Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

요약

RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

RASopathies는 ERK 과활성화로 인해 발생하는 유전적 증후군으로, 암으로 이어질 수 있는 다계통 질환을 유발합니다. 광범위한 유전적 이질성에도 불구하고, RAS-MAPK 경로의 주요 조절인자에서 생식세포 기능 획득 돌연변이가 대부분의 사례의 기초를 이루고 있으며, 첨단 염기서열분석 기술 덕분에 RAS-MAPK 경로에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 병원성 변이가 계속 확인되고 있습니다. 정확한 진단에 필수적인 이러한 변이체의 병원성에 대한 기능 검증에는 빠르고 신뢰할 수 있는 프로토콜이 필요하며, 가급적이면 in vivo가 필요합니다. 유아기에 효과적인 치료법이 부족하다는 점을 감안할 때, 이러한 프로토콜은 특히 비용 효율적인 동물 모델에서 확장 가능한 경우 약물 재배치/용도 변경을 위한 전임상 기반을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기에서는 실시간 다중 스펙트럼 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 이미징을 통해 제브라피시 배아에서 일시적인 RASopathy 모델의 신속한 생성과 배변화 중에 이미 발생하는 살아있는 질병 관련 ERK 활성 변화를 직접 검사하기 위한 프로토콜을 단계별로 설명합니다. 이 프로토콜은 최근에 설립되어 상용 현미경 하드웨어와 통합된 형질전환 ERK 리포터를 사용합니다. Shp2^D61G의 발현으로 얻은 Noonan syndrome(NS) 제브라피시 모델에 대한 응용 프로그램 예제를 제공합니다. 사용 가능한 저선량 MEK 억제제에 의한 약리학적 신호 변조 전후에 NS 피쉬 모델에서 ERK 신호 변화를 등록할 수 있는 간단한 방법을 설명합니다. 처리 전후에 다중 스펙트럼 획득에서 비율계량적 FRET 신호를 생성, 검색 및 평가하는 방법과 초기 단계에서 전체 배아에 대한 고전적인 면역형광을 통해 결과를 교차 검증하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 그런 다음 표준 형태 측정 매개 변수를 검사하여 수정 후 6 시간에 살아있는 FRET에 의해 ERK 활성을 평가 한 동일한 배아에서 배아 형성 장애를 나타내는 배아 모양의 늦은 변화를 쿼리하는 방법을 설명합니다.

서문

RASopathies는 정상적인 발달을 손상시키고 다양한 장기와 조직에 영향을 미치는 유전 증후군입니다. 이러한 상태는 RAS/MAK 신호전달에 관여하는 주요 유전자 및 플레이어의 생식세포 기능획득(GoF) 돌연변이에 의해 발생하는 경우가 많으며, 이로 인해 세포외 신호 조절 키나아제(ERK)의 과활성(인산화 증가)이 발생합니다. ERK는 핵 ^1,2로 전위(translocation)하여 발달 중에 중요한 몇 가지 기본 과정(조직 성장)을 조절합니다. RAS-MAPK 경로에 관여하는 유전자의 체세포 돌연변이는 암을 유발하는 가장 흔한 사건이다³. 그러므로, 놀랄 것도 없이, 암 소인은 RASopathies에서도 관찰된다. 누난 증후군(Noonan syndrome, NS)은 발달 지연, 저신장, 다양한 중증도를 가진 인지 결핍 및 심근병증을 특징으로 하며, RASopathy²의 가장 흔한 형태이다. 대부분의 경우, 이 질병은 2000년 초에 발견된 최초의 RASopathy 유전자인 PTPN11의 GoF 돌연변이에 의해 유발되며,⁴ 이 유전자는 경로의 양성 조절자 역할을 하는 단백질 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase SHP2)를 암호화합니다.

그 이후로, 진단되지 않은 환자에서 엑솜 염기서열분석 접근법이 기하급수적으로 사용됨에 따라, RAS-MAPK와 관련된 요인에 영향을 미치고 다양한 형태의 RASopathy와 관련이 있을 가능성이 있는 잠재적인 병원성 변이가 계속 발견되고 있으며 효율적인 환자의 계층화를 위한 기능적 특성화를 기다리고 있습니다². 이 목표를 달성하기 위해서는 유기체 수준에서 빠르고 유익한 기능 검증을 보장하는 실험 프로토콜이 필요합니다. 유의미성을 알 수 없는 변이체를 테스트하기 위해 고전적이고 표준화된 포유류 모델을 사용하는 것은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 투명하지 않은 대형 동물에 대한 침습적 방법이 필요합니다. 이러한 전략은 현재 관리나 치료가 없는 가난하거나 진단되지 않은 RASopathy 환자로 대표되는 사회적 부담을 감안할 때 빠른 검사에 대한 요구 사항과 분명히 양립할 수 없습니다. 전체 유기체의 주요 표현형 형질 및 분자 상관관계에 대한 정량적 평가를 위한 프로토콜은 또한 용도 변경/재배치를 통해 RASopathy 환자가 사용할 수 있는 약물의 가능한 임상 번역을 가속화하는 데 도움이 될 것입니다.

