edilmiş bir transgenik ERK raportörü kullanır. Shp2^D61G'nin ekspresyonu ile elde edilen Noonan sendromu (NS) zebra balığı modelleri için örnek bir uygulama sunuyoruz. Mevcut düşük doz MEK inhibitörleri ile farmakolojik sinyal modülasyonundan önce ve sonra NS balık modelinde ERK sinyal değişikliğinin kaydedilmesini sağlayan basit bir yöntem tanımladık. Tedaviden önce ve sonra multispektral edinimlerden ratiometrik FRET sinyallerinin nasıl üretileceğini, alınacağını ve değerlendirileceğini ve sonuçların erken aşamalarda tüm embriyolar üzerinde klasik immünofloresan yoluyla nasıl çapraz doğrulanacağını detaylandırıyoruz. Daha sonra, standart morfometrik parametreleri inceleyerek, ERK aktivitesi döllenmeden 6 saat sonra canlı FRET ile değerlendirilen aynı embriyolarda, gastrulasyonda ortaya çıkan bir bozulmanın göstergesi olan embriyo şeklindeki geç değişikliklerin nasıl sorgulanacağını açıklıyoruz.

Giriş

RASopatiler, normal gelişimi bozan ve çeşitli organ ve dokuları etkileyen genetik sendromlardır. Bu koşullara genellikle RAS / MAK sinyallemesinde yer alan anahtar genlerdeki ve oyunculardaki germ hattı fonksiyon kazancı (GoF) mutasyonları neden olur ve bu da hücre dışı sinyal regüle kinazın (ERK) hiperaktivasyonu (artan fosforilasyon) ile sonuçlanır. ERK, gelişim sırasında önemli olan bazı temel süreçleri düzenler - doku büyümesi - çekirdeğe^yer değiştirerek ^1,2. RAS-MAPK yolağında yer alan genlerdeki somatik mutasyonlar, kansere yol açan en yaygın olaylardır³. Bu nedenle, şaşırtıcı olmayan bir şekilde, RASopatilerde kansere yatkınlık da gözlenir. Gelişimsel gecikme, boy kısalığı, değişken şiddette kognitif eksiklikler ve kardiyomiyopati ile karakterize Noonan sendromu (NS), RASopati^2'nin en sık görülen formudur. Çoğu durumda, hastalığa, 2000 yılının başlarında keşfedilen ilk RASopati geni olan PTPN11'deki ^GoF mutasyonları neden olur 4 ve bu gen, yolun pozitif bir düzenleyicisi olarak işlev gören protein tirozin fosfataz SHP2'yi kodlar.

O zamandan beri, tanı konmamış hastalarda ekzom dizileme yaklaşımlarının üstel kullanımı sayesinde, RAS-MAPK'da yer alan faktörleri etkileyen ve muhtemelen çeşitli RASopati formlarıyla bağlantılı potansiyel olarak patojenik varyantlar keşfedilmeye devam etmekte ve verimli hastaların tabakalandırılması için fonksiyonel karakterizasyonu beklemektedir². Bu amaca ulaşmak için, organizma düzeyinde hızlı ve bilgilendirici fonksiyonel doğrulamayı garanti eden deneysel protokoller gereklidir. Önemi bilinmeyen varyantları test etmek için klasik ve standartlaştırılmış memeli modellerinin kullanılması maliyetli, son derece zaman alıcı olacak ve şeffaf olmayan büyük hayvanlarda invaziv yöntemler gerektirecektir. Böyle bir strateji, şu anda yönetim veya tedavi olmaksızın fakir veya teşhis edilmemiş RASopati hastalarının temsil ettiği toplumsal yük göz önüne alındığında, hızlı test gerekliliği ile açıkça uyumlu değildir. Tüm organizmalardaki temel fenotipik özelliklerin ve moleküler korelasyonların kantitatif değerlendirmesi için protokoller, aynı zamanda, RASopati hastaları için muhtemelen mevcut olan ilaçların yeniden kullanım / yeniden konumlandırma yoluyla olası klinik çevirisini hızlandırmaya da hizmet edecektir.

Zebra balığı, erken gelişimi etkileyen hastalıkları incelemek için ideal bir omurgalı modelidir. Başlangıç olarak, zebra balığı insanlarla yüksek düzeyde genetik homolojiyi paylaşır. Yetişkin balıkların yüksek doğurganlığı, küçük ve hızlı gelişen büyük bir embriyo üretimi ile sonuçlanır. Embriyolar erken aşamalarda şeffaftır, öyle ki epiboli, gastrulasyon, eksenler ve vücut planı oluşumu gibi ana gelişimsel süreçler standart mikroskopi kullanılarak zahmetsizce görselleştirilebilir. Ek olarak, genetik modeller oluşturmak için ileri tekniklerle birlikte, gelişim sırasında uzay ve zamandaki belirli hücresel davranışları ve dinamik moleküler olayları izlemek için kullanılabilecek transgenik hatların mevcudiyeti rakipsizdir. Ayrıca, fenotipik okumalar zebra balıklarında (organizmadan hücresel kusurlara kadar) birden fazla düzeyde değerlendirilebilir ve RASopatiler⁵ dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için özel testler zaten oluşturulmuştur. Ayrıca, erken aşamalarda ilaç uygulaması için nispeten basit banyoya daldırma yöntemleri, en azından suda çözünür bileşikler için, 96 oyuklu bir formatta in vivo olarak yüksek verimli ilaç taramasına izin verir.

Moleküler açıdan bakıldığında, immünohistokimya ve immünoblot gibi standart yaklaşımları kullanan çalışmalar, balık embriyolarında ERK aktivasyonu ile RASopati ile ilişkili gelişimsel kusurlar arasındaki korelasyonu sağlam bir şekilde göstermektedir ^6,7. Zebra balıklarında yakın zamanda geliştirilen EKAR tipi FRET biyosensörü (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen), embriyogenez sırasında ERK aktivasyonunu uzay-zamansal olarak çözülmüş bir şekilde kaydetmek için güvenilir bir in vivo araç sağlar. Bu nedenle, RASopati balık modellerinde dinamik ERK değişikliklerinin ve farmakolojik modülasyonların daha iyi değerlendirilmesi için değerli olabilir.

Teen sensöründe, raportördeki spesifik bir ERK substratı, ERK aktivasyonu üzerine fosforile edilir ve floresan CFP donörünü (D) ve floresan Ypet (geliştirilmiş YFP) alıcısını (A) yakın çevreye getiren konformasyonel bir değişikliği tetikler. D emisyon spektrumu, A'nın absorpsiyon spektrumu ile önemli ölçüde örtüşüyorsa, FRET oluşabilir (D'den A'ya enerji emilimi). Bu, D ve A arasındaki mesafe ile orantılıdır ve bu nedenle Teen'de ERK aktivasyon durumu ile orantılıdır. Hem canlı hem de sabit numunelerde standart veya konfokal mikroskopların hem standart hem de gelişmiş görüntüleme modülleri kullanılarak farklı görüntüleme protokolleri oluşturulabilir. D uyarılması üzerine, CFP'den YFP'ye tanımlanmış bir emisyon spektrumu (λ) boyunca multispektral taramaların elde edilmesi ve ardından spektral "karıştırmayan" algoritmaların elde edilmesi, FRET verilerini kaydetmek ve ölçmek için en güvenilir yöntemler arasındadır⁸. İn vivo doku dinamiklerini kaydetmek için canlı zebra balığı örneklerine de uygulanabilir.

Önceki raporları ^6,9 ve son uygulamamızı⁷ takiben, burada, gastrulasyonun başlangıcında NS modellerinin hayvan kutbunun kenarındaki hücrelerde ERK aktivasyonunu değerlendirmek için Teen fish'i kullanarak adım adım iş akışını detaylandırıyoruz ve bunu ancak daha sonraki gelişimde görülebilen karakteristik vücut eksenleri kusurlarıyla ilişkilendiriyoruz. Mevcut bir MEKi ile tedaviden önce ve sonra canlı NS gastrulalarından kantitatif FRET verilerinin nasıl elde edileceğini ve inceleneceğini ve sonuçların fosforile (aktif) ERK'ya karşı standart immünohistokimya yoluyla nasıl çapraz doğrulanacağını veya embriyo uzama kusurlarının korelasyon morfometrik analizinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz.

İş akışı, RASopatiler ile ilişkili olduğu varsayılan yeni ortaya çıkan varyantların ve hastalık genlerinin fonksiyonel testini artırmak ve omurgalı gelişimi sırasında ERK aktivasyon dinamiklerinin mekansal ve zamansal olarak korelasyonu ve embriyolardaki morfolojik kusurlar hakkında bilgi edinmek için uygulanabilir. Bu protokolün, ERK aktivasyonunu modüle etmek için hareket eden aday ilaçların etkinliğini test etmek için de kullanılabileceğini gösterdik.

Protokol

Hayvanların barınması ve yetiştirilmesi ile ilgili tüm deneysel prosedürler, zebra balığının hayvan araştırmalarında kullanımı için ARRIVE yönergelerine göre yürütülmüş ve İtalya Sağlık Bakanlığı (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF) tarafından yetkilendirilmiştir. Tüm DNA/RNA reaksiyonları ve görüntüleme oturumları, gereken nihai materyale veya test edilen gen ve varyant sayısına bağlı olarak istenildiği gibi büyütülebilir veya küçültülebilir.

1. Geçici zebra balığı RASopati modellerinin üretilmesi ve ilaç tedavisi

NOT: RASopati ile ilişkili varyantların ekspresyonunu izlemek için, küçük floresan olmayan etiketlerin (myc veya benzeri) cd'leri ile çerçeve içinde ilgilenilen proteinin istenen kodlama dizisini (cds) barındıran spesifik yapılar kullanılabilir. Bu şekilde, mutant proteinin ekspresyon seviyeleri, etikete karşı standart western blot ile değerlendirilebilir. İlgilenilen spesifik proteine karşı antikorlar mevcutsa, etiketlerden kaçınılabilir. İmmünofloresan, standart protokolleri takiben embriyo dokusu içindeki protein ekspresyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu tür bir kontrol deneyi, mutant protein ekspresyonunu indüklenmiş ERK aktivasyon seviyeleri ile ilişkilendirmek için yararlı olabilir. Mikroskopi sırasında olası floresan emisyon çapraz konuşmaları göz önüne alındığında, FRET görüntüleme kombinasyonunda floresan etiketlerin kullanılması tavsiye edilmez.