제브라피시는 초기 발달에 영향을 미치는 질병을 연구하기 위한 이상적인 척추동물 모델입니다. 우선, 제브라피시는 인간과 높은 수준의 유전적 상동성을 공유합니다. 성어의 높은 번식력은 작고 빠르게 발달하는 배아를 많이 생산하는 결과를 낳습니다. 배아는 초기 단계에서 투명하기 때문에 주요 발달 과정(epiboly, gastrulation, axes 및 body plan formation)을 표준 현미경을 사용하여 쉽게 시각화할 수 있습니다. 또한, 유전자 모델을 생성하는 고급 기술과 함께 개발 중 시공간에서 특정 세포 행동 및 동적 분자 이벤트를 추적하는 데 사용할 수 있는 형질전환 라인의 가용성은 타의 추종을 불허합니다. 또한, 제브라피시의 여러 수준(유기체에서 세포 결함에 이르기까지)에서 표현형 판독을 평가할 수 있으며, RASopathies⁵를 포함한 여러 질병에 대한 전용 분석이 이미 확립되어 있습니다. 더욱이, 적어도 수용성 화합물의 경우 초기 단계에서 약물 투여를 위한 비교적 간단한 수조 침지 방법을 통해 96웰 형식으로 생체 내에서 고처리량 약물 스크리닝이 가능합니다.

분자적 관점에서 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 면역블롯(immunoblot)과 같은 표준 접근법을 사용한 연구는 어류 배아에서 ERK 활성화와 RASopathy 관련 발달 결함 사이의 상관관계를 강력하게 입증했습니다 ^6,7. 최근 개발된 제브라피시의 EKAR형 FRET 바이오센서(Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen)는 배발생 시 ERK 활성화를 시공간적으로 해결된 방식으로 등록할 수 있는 신뢰할 수 있는 생체 내 도구를 제공합니다. 따라서 RASopathy 어류 모델에서 동적 ERK 변경 및 약리학적 조절을 더 잘 평가하는 데 유용할 수 있습니다.

Teen 센서에서 리포터의 특정 ERK 기질은 ERK 활성화 시 인산화되어 형광 CFP 공여체(D)와 형광 Ypet(개선된 YFP) 수용체(A)를 근접하게 하는 구조적 변화를 유발합니다. D 방출 스펙트럼이 A의 흡수 스펙트럼과 상당히 겹치면 FRET가 발생할 수 있습니다(D에서 A로의 에너지 흡수). 이것은 D와 A 사이의 거리에 비례하므로 Teen의 경우 ERK 활성화 상태에 비례합니다. 살아있는 샘플과 고정 샘플 모두에서 표준 또는 컨포칼 현미경의 표준 및 고급 이미징 모듈을 모두 사용하여 다양한 이미징 프로토콜을 설정할 수 있습니다. D 여기(D excitation) 시, CFP에서 YFP까지 정의된 방출 스펙트럼(λ)을 따라 멀티 스펙트럼 스캔을 획득한 후 스펙트럼 "언혼싱(unmixing)" 알고리즘을 획득하는 것은 FRET 데이터를 등록하고 정량화하는 가장 신뢰할 수 있는 방법^{중 하나입니다 8}. 생체 내 조직 역학을 기록하기 위해 살아있는 제브라피시 표본에도 적용할 수 있습니다.

이전 보고서 ^6,9 및 최근 응용 프로그램⁷에 이어, 여기에서는 Teen fish를 사용하여 gastrulation 시작 시 NS 모델의 동물 극 가장자리에 있는 세포의 ERK 활성화를 평가하고 이를 나중에 발달 중에만 볼 수 있는 특징적인 체축 결함과 연관시키는 단계별 워크플로우를 자세히 설명합니다. 사용 가능한 MEKi를 사용한 처리 전후에 살아있는 NS gastrulae에서 정량적 FRET 데이터를 얻고 검사하는 방법과 인산화(활성) ERK에 대한 표준 면역조직화학을 통해 결과를 교차 검증하거나 배아 신장 결함의 상관 형태 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다.

이 워크플로우는 RASopathies와 관련이 있는 것으로 추정되는 새로운 변이 및 질병 유전자의 기능 테스트를 강화하고 척추동물 발달 중 공간적 및 시간적 ERK 활성화 역학의 상관 관계와 배아의 형태학적 결함에 대한 통찰력을 얻기 위해 적용될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 ERK 활성화를 조절하는 역할을 하는 후보 약물의 효능을 테스트하는 데에도 사용될 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜

동물의 사육 및 번식과 관련된 모든 실험 절차는 동물 연구에서 제브라피시 사용에 대한 ARRIVE 지침에 따라 수행되었으며 이탈리아 보건부(Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF)의 승인을 받았습니다. 모든 DNA/RNA 반응 및 이미징 세션은 필요한 최종 물질 또는 테스트된 유전자 및 변이의 수에 따라 원하는 대로 확장하거나 축소할 수 있습니다.

1. 일시적인 제브라피시 RASopathy 모델의 생성 및 약물 치료

참고: RASopathy-associated variants의 발현을 모니터링하기 위해, 작은 non-fluorescent tag(예: myc 또는 이와 유사한)의 cds와 함께 프레임에서 관심 단백질의 원하는 코딩 서열(cds)을 보유하는 특정 구조체를 사용할 수 있습니다. 이러한 방식으로 돌연변이 단백질의 발현 수준은 태그에 대한 표준 웨스턴 블롯으로 평가할 수 있습니다. 관심 있는 특정 단백질에 대한 항체를 사용할 수 있는 경우 태그를 피할 수 있습니다. 면역형광은 표준 프로토콜에 따라 배아 조직 내 단백질 발현을 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이러한 유형의 대조 실험은 돌연변이 단백질 발현과 유도된 ERK 활성화 수준을 연관시키는 데 유용할 수 있습니다. 형광 태그의 사용은 현미경 검사 중 가능한 형광 방출 혼선을 고려할 때 FRET 이미징과 함께 사용하지 않는 것이 좋습니다.