1. Plazmid doğrusallaşması (1-2. günler) (Şekil 1A)
   NOT: Belirli bir geni etkileyen GoF mutasyonunun neden olduğu zebra balıklarında (burada RAzopati) geçici bir hastalık modeli oluştururken, hızlı bir yaklaşım, vahşi tip (WT) ve ilgilenilen mutant proteini kodlayan mRNA'yı hazırlamaktır ve daha sonra aşağıdaki adımları izleyerek zebra balığı embriyolarına enjekte edilmelidir. mRNA'yı kopyalamak için şablon olarak kullanılan plazmit, bir T7, Sp6 veya T3 polimeraz promotörü aşağı akışında ve poliadenilasyon (poliA) sinyalinin yukarı akışında klonlanan ilgilenilen gen için istenen tam uzunlukta CDS'yi (kodlama dizisi) içermelidir. Mevcut değilse, ilk adım, zebra balığı veya insan tarafından istenen CDS'yi uygun bir vektör^10'da klonlayarak üretmek ve SANGER dizilimi ile doğrulamaktır. Klonlama için fazladan zaman düşünün (klonlama, kolonileri tarama ve doğru klonları izole etme ve genişletme dahil ortalama 1 hafta).
   1. Plazmiti, poliA sinyalinin aşağı akışında yalnızca bir kez keserek uygun kısıtlama enzimleri ile doğrusallaştırın (burada KpnI). Verimli plazmid doğrusallaştırması elde etmek için, 3 γ (μg/μL) plazmit DNA, 2 μL kısıtlama enzimi (20.000 Birim/mL) ve 10 μL 10x reaksiyon tamponunu nükleaz içermeyen suda 100 μL'lik bir son hacimde karıştırın. Bileşenleri birkaç kez pipetleyerek iyice karıştırın ve reaksiyon karışımını 37 °C'de 2-4 saat inkübe edin.
   2. % 1.5 agaroz jeli üzerinde elektroforez ile doğrusallaştırmanın sonucunu kontrol edin.
      1. 10x stok TBE çözeltisini (48.5 g Tris, 11.4 mL buzlu asetik asit, 20 mL 0.5 M EDTA [pH 8.0]) nükleaz içermeyen su ile seyreltin.
      2. Agaroz jelini, 1.5 g agarozu mikrodalgada 100 mL 1x TBE çözeltisinin son hacminde çözerek hazırlayın. Ardından 3,5 μL boya jeli lekesi ekleyin.
      3. Koşullar/plazmit sayısına bağlı olarak agaroz çözeltisini uygun büyüklükteki odalara dökerek jeli atın. Tarakları yerleştirin ve jel katılaşana kadar yaklaşık 1 saat bekleyin; Ardından, tarakları çıkarın ve polimerize jeli elektroforez için uygun jel tepsisine yerleştirin.
      4. Birkaç μL sindirilmiş plazmid ("kesilmiş") ve 1.5 μL 6x yükleme tamponunu (elektroforezi izlemek için bir boya içeren) 10 μL nükleaz içermeyen son hacimde karıştırın. Aynı şekilde, sindirilmemiş plazmit ("kesilmemiş") ile ayrı bir kontrol numunesi de hazırlayın. Örnekleri agaroz şeritlerine yükleyin ve ilk şeritte 1 Kb'lik bir DNA merdiveni yükleyin. DNA elektroforezini 30 dakika boyunca 100 V'ta gerçekleştirin.
      5. Standart bir UV transillüminatöründe çalışmadan kaynaklanan DNA bantlarını görselleştirin ve belgeleyin. "Kesilmiş" ve "kesilmemiş" DNA bantlarının modelini inceleyerek plazmid doğrusallaştırmanın verimliliğini kontrol edin.
         NOT: Yeterince doğrusallaştırılmış plazmitler, tek bir keskin bant olarak daha hızlı çalışmalıdır. DNA bölünmesinin tamamlandığından emin olun, çünkü transkripsiyon reaksiyonunun başlatılması, daireselleştirilmiş plazmit formlarının varlığı tarafından engellenebilen ve zayıf mRNA verimine neden olan önemli bir sınırlayıcı adımdır.
   3. Ticari olarak temin edilebilen spin sütunu bazlı DNA saflaştırma kitlerini kullanarak doğrusallaştırılmış plazmidi saflaştırmaya devam edin ve saflaştırılmış DNA preparatını gerekene kadar -20 °C'de saklayın.
      NOT: Doğrusallaştırma yerine, mRNA transkripsiyonu için şablon olarak bir PCR ürünü kullanmak mümkündür, ancak polimeraz promotör dizisini yukarı akışta ve durdurma kodonunun akış aşağısında poliA sinyal dizisini içermesi şartıyla. PCR ürünleri ayrıca devam etmeden önce saflaştırılmalı ve bir agaroz jel üzerinde incelenmelidir.
2. In vitro mRNA transkripsiyonu, saflaştırılması ve kalite kontrolü (2-3. günler) (Şekil 1A)
   NOT: çalışma alanını ve pipetleri RNAse dekontaminasyon solüsyonları ile dikkatlice temizleyin. Nükleaz içermeyen malzemeler ve reaktifler kullanın; Eldiven giyin. Bu, RNaz kontaminasyonunu en aza indirecek ve daha iyi bir tam uzunlukta mRNA verimi sağlayacaktır.
   Doğrusallaştırılmış plazmitlerden WT ve mutant proteinleri kodlayan kapaklı ve poliadenillenmiş mRNA'ları, in vitro mRNA transkripsiyonu için standart kitleri kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek kopyalayın.
   1. Saflaştırılmış doğrusallaştırılmış plazmiti 17.949 × g'da birkaç saniye santrifüjleyin, böylece döküntülerin tüpün dibinde toplandığından ve transkripsiyon reaksiyonuna aktarılmadığından emin olun.
   2. Buz üzerinde tutulan NTP ve CAP analoglarının karışımı dışındaki tüm bileşenleri oda sıcaklığında (RT) çözün. Polimerazı kullanana kadar -20 °C'de tutun.
   3. Reaktif kaybını veya kazara kontaminasyonu önlemek için kullanmadan önce tüm reaktifleri 17.949 × g'da kısaca santrifüjleyin ve 10x reaksiyon tamponunu ve kullanıma hazır NTP/CAP analog karışımını tamamen çözelti içinde olana kadar kısaca girdap haline getirin. 10x reaksiyon tamponunu RT'de tutun.
   4. 10 μL 2x NTP / CAP analog karışımı, 2 μL 10x reaksiyon tamponu, 2 μL SP6, T7 veya T3 enzimi içeren bir çözeltiye 600-800 ng doğrusallaştırılmış ve saflaştırılmış plazmit ekleyerek RT'de transkripsiyon reaksiyonunu hazırlayın (plazmiddeki CDS'nin yukarı akışındaki spesifik promotöre bağlı olarak) nükleaz içermeyen su ile yapılan 20 μL'lik bir son hacimde. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
   5. Transkripsiyon reaksiyonunu bir termocycler'da 37 ° C'de inkübe edin. Kapağın sıcaklığını da 37 °C'ye ayarladığınızdan ve reaksiyonu 2 saat çalıştırdığınızdan emin olun.
   6. Reaksiyon sırasında kopyalanmayan kalıntı plazmiti çıkarmak için 1 μL standart DNAse çözeltisi (2 Birim / μL) ekleyin. Reaksiyonu birkaç kez pipetleyerek iyice karıştırın ve 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin.
   7. Devam etmeden önce, TBE/formamid agaroz elektroforezi ile in vitro sentezlenen mRNA'nın kalitesini ve bütünlüğünü kontrol edin. 1.0 g agarozu 50 mL 1x TBE çözeltisi içinde çözün, 5.5 mL %37 formamid ve 3.5 μL boya jeli lekesi ekleyin, karıştırın ve jeli yukarıda açıklandığı gibi dökün.
      DİKKAT: Formamid ile çalışırken, Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) giyin ve kimyasal bir başlık kullanın.
   8. Kopyalanan mRNA'nın 1 μL'sini 2.5 μL 2x Formamid Boya Yükleme Tamponu ile nükleaz içermeyen suda toplam 5 μL hacimde karıştırın. Bileşenleri birkaç kez pipetleyerek iyice karıştırın ve numuneleri jel şeritlerine yükleyin. Jeli 100 mV'de 10-15 dakika önceden soğutulmuş 1x TBE tamponunda çalıştırın. Ayrıca 1 kb'lık bir DNA ve/veya RNA Merdiveni çalıştırın.
   9. İsteğe bağlı: Merdiveni ve mRNA'yı 70 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin.
   10. Elde edilen mRNA bantlarını standart bir UV transilluminatöründe görselleştirin ve belgeleyin.
       NOT: Uzun süreler ve yüksek sıcaklıklar RNA'nın bozulma olasılığını artırır.
   11. Sentezlenen kapaklı RNA'nın bütünlüğü ve boyutu optimalse, reaksiyona ekleyerek C-terminalinin poliadenilasyonu ile devam edin: 36 μL nükleaz içermeyen su, 20 μL 5x denatüre yükleme tamponu, 10 μL 25 mM MnCl₂, 10 μL 10 mM ATP ve 4 μL poliadenilasyon enzimi (saflaştırılmış E. coli Poli (A) Polimeraz gibi). Birkaç kez pipetleyerek reaksiyonu iyice karıştırın ve son reaksiyonun 100 μL'sini 37 °C'de 1 saat daha inkübe edin.
       NOT: PoliA reaksiyonundan sonra RNA kalitesinin jel elektroforezi yoluyla kontrol edilmesi tavsiye edilmez, çünkü RNA, poliA kuyrukları nedeniyle lekelenmiş görünecektir.
   12. LiCl gibi uygun tuzlar kullanarak sentezlenmiş kapaklı ve poliadenillenmiş mRNA'yı çökeltin ve geri kazanın. Kısaca, eşit hacimlerde nükleaz içermeyen su ve standart 2,5 M LiCl çözeltisini (30 μL) karıştırın ve -20 °C'de >30 dakika inkübe edin.
       NOT: Verimli çökeltme 2 saat sonra elde edilebilir, ancak gece boyunca inkübasyon tipik olarak mRNA'nın nihai verimini artırır.
   13. Saflaştırılmış mRNA'yı peletlemek için, reaksiyonu 30 dakika boyunca 4 °C'de 17.949 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Şimdi, peleti ~1 mL %70 etanol (EtOH) ile yıkayın ve reaksiyondaki kirleticileri ve artık nükleotidleri çıkarmak için 4 °C'de 17.949 × g'da 15 dakika santrifüjleyin.
   14. Peteli havayla kurutun ve ardından 20 μL nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. RT'ye nazikçe ve tekrar tekrar pipetleyerek RNA'yı iyice çözün ve 10 dakikada inkübe edin.
       NOT: EtOH buharlaşmasını sağlamak için peleti her 5 dakikada bir kontrol edin. Yeniden süspanse ederken, RNA'nın yapışkanlığı göz önüne alındığında, suda düzgün bir şekilde çözünene kadar pipetleyin.
   15. Bir spektrofotometrede 260 nm ve 280 nm'de (260/280 oranında) absorbansı ölçerek hazırlanan mRNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını değerlendirin. Doğru konsantrasyon tahminini sağlamak için RNA preparatının farklı skaler seyreltmelerini ölçün.
       NOT: Normalde, sentezlenen RNA'nın konsantrasyonu 1 ila 2 μg/mL arasında değişir, ancak nihai miktar, CDS uzunluğuna ve başlangıç materyalinin miktarına bağlı olarak değişebilir.
   16. Kaliteyi değerlendirirken, mRNA stoğunu buzda tutun, ardından 5 μL'lik alikotlara ayırın ve enjeksiyon için gerekli olana kadar -80 °C'de saklayın.
3. Embriyo enjeksiyonu ve ilaç tedavisi için standart solüsyon ve materyallerin hazırlanması (Gün 2-3, Şekil 1B)
   1. Steril kılcal damarlar kullanarak zebra balığı embriyoları için mikroenjeksiyon iğnelerini çekin (standart kılcal boyutlar: 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm). Piyasada bulunan bir çektirme aparatı kullanın ve değişken uç uzunluğu, çapı ve iğne şekli elde etmek için çıkış voltajı, çekme modu (bir adım veya iki adım) ve çekme kuvveti açısından istenen ayarları uygulayın. Zebra balığı için yaygın olarak kullanılan iğne özellikleri için Abdelrahman ve meslektaşlarına^{bakın 11}.
      NOT: Çevresel koşullar (nem veya oda sıcaklığı gibi) iğne çekme sonuçlarını etkileyebileceğinden, optimum ayarlar laboratuvarlar arasında farklılık gösterebilir. Ayarlar düzenli olarak yeniden test edilmeli ve kalibre edilmelidir. Çekilen iğneler RT'de birkaç ay boyunca temiz kaplarda saklanabilir.
   2. Mikroenjeksiyon solüsyonunu hazırlamak için 101.7 g NaCl, 1.56 g KCl, 2.96 g MgSO₄ x 7H₂O, 4.25 g Ca(NO₃)₂ ve 35.75 g HEPES'i 1 L çift damıtılmış (DD) suda çözerek pH 7.6'da 30x "Danieau" stok çözeltisini hazırlayın. Ayrıca, enjeksiyon karışımının görünür izleyicisi olarak kullanmak için DD suyunda% 5'te Fenol kırmızısı bir stok çözeltisi hazırlayın.
   3. 4 mL NaCl (5 M), 680 μL KCl (1 M), 1.32 mL CaCl₂ x 2H_2O(1 M) ve 1.32 mL MgS04 (1 M) seyrelterek embriyo büyümesi için E3 orta çözeltisini hazırlayın.
   4. İstenen ilaçların (bu örnekte: MEK inhibitörü [MEKi] PD032590) stok çözeltileri olarak ürün veri sayfasına ve çözünürlüğe göre stok çözeltileri hazırlayın (5 mg'ı 1.036 mL DMSO'da çözerek tercih edilen MEKi'nin 10 mM'si). İyice karıştırın ve kullanana kadar -80 ° C'de saklamak için küçük alikotlar oluşturun.
      NOT: DMSO, hem polar hem de polar olmayan bileşikleri çözmek için kullanılan yaygın bir çözücüdür ve suyun yanı sıra çok çeşitli organik çözücülerde çözünürlük gösterir.
   5. Artemia salina kistlerinin kuluçka solüsyonunda (daha önce ters ozmoz suyunda çözülmüş 30 g/L okyanus tuzu içinde 2 g/L Artemia salina kisti) 28-30 °C'de en az 18 saat boyunca yumurtadan çıkmasına izin vererek canlı bir salamura karides süspansiyonu hazırlayın ve sürekli havalandırma sağlayın.
      NOT: Kültür koşulları ve kuluçka süresi, tesis çevre koşullarından ve kist lotlarından etkilenebilir ve düzenli olarak yeniden test edilmeli ve gerekirse yeniden ayarlanmalıdır.
4. Tg[ef1α:ERK biosensor-nes] (Genç) balıklar için üreme çiftlerinin hazırlanması (3. Gün)
   1. Çiftleşme günü, yetişkin çiftleri onaylı hayvan tesisi protokolüne göre düzenli olarak besleyin.
      1. Yumurtadan çıkmamış veya boş kistleri farklı filtre boyutlarına sahip iki süzgeç ile süzerek yumurtadan çıkmış salamura karides içeren kültürü temizleyin (filtre aşaması I: 180 μm, filtre aşaması II: 112 μm).
      2. Filtrelenmiş salamura karidesleri 200 mL ters ozmoz suyunda toplayın ve yıkayın ve 10-15 yetişkin balığı yaklaşık 5-10 mL salamura karides çözeltisi ile besleyin.
         NOT: Yumurtadan çıkmış salamura karides çözeltisinin kalitesini canlılıklarına, hareketliliklerine, boyutlarına ve renklerine bakarak kontrol edin ve balıklar için sindirilemeyen ve balık gastrointestinal sistemine zarar verebilecek yumurtadan çıkmamış veya boş kistleri çıkardığınızdan emin olun. Damızlık çiftler için, gıda sindirimine izin vermek ve yüksek su kalitesi seviyelerini korumak için üreme tankında çiftleri izole etmeden en az 3 saat önce günün son öğününün verilmesi tercih edilir.
   2. Sıkıntıyı en aza indirmek ve gamet gelişimine izin vermek için (en azından) önceki 2 hafta içinde çiftleşmek için eşleştirilmemiş balık çiftlerini seçin. Seçilen yetişkin Genç balık çiftlerini (normalde bu bileşimle: 1 ♂: 2 ♀ ) uygun üreme tanklarında iklimlendirin. Ertesi sabaha kadar bir tank bölücü kullanarak dişileri erkeklerden ayırın. 14/10 saatlik standart bir aydınlık/karanlık döngüsü sağlayın.
      NOT: Grup haçları da düzenlenebilir. Bununla birlikte, bu durumda, yumurtlama farklı zamanlarda gerçekleşebilir ve aynı aşamada embriyoların karışık kavramalardan seçilmesi daha zor hale gelir. Karanlıktan aydınlığa geçiş, başarılı çiftleşme için kritik öneme sahiptir.
5. WT ve mutant mRNA'ların embriyo toplanması ve mikroenjeksiyonu (4. Gün)
   1. Tesiste ışık yanar yanmaz, erkek ve dişileri ayıran tank bölücüyü çıkarın ve gerekirse tank suyunun yaklaşık %20'sini devridaim su ürünleri yetiştiricilik sisteminden gelen taze su ile değiştirin, böylece balıkların salgıladığı hormonları aşırı seyreltmeden su kalitesini yüksek tutun.
   2. Balıkları rahatsız etmeyin ve yumurtlama için düzenli olarak kontrol edin (genellikle günün ilk 30 dakikası ila 1 saatinde). Yumurtalar (2-3 mm) serilir ve tankın dibine düşer, yetişkinlerin yiyemeyeceği şekilde bir ızgara ile ayrılır. Başarılı bir şekilde yetiştirilen yetişkinleri izole edin ve yumurtaları içeren tank suyunu yumurtaları tutmak için standart bir süzgeçten (çay süzgeci gibi) süzün.
      NOT: Aynı balığı başka bir çiftleşme turu için üreme tankına geri koymak veya balığı çiftleşme çiftini, tarihini ve performansını kaydederek orijinal muhafaza tanklarına geri koymak mümkündür.
   3. Toplanan embriyoları taze E3 besiyeri ile yıkayın ve bir Pasteur pipeti kullanarak döllenmemiş, dejenere olmuş yumurtaları, dışkıları ve diğer kalıntıları çiftlerden temizleyin.
      NOT: Embriyo aşırı popülasyonunu önlemek için 90 mm çapındaki Petri kabında ~ n = 100 döllenmiş Genç yumurta toplayın.
   4. Mikroenjeksiyon sırasında yumurtaları içermesi ve kısıtlaması gereken uygun şeritler oluşturmak için E3 ortamında% 2 agarozun kalıplanmasıyla elde edilen özel bir mikroenjeksiyon plakasında döllenmiş Genç yumurtaları düzenleyin ve hizalayın.
      NOT: Bu amaçla ısmarlama veya ticari kalıplar kullanılabilir.
   5. Mutant embriyolar oluşturmak için aşağıdaki gibi taze mikroenjeksiyon karışımı hazırlayın: 30-60 pg kapaklı ve poliadenillenmiş mRNA (burada shp2), 20 μL'lik bir nihai hacim için 0.3x Danieau çözeltisi (stok çözeltisinden seyreltilmiş) içinde çözülür. Mikroenjeksiyon izleyici olarak 0.2 μL (% 0.05) Fenol Kırmızısı stok çözeltisi ekleyin.
   6. Bir mikro yükleyici pipet kullanarak iğneyi 2 μL enjeksiyon malzemesiyle geri yükleyin. Solüsyonu, ticari olarak temin edilebilen bir basınçlı mikroenjeksiyon cihazı kullanarak genç zebra balığı embriyolarının tek hücreli aşamasına enjekte edin, her enjeksiyonu iğne ve embriyo kalitesine göre kalibre etmek için basınç ve zaman ayarlarını manuel olarak ayarlayın. Literatürde bulunan standart zebra balığı mikroenjeksiyon protokollerine bakın^11,12.
   7. Optimum gelişim için mikroenjekte edilmiş Genç embriyoları kontrollü yetiştirme koşullarında (sıcaklık: 28 °C, nem: %70, aydınlık/karanlık döngü: 14/10 saat) yükseltin ve biriktirmeden sonraki 3 saat içinde bulanık veya dejenere olmuş görünen yumurtaları temizleyin.
   8. Döllenmeden ~ 4 saat sonra (hpf), uygun lamba ve filtre ayarlarına (465-500 nm) sahip standart bir floresan stereomikroskop kullanarak embriyoları floresan (raportör ifadesi) için tarayın. FRET görüntüleme için genç pozitif balıkları ve immünohistokimyasal (IHC) değerlendirmeler için negatif kardeşleri kullanın (aşağıya bakınız).
      NOT: Tol2 bazlı transgenlerin¹³ ekspresyonundaki bilinen değişkenlik göz önüne alındığında, embriyolar değişken seviyelerde Teen floresan gösterebilir. Bir parti içindeki floresanstaki bireyler arası değişkenliği kontrol etmek için enjekte edilmemiş kardeşlerin incelenmesi ve FRET görüntülemenin düşük dinamik aralığı göz önüne alındığında, son derece düşük bazal floresan seviyelerine sahip embriyoların atılması önerilir.
6. Zebra balığı embriyolarının MEK inhibitörü (MEKi) ile tedavisi (4. Gün)
   1. 1 μL 10 mM stok çözeltisini E3 ortamı ile 9 μL ile seyrelterek bir MEKi PD0325901 (1 mM) ara çözeltisi hazırlayın. Nihai düşük doz çözeltilerini elde etmek için ara çözeltiyi kullanın. 1 mM ara çözeltinin 0,75 μL'sini 2,25 μL E3 ortamı ile karıştırarak toplam 3 mL hacimde düşük dozda (0,25 μM) MEKi PD0325901 hazırlayın. Kontrol (Ctrl) çözeltisini elde etmek için 0.75 μL% 10 DMSO'yu 2.25 mL E3 ortamı ile seyreltin.
   2. Eşit sayıdaki embriyo havuzlarını 6 oyuklu bir plakanın farklı oyuklarına yerleştirin ve banyoya daldırarak tedaviye başlayın: her kuyucuk için, E3 ortamını E3 ortamı içeren araç kontrolü (% 0.0025 DMSO) veya istenen konsantrasyonda seyreltilmiş ilaçlar (0.25 μM,% 0.0025 DMSO) ile değiştirin. Kuyucuk başına 3 mL ilaç çözeltisi kullanın.
      NOT: Taşıyıcının (DMSO) değişen konsantrasyonlarının neden olduğu herhangi bir etkiyi ortadan kaldırmak için, hem kontrol hem de tedavi çözeltilerinin aynı nihai DMSO konsantrasyonuna sahip olmasını sağlamak önemlidir.
   3. Tedavi edilen embriyoları, takip testleri için istenen gelişim aşamasına kadar toplamadan önce 28 ° C'de tutun (burada: morfometrik analiz ve IHC doğrulaması).

2. Gastrula aşamasında RASopati zebra balığı modellerinin canlı multispektral FRET görüntülemesi ve veri analizi

1. Canlı görüntüleme için gastrulaların montajı (4. Gün) (Şekil 2A)
   1. % 1.5 LMA / E3 yapmak için 1.5 g düşük erime noktalı agarozu (LMA) 1x PBS'de çözerek canlı embriyolar için montaj ortamı hazırlayın.
      NOT: Gelişim aşamasına ve balığı dizginlemek için özel ihtiyaca bağlı olarak agaroz konsantrasyonunu %0,8 ila %1,5 arasında seçin. Taze yapılmış LMA çözeltisini istenen formatta alikotlarda dağıtın ve LMA'yı RT'de polimerize halde saklayın (birkaç ay boyunca stabil). Bu, bakteri ve mantar kontaminasyonunu en aza indirir, ancak kullanmadan önce LMA alikotunun kalitesini düzenli olarak kontrol edin.
   2. Numune montajından önce, %1.5 LMA alikotunu 50 °C'de bir termomikser veya steril su banyosunda eritin. Çözündükten sonra, termomikserin sıcaklığını yaklaşık 30 °C'ye düşürün.
   3. Canlı görüntüleme için 35 mm çapında bir cam alt çanağın ortasına enjekte edilen tek bir Teen⁺ embriyosunu (burada Shp^D61G ifade eden bir gastrula) yerleştirin ve ince bir saç teli kullanarak yönlendirin. Fazla E3 ortamını çıkarın ve üstüne bir damla LMA koyarak ve RT'de polimerize olmaya bırakarak embriyoyu hareketsiz hale getirin.
      NOT: Polimerizasyon işleminin başlangıcında, balık istenen pozisyona yönlendirilebilir. Doku hasarını önlemek için LMA'nın 35 °C'den yüksek olmayan bir sıcaklıkta kullanılması kesinlikle tavsiye edilir.
2. Gastrulaların mikroskopi parametrelerinin ayarlanması ve multispektral FRET görüntülemesinin yapılması (4. gün) (Şekil 2B)
   NOT: Protokol, FRET görüntülemeyi gerçekleştirmek için gerekli tüm donanım ve yazılımla donatılmış herhangi bir konfokal mikroskopi platformunun kullanımı için geçerlidir. Burada, 458-476-488-496-514 nm dalga boyu çizgilerine sahip bir argon-iyon lazer ile donatılmış konfokal mikroskop, uyarma ve emisyon ışığını ayıran programlanabilir bir akusto-optik ışın ayırıcı (AOBS), iki spektral Hibrit (HyD) dedektör ve numunelerin canlı görüntülenmesi sırasında sabit sıcaklık (28 ° C'de) ve nem koşullarını korumak için bir aşama inkübatörü.
   Tarif edildiği gibi canlı multispektral FRET görüntüleme protokolü, Fasano ve ark. tarafından gösterildiği gibi, erken gastrulaların ötesinde farklı gelişim aşamalarındaki embriyolara uygulanabilir.⁷. Daha sonraki gelişim aşamaları için daha büyük bir z-yığını (örneğin, 24 hpf) ve spektral FRET görüntü elde etme sırasında çok spektral algılama adımlarına izin vermek için uygun z ve t aralıklarının ayarları düşünülmelidir.
   1. Alıma başlamadan en az 1 saat önce inkübatör kontrol cihazını açın ve zebra balığı embriyolarını sağlıklı bir durumda tutmak için sıcaklığı 28 °C'ye ayarlayın. Kuluçka makinesi sıcaklığı stabilize olduktan sonra, embriyo ile birlikte görüntüleme kabını numune tutucuya yerleştirin ve numuneyi hızlı bir şekilde görselleştirmek için 10x/kuru bir objektif (0,4'lük sayısal açıklık) kullanın.
   2. Başvurulan yazılımın Lazer Yapılandırmasında, argon-iyon lazeri açın ve lazer gücünü %50'ye ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın. Donanım Ayarları'nda, görüntülerin alınacağı 8 bit derinlik çözünürlüğünü seçin.
   3. Edinme panelinde spektral algılama XYλZ tarama modunu seçin ve aşağıdaki çekim parametrelerini ayarlayın: format görüntüsü: 512 x 512 piksel; 400 Hz tarama hızı; 0.75 optik yakınlaştırma.
   4. Argon-iyon lazerin 458 nm lazer çizgisini etkinleştirin ve yoğunluk değerini normalde %<10 (burada %8,5) olarak ayarlayın.
   5. Bir HyD dedektörü seçin ve istenen değeri girerek (burada 500) dedektörün hassasiyetini (kazanç) ayarlayın.
      NOT: Canlı, zayıf floresan numuneler için ve daha az arka plan gürültüsü biriktirmek için Fotoçoğaltıcı Tüpler (PMT'ler) yerine hibrit dedektörlerin kullanılması tavsiye edilir.
      Atıfta bulunulan yazılımda, bir boyanın emisyon spektrumunun görüntülenmesi, bir dedektörün etkinleştirilmesini gerektirir.
   6. Başlamak için ilk dedektörü (HyD) etkinleştirin ve emisyon eğrisini görüntülemek için camgöbeği floresan proteinini (CFP) seçin. CFP emisyon eğrisi seçim listesini açmak için yazılımın dedektör çubuğunun açılır menüsünü açın. Şimdi, ikinci boya sarı floresan proteininin (YFP) emisyon eğrisini görüntülemek için ikinci bir dedektörü etkinleştirin. Ypet emisyon eğrisini de görüntülemek için ikinci bir dedektörü etkinleştirin, ardından ikinci dedektörü kapattıktan sonra spektrum görüntüsünde görünecek olan YFP emisyon eğrisini seçin.
      NOT: Bu adım tamamlandıktan sonra, spektral edinim modunda yalnızca bir dedektör kullanıldığından, ikinci dedektör devre dışı bırakılmalıdır.
   7. Canlı alımları başlatmak için, numuneyi görselleştirmek, z-stack LAS X penceresinde numune kalınlığının başlangıç ve bitiş konumlarına karar vermek ve ayarlamak için algılama imlecini en yoğun sinyal emisyonu aralığına (bu durumda YFP'ninki) getirin.
   8. λ-tarama aralığı özellikleri için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: algılama aralığının başlangıcı (460 nm) ve sonu (570 nm); Algılama Bandı Genişliği: 5 nm; λ-tarama Adım boyutu: 5 nm. z-stack alımını başlatın.
      NOT: Belirtilen parametreler, kullanıcıların kabul edilebilir çözünürlükte nispeten hızlı bir görüntüleme elde etmelerini sağlar, ancak farklı ayarlar kullanılabilir. Florlaştırıcı Disk Ayarları'nda, tek yoğunluk kaybını önlemek için otomatik olarak eklenen Çentik filtresinin seçimi kaldırılabilir.
   9. MEKi'ye maruz kaldıktan sonra gerçek zamanlı sinyal değişikliklerini değerlendirmek için, tek bir mutant embriyoyu (burada Shp2^D61G) bir cam tabağa monte edin ve ilaç tedavisinden önce ve sonra görüntü alın. Bu canlı deneyler için, çözünmüş ilacı içeren solüsyondan en fazla 2 mL ile görüntüleme seansı sırasında banyoya daldırma yoluyla doğrudan ilaç tedavisi gerçekleştirin.
3. Oransal FRET görüntüleri elde etmek için görüntü işleme ve multispektral boya ayırma (Gün 5) (Şekil 2C)
   1. Verici (CFP) ve alıcı (Ypet) emisyonunu ayırmak için, her iki molekülün FRET kanalındaki spektral kanama (SBT) adı verilen floresan emisyonunun katkısını ortadan kaldırdığınızdan emin olun.
      1. Standart bir CFP emisyon spektrumuna (uyarma ve emisyon spektrumları) göre .cvs dosyasını görüntülemek ve indirmek için genel kullanıma açık boya/floresan proteinleri veritabanlarına bakın.
      2. .cvs dosyasının Veri panelinde , Metinden sütunlara seçeneğini belirleyin ve sınırlayıcı olarak virgül kullanarak verileri sütunlara bölün. Ortaya çıkan dosya, kaldırılması gereken ek bilgileri (örneğin, CFP uyarımı, CFP 2P) içerecektir. Yalnızca dalga boyu ve emisyona göre sütun verilerini koruyun.
      3. CFP emisyon sütununda, 501 nm'den itibaren tüm yoğunluk verilerini kaldırın.
      4. Uyarlanmış CFP emisyon spektrumu dosyasını 460 ila 500 nm arasında .xls formatında kaydedin ( Şekil 2C'de "eCFP modifiye" olarak adlandırılır).
      5. YFP protein emisyon spektrumunu indirmek ve işlemek için aynı prosedürü tekrarlayın ve yalnızca dalga boyu ve emisyona göre sütun verilerini saklayın. 524 nm'ye kadar tüm emisyon değerlerini kaldırın. Uyarlanmış YFP emisyon spektrumu dosyasını 525 ila 650 nm in.xls formatında kaydedin ( Şekil 2C'de "525 nm'den Ypet" olarak adlandırılır).
      6. Yazılımın Yapılandırma penceresinde bulunan boya veritabanında spektral sızıntının (SBT) hariç tutulmasına izin vermek için, CFP ve YFP için uyarlanmış iki referans emisyon spektrumu ekleyin ve kaydedin.
   2. Görüntüleme oturumundan elde edilen spektral görüntü dosyasını seçin, İşlem penceresini açın ve Boya Ayırma aracında Spektral Boya Ayrımı'nı seçin. Boya ayrımı ayarlarını aşağıdaki gibi yapılandırın: iletişim kutusunun sol tarafındaki açılır listelerde, ilk konumda yeni CFP emisyon spektrumunu (eCFP modifiyeli) ve spektrum veritabanından yeni YFP emisyon spektrumunu (525 nm'den Ypet) seçin.
   3. Yeniden Ölçeklendir altında, kanalları ayrı ayrı ölçeklendirmek için Kanal Başına'yı seçin, ardından görüntülerin λ taramasında en yüksek sinyal yoğunluğuna sahip olanı seçin (FRET kanal emisyon zirvesi seviyesindeki spektral taramanın 14. adımına karşılık gelir, Şekil 2B'nin sağındaki algılama adımlarını gösteren panelde beyaz okla gösterilir)). Ardından, numunenin Z taraması boyunca ilerleyin ve kenar boşluğu bölgesinde ilgilenilen alanı vurgulayan optik bölümü seçin.
   4. En iyi spektruma sahip alanı tanımlamak için hayvan direğinin kenar bölgesindeki ROI seçim modunu kullanın. Artı işaretini çağırmak ve Ölçümler Alanına 40 voksel değerini girerek referans ROI'nin boyutunu ayarlamak için ekran penceresinin üst kısmında belirtilen ROICrosshair'e tıklayın. ROICrosshair'in ilgi alanını tam olarak tanımlayın. Görüntü diyagramında veri normalleştirmeyi seçin, ardından yapılandırılan ayarlarla boya ayrımını gerçekleştirmek için Uygula'ya tıklayın.
   5. İki kanal ayrılmış olarak elde edilen bu yeni oluşturulan dosyayı açın ve veri görselleştirme için üç boyutlu görüntü serisinden (maksimum yoğunluk projeksiyonu) iki boyutlu bir projeksiyon görüntüsü oluşturun.
   6. İşlem penceresinde, kanalları CH1 ve CH2 (veya FRET) kanalları olmak üzere iki ayrı dosyaya ayırmak için Kırp'ı seçin.
   7. İşlem penceresinde Görüntüleri Birleştir'i seçin, CH2 dosyasını seçin ve ilk seçeneğe ekleyin ve ardından CH1 dosyasını seçin ve ikinci seçeneğe ekleyin. Faktör 5 ile bir yeniden ölçeklendirme ayarlayın ve Oran işlemini seçin. Ardından, oransal görüntüyü (YFP/CFP) içeren yeni dosyayı oluşturmak için Uygula'ya tıklayın. Takip veri analizi için dosyayı kaydedin.
4. FRET sinyallerinin kantitatif analizi ve görüntü oluşturma (5-6. Gün) (Şekil 2D)
   1. FRET / CFP oranlı görüntülerden FRET sinyallerinin kantitatif ölçümleri için, beklenen etkiye dayalı a priori istatistiksel değerlendirmeye bağlı olarak deneyi N>2 embriyoları (kopyalar) üzerinde gerçekleştirin. Açık kaynaklı yazılım Fiji gibi bir görüntü işleme paketi kullanın. Spektral görüntüleme ve boya ayırma işlemlerinden elde edilen görüntü dosyalarını açık kaynaklı Fiji gibi bir görüntü analiz paketine aktarın.
   2. Gastrola görüntülerinde ROI seçimine başlamadan önce, Analiz işlevini kullanarak parametreleri okuma ölçümleri olarak ayarlayın | Set Ölçümleri | Alan, Entegre yoğunluk ve Ortalama gri değer gibi ilgilenilen parametreleri seçin.
   3. Araç çubuğundan poligon seçim aracını kullanarak ilgilendiğiniz bölgeyi (bu özel çalışmada: gastrula kenarı) seçin. Analiz Et'e tıklayarak ROI x,y özelliklerini kaydedin | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi.
   4. Seçilen bir ROI'de ölçüm yapmak için Analiz Et | Ölçün. Her bir yatırım getirisi ve görüntü/koşul için bu adımları tekrarlayın.
      NOT: Gerekirse, görüntüyü farklı şekilde kaydedin. TIFF biçimi. Birden fazla görüntüden elde edilen tüm ROI ölçümlerini tek bir ROI dosyası olarak kaydetmek mümkündür. ROI yöneticisi listesindeki her bir ölçüyü, her bir örneğe/görüntüye göre doğru adla yeniden adlandırın.
   5. Her koşul için (mutant ve mutant + burada tedavi), elde edilen her seçilen ROI için FRET/CFP oranının tüm değerlerini çıkarın ve bunları, örneğin deneyler gruplarını sütunlarda ve her ham değeri satırlarda düzenleyerek bir çalışma sayfasında düzenleyin.
   6. Farklı deneysel koşullar arasında FRET sinyallerinin istatistiksel farklılıklarını değerlendirmek ve grafik oluşturma ve veri görselleştirme için uygun herhangi bir yazılımı kullanın.
      NOT: Veri analizi ve grafik çözümleri için açık kaynaklı ve lisanslı yazılımlar mevcuttur.
   7. Tüm ham ölçümleri ve her deneysel koşul için tekrar sayısını göz önünde bulundurarak istatistiksel değerlendirme için özel bir proje düzenleyin. Tek bir biyolojik kopyanın istatistiksel analizi için, her grubun bir sütun tarafından tanımlandığı bir gruplandırma değişkenine sahip bir sütun tablosu oluşturun. Birden fazla biyolojik kopyanın istatistiksel analizi için, biri sütunlarla tanımlanan (örneğin, deneysel koşullar) ve diğeri satırlarla tanımlanan (örneğin, kopyaların ortalama değerleri) en az iki gruplandırma değişkenine sahip gruplandırılmış tablolar oluşturun.
   8. Çalışma sayfasındaki deney gruplarını uygun şekilde düzenledikten sonra, veri dağılımını değerlendirin (Normallik testi, örneğin, D'Agostino-Pearson, Anderson-Darling) ve sonuca göre en uygun istatistiksel testi seçin.
      1. Parametrik veriler için Tek Yönlü ANOVA (Gauss dağılımını takiben) ve parametrik olmayan veriler için Kruskal-Wallis testi gerçekleştirin. Daha fazla faktör varsa (genetik ve ilaç konsantrasyonları), İki Yönlü ANOVA'yı düşünün. Her koşul için ortalama FRET değerini birbiriyle karşılaştırın (çoklu karşılaştırmalar) ve bir post hoc test kullanarak çoklu karşılaştırmalar için düzeltin (örneğin, sırasıyla parametrik ve parametrik olmayan veriler için Tukey testi ve Dunn'ın).

3. FRET sonuçlarının IHC validasyonu ve gastrulasyon defektlerinin korelasyonel morfometrik analizi

1. tERK ve pERK'ye karşı IHC için solüsyonların hazırlanması ve embriyo fiksasyonu ve montajı (7. Gün) (Şekil 3A)
   1. IHC için gerekli çalışma çözümlerini hazırlamak.
      1. 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g_Na2HPO4ve 2.4 g KH₂PO_4'ü 1 L DD suda çözerek 10x PBS'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Steril tutmak için çözeltiyi otoklavlayın.
      2. 8 mL% 10 Triton X-100'ü 100 mL 1x PBS'lik bir son hacimde çözerek% 0.8'lik bir PBS-Triton (PBSTr) çözeltisi hazırlayın.
      3. Sırasıyla 3 mL, 7.5 mL ve 12 mL %100 gliserol seyrelterek %20, %50 ve %80 gliserol çözeltilerini 15 mL 1x PBS'lik bir son hacimde hazırlayın.
   2. Daha önce 10 mL 1x PBS'lik bir nihai hacimde çözülmüş 250 μL %10 Triton X-100 içinde 2.5 mL %16 PFA'yı karıştırarak %4 paraformaldehit (PFA)/%0.25 PBSTr (fiksatif çözelti) hazırlayın. Embriyoları gece boyunca 4 ° C'de 6 hpf'de sabitlemek için bu çözümü kullanın. Etkili fiksasyon ve yıkamaya izin vermek için 2 mL tüp ve tüp başına en fazla beş embriyo kullanın.
      NOT: Her fiksasyon turu için yeni fiksatif hazırlanması tavsiye edilir. DİKKAT: Formaldehiti %16 oranında tutarken, Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) giyin ve kimyasal bir başlık altına alın.
   3. Tüpleri birkaç kez 1.5 mL% 0.8 PBSTr ile doldurarak 2 mL'lik tüplerdeki embriyoları yıkayın. Embriyoları yeni 2 mL'lik tüplere aktarın ve embriyoları kullanılana kadar 1x PBS'de saklayın.
      NOT: Erken zebra balığı embriyolarının işlenmesine aşina değilseniz, pipetleme sırasında embriyo kaybını önlemek için stereomikroskop altında çalışın. Embriyoların tüp duvarına olası yapışkanlığını azaltmak için "düşük bağlayıcı" plastik kaplar kullanın.
2. pERK ve tERK'e karşı doku geçirgenliği ve İHK (7-9. gün)
   NOT: IHC sonuçları, laboratuvarlar arasında farklılık gösterebilen birden fazla değişkene bağlıdır ve protokollerin özel optimizasyonu gerekli olabilir.
   1. Sabit zebra balığı embriyolarını RT'de 3 x 10 dakika boyunca 1 mL% 0.8 PBSTr'de yıkayın.
   2. Numuneleri, RT'de 2 dakika boyunca% 0.8 PBSTr (1: 1.000) içinde seyreltilmiş 2 μL Proteinaz K ile geçirgen hale getirin.
   3. Numuneleri 3 x 10 dakika boyunca 1 mL% 0.8 PBSTr'de yıkayarak dokunun geçirgenliğini durdurun ve numuneleri RT'de 20 dakika boyunca 500 μL% 4 PFA / 1x PBS'de sabitleyin. Ardından, numuneleri 1 mL% 0.8 PBSTr'de 3 x 10 dakika yıkayın.
      NOT: Doku geçirgenliği için kullanılan yöntem ve süre, antijen tipi, doku koruma kalitesi ve çevresel faktörlerden etkilenebilecek kritik adımlardır. Değerli numunelere uygulamadan önce protokolü optimize edin.
   4. Numuneleri% 5 normal keçi serumu (NGS),% 1 Sığır Serum Albümini (BSA),% 1 DMSO içeren 1x bloke edici tampon (BB) ile inkübe edin, aşağıdaki gibi hazırlanın: 75 μL %100 NGS, 150 μL %10 BSA ve 15 μL %100 DMSO, 1.5 mL %0.8 PBSTr nihai hacimde. Tüp başına 200 μL çözelti kullanın ve embriyoları çözelti içinde RT'de 20-30 dakika inkübe edin.
   5. Önceki adımdan 1x BB'yi çıkarın ve numuneleri, istenen primer antikorların bir karışımını içeren bir çözelti içinde inkübe edin (burada: 1 μL primer fare monoklonal antikoru p44/42 MAPK, toplam ERK, tERK, + 1 μL tavşan poliklonal fosfo-p44/42 MAPK, fosforile ERK, pERK) 250 μL taze hazırlanmış 1x BB çözeltisi içinde. Tüp başına 200 μL çözelti kullanın ve çözeltideki embriyoları gece boyunca 20 ° C'de inkübe edin.
   6. Spesifik olmayan bağlanmayı ortadan kaldırmak için, numuneleri 1 mL% 0.8 PBSTr ile birkaç kez yıkayın (önce her 10 dakikada bir ve sonra her 30 dakikada bir yıkayın).
   7. Numuneleri taze hazırlanmış 1x BB'de RT'de 20 dakika inkübe edin. Tüp başına 200 μL kullanın.
   8. 1x BB'yi önceki adımdan çıkarın ve numuneleri ikincil antikorların bir karışımı ile inkübe edin (1 μL floresan 488 konjuge keçi anti-fare, + 1 μL floresan konjuge 633 keçi anti-tavşan 600 μL 1x BB çözeltisi). Embriyoları gece boyunca 20 ° C'de hafifçe sallayın.
      NOT: FRET görüntüleme için kullanılan aynı partiden negatif (transgenik olmayan) Genç balıklara IHC uyguladık. Alternatif olarak, Teen⁺ balıkları da kullanılabilir, ancak bu durumda, bunun yerine CFP veya YFP'nin emisyon spektrumları ile örtüşmeyen floroforlara konjuge edilmiş ikincil antikorlar kullanılmalıdır.
   9. Yukarıda açıklandığı gibi spesifik olmayan bağlamayı ortadan kaldırın.
   10. Numuneleri RT'de her çözelti başına 15 dakika boyunca gliserol / 1x PBS çözeltileri (% 20,% 50,% 80) gradyanında yıkayın. Numuneleri 4 ° C'de% 90 gliserol / 1x PBS'de saklayın.
       NOT: Olası floresan bozulmasını en aza indirmek için, numuneleri karanlıkta saklayın.
3. İmmün lekeli dokunun konfokal mikroskobu ve kantitatif analiz (10-11. günler) (Şekil 3B-E)
   1. Embriyoları daha önce tarif edildiği gibi monte edin.
   2. Konfokal mikroskopi toplama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın:% 80'de beyaz lazer, floresan konjuge keçi anti-fare için 507 - 551 nm'de floresan emisyon aralığı (bu durumda tERK için kullanılan 488 nm emisyon spektrumu ile), floresan konjuge keçi tavşan önleyici için 644 - 740 nm (bu durumda pERK için kullanılan 633 nm emisyon spektrumu ile). Sıralı çekim modunu, 512 x 512 piksellik bir format taramasını ve 400 Hz'lik bir hızı seçin. 4 - 5 μm z adımlı boyut kalınlığı ve 1 standart dijital yakınlaştırma ile taramanın başlangıcını ve sonunu tanımlayın. Tüm gastrula'yı 6 hpf'de elde etmek için suya daldırma 25x objektif (0,05 sayısal açıklık ile) kullanın
      DİKKAT: Bu protokol, zararlı olabilecek lazerlerin uygulanmasını içerir; Bu nedenle, belirli ulusal gerekliliklere göre personel eğitimi gerektirir.
   3. Konfokal görüntü alımından sonra, açık kaynaklı yazılım Fiji gibi bir görüntü işleme paketi kullanılarak elde edilen ham görüntü dosyasını inceleyin.
      1. Fiji'de, tek bir kanal görüntüsü elde etmek için Görüntü menüsünden ve Renk alt menüsünden Kanalları ayır komutunu kullanın (toplam ERK: kanal = 0, C = 0; pERK: kanal =1, C = 1) ve her iki kanal için maksimum yoğunlukta bir z-projeksiyon görüntüsü oluşturun Görüntü | Yığınlar | Z Projesi.
      2. ROI yoğunluk ölçümleri için prosedürü daha önce açıklandığı gibi tekrarlayın ve verileri bir çalışma sayfasına çıkarın.
      3. Deney grupları arasında istenen ROI'deki p-ERK sinyal yoğunluğu değişikliklerini çıkarmak için, p-ERK boyamanın ham entegre yoğunluk değerlerini t-ERK sinyalinin ham entegre yoğunluğuna bölerek p-ERK/t-ERK oranını hesaplayın. Adım 2.4'teki gibi istatistiksel anlamlılık değerlendirmesine devam edin.
         NOT: Görüntüleme parametrelerinin ayarları, özel ihtiyaçlara göre ve her bir numunenin süresi, istenen görüntü kalitesi ve elde edilecek düzlem sayısı göz önünde bulundurularak değiştirilebilir.
4. 11 hpf embriyoda eksen ölçümleri (embriyo fiksasyonu için 4. gün, veri toplama ve analizi için 12. gün) (Şekil 4A-D)
   1. Gastrulasyonun sonunda (11 hpf), embriyoları RT'de 20 dakika boyunca 1x PBS'de% 4 PFA ile sabitleyin, 1x PBS'de birkaç kez yıkayın ve görüntü elde edilene kadar 4 ° C'de saklayın.
   2. Embriyoları, taze 1x PBS içeren 12 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğunda bir Pasteur pipeti kullanarak yanal olarak yönlendirin.
   3. Oval bir şeklin (Y/X embriyo eksenleri oranı > 1), zebra balıklarında karakteristik bir Razopati fenotipinin varlığını ve tedavi etkinliğinin bir sonucu olarak embriyo eksenlerinin morfolojik kurtarılmasını değerlendirmek için, 3.4x büyütme objektifine (0.63x tarama objektifi x 8.60 yakınlaştırma faktörü) sahip bir stereo mikroskop kullanarak tüm embriyoların görüntülerini elde edin.
   4. Görüntü dosyasını açık kaynaklı Fiji gibi bir görüntü analiz paketine aktarın.
      1. Araç çubuğundan düz aracı seçip Analiz Et | Ölçün. Seçilen ölçümleri gerçekleştirdikten sonra, bunları ROI yöneticisi listesine ekleyin ve ROI dosyasını yukarıdaki FRET görüntüleme analizi için açıklandığı gibi kaydedin.
         NOT: Her embriyo görüntüsü için bu adımları tekrarlayın.
   5. Verileri bir çalışma sayfasında dışa aktarmaya devam edin ve ana eksenin uzunluğunu (y) küçük eksenin uzunluğuna (x) bölerek eksen oranını hesaplayın. Farklı kopyaların ortalamasını, ortalamanın standart sapmasını veya standart hatasını hesaplayın.
   6. Adım 2.4'teki gibi istatistiksel veri analizine devam edin.

Sonuçlar

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında hızlı bir şekilde geçici RASopati modelleri oluşturmak ve yakın zamanda kurulan bir ERK zebra balığı sensörüne^6,9 uygulanan standart bir canlı FRET görüntüleme yöntemi ile erken mutantlardaki ERK dalgalanmalarını değerlendirmek için basit bir iş akışı gösterir. Aynı deneysel iş akışı içinde yakın zamanda ^6,7'de

Tartışmalar

Onlarca yıl süren araştırmalara ve şu anda haritalanmış olan oldukça heterojen RASopati formlarına yol açan sayısız mutasyona rağmen, önemi bilinmeyen genetik varyantlar, tanı konmamış hastalar üzerindeki dizileme çabalarından ortaya çıkmaya devam etmektedir. Gerçekten de, birçok durumda, yalnızca klinik özelliklere dayalı tanı zor olabilir ve dizileme sonuçlarını doğrulamak için fonksiyonel genomik yaklaşımlar çok önemli olmaya devam etmektedir. Ayr?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Mini-sub Cell GT Horiziontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1704406	Gel Elecrophoresis
PC-100 Vertical puller	Narishige	-	Needle puller
PowerPac Universal Power Supply	Bio-Rad	1645070	Gel Elecrophoresis
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Plasmid preparation
Softwares
Biorender	Biorender	CC-BY 4.0 license	Cartoon elaboration for Figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Data analyses
Fiji software	ImageJ	15.3t	Imaging rendering and quantitative analyses (FRET signals measurements, ERK fluorescence intensity in IHC assay, embryo axes lenght)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Statistical data analyses
iControl spectrophotometer software	Tecan	v. 2.0	RNA quantification
Illustrator	Adobe	26.0.3 (64-bit)	Figure assembling
LASX software	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Imaging acquisition for spectral FRET experiments and embryo imaging for axes lenght measurements
Q9 Mini 18.02-SN software	Uvitec	-	Gel image acquisition