1. 플라스미드 선형화(1-2일) (그림 1A)
   참고: 특정 유전자에 영향을 미치는 GoF 돌연변이로 인해 제브라피시에서 일시적인 질병 모델(여기서는 RAsopathy)을 생성할 때 빠른 접근 방식은 야생형(WT)과 관심 돌연변이 단백질을 암호화하는 mRNA를 준비한 다음 아래 단계에 따라 제브라피시 배아에 주입하는 것입니다. mRNA를 전사하기 위한 주형으로 사용되는 플라스미드는 T7, Sp6 또는 T3 중합효소 프로모터의 다운스트림 및 폴리아데닐화(polyA) 신호의 업스트림으로 복제된 관심 유전자에 대해 원하는 전체 길이 CDS(코딩 서열)를 포함해야 합니다. 사용할 수 없는 경우 첫 번째 단계는 적절한 벡터¹⁰ 에서 제브라피시 또는 인간이 원하는 CDS를 클로닝하여 생산하고 SANGER 염기서열분석으로 검증하는 것입니다. 클로닝의 경우 추가 시간(클로닝, 콜로니 스크리닝, 올바른 클론 분리 및 확장을 포함하여 평균 1주일)을 고려하십시오.
   1. 적절한 제한 효소로 플라스미드를 선형화하여 polyA 신호(여기서는 KpnI)를 한 번만 다운스트림합니다. 효율적인 플라스미드 선형화를 위해 3 γ(μg/μL)의 플라스미드 DNA, 2 μL의 제한 효소(20,000 Unit/mL) 및 10x 반응 완충액 10 μL를 뉴클레아제가 없는 물에서 100 μL의 최종 부피로 혼합합니다. 몇 차례 피펫팅하여 성분을 철저히 혼합하고 37°C에서 2-4시간 동안 반응 혼합물을 배양합니다.
   2. 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동에 의한 선형화의 결과를 확인합니다.
      1. TBE 원액 10배(트리스 48.5g, 빙초산 11.4mL, 0.5M EDTA 20mL[pH 8.0])를 뉴클레아제가 없는 물로 희석합니다.
      2. 1x TBE 용액 100mL의 최종 부피에 아가로스 1.5g을 전자레인지에 용해시켜 아가로스 겔을 준비합니다. 그런 다음 염료 젤 염색 3.5μL를 추가합니다.
      3. 조건/플라스미드의 수에 따라 적절한 크기의 챔버에 아가로스 용액을 부어 겔을 캐스팅합니다. 빗을 설정하고 젤이 굳을 때까지 약 1 시간 동안 기다립니다. 그런 다음 빗을 제거하고 중합된 겔을 전기영동에 적합한 겔 트레이에 놓습니다.
      4. 몇 μL의 분해된 플라스미드("cut")와 1.5 μL의 6x loading buffer(전기영동을 모니터링하기 위한 염료 포함)를 10 μL의 nuclease-free water의 최종 부피에 혼합합니다. 동일한 방식으로 분해되지 않은 플라스미드("uncut")와 함께 별도의 대조군 샘플도 준비합니다. 아가로스 레인에 샘플을 로드하고 첫 번째 레인에 1Kb DNA ladder를 로드합니다. 100V에서 30분 동안 DNA 전기영동을 수행합니다.
      5. 표준 UV transilluminator에서 실행으로 인한 DNA 밴드를 시각화하고 문서화합니다. "cut"과 "uncut"을 비교하는 DNA band의 패턴을 검사하여 plasmid linearization의 효율성을 확인합니다.
         참고: 충분히 선형화된 플라스미드는 하나의 날카로운 밴드로 더 빠르게 실행되어야 합니다. 전사 반응의 시작은 원형화된 플라스미드 형태의 존재로 인해 방해를 받을 수 있는 주요 제한 단계이므로 DNA 절단이 완료되었는지 확인하여 mRNA 수율이 저하될 수 있습니다.
   3. 시판되는 스핀 컬럼 기반 DNA 정제 키트를 사용하여 선형화된 플라스미드를 정제하고 필요할 때까지 정제된 DNA 준비를 -20 °C에서 보관합니다.
      참고: 선형화 대신, PCR 산물을 mRNA 전사를 위한 템플릿으로 사용할 수 있으며, 이는 중합효소 프로모터 서열 업스트림과 폴리A 신호 서열 다운스트림이 stop codon 다운스트림으로 포함하는 경우입니다. PCR 산물은 또한 진행하기 전에 아가로스 겔에서 정제하고 검사해야 합니다.
2. In vitro mRNA 전사, 정제 및 품질 관리(2-3일차) (그림 1A)
   알림: RNAse 오염 제거 용액으로 작업 영역과 피펫을 조심스럽게 청소하십시오. 뉴클레아제가 없는 물질과 시약을 사용하십시오. 장갑을 착용하십시오. 이렇게 하면 RNase 오염이 최소화되고 전체 길이 mRNA의 수율이 향상됩니다.
   in vitro mRNA transcription을 위한 표준 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 선형화된 플라스미드에서 WT 및 돌연변이 단백질을 인코딩하는 capped 및 polyadenylated mRNA를 전사합니다.
   1. 정제된 선형화된 플라스미드를 17,949 × g 에서 몇 초 동안 원심분리하여 파편이 튜브 바닥에 수집되고 전사 반응으로 전달되지 않도록 합니다.
   2. 얼음 위에 보관된 NTP와 CAP 아날로그의 혼합물을 제외한 모든 구성 요소를 실온(RT)에서 해동합니다. 사용할 때까지 중합효소를 -20°C로 유지하십시오.
   3. 시약 손실이나 우발적인 오염을 방지하기 위해 사용하기 전에 모든 시약을 17,949 × g 에서 간단히 원심분리기를 하고 10x 반응 버퍼와 즉시 사용 가능한 NTP/CAP 아날로그 혼합물이 용액에 완전히 들어갈 때까지 잠시 와류시킵니다. 10x 반응 버퍼를 RT로 유지합니다.
   4. 뉴클레아제가 없는 물로 구성된 20 μL의 최종 부피에서 10 μL의 2x NTP/CAP 아날로그 혼합물, 2 μL의 10x 반응 완충액, 2 μL의 SP6, T7 또는 T3 효소(플라스미드의 CDS 업스트림의 특정 프로모터에 따라 다름)를 포함하는 용액에 선형화 및 정제된 플라스미드 600-800 ng를 첨가하여 RT에서 전사 반응을 준비합니다. 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.
   5. thermocycler에서 37 °C에서 전사 반응을 배양합니다. 뚜껑의 온도도 37°C로 설정하고 2시간 동안 반응을 실행해야 합니다.
   6. 반응 중에 전사되지 않은 잔류 플라스미드를 제거하려면 1 μL의 표준 DNAse 용액(2 Units/μL)을 추가합니다. 몇 차례 피펫팅하여 반응을 철저히 혼합하고 37°C에서 추가로 30분 동안 배양합니다.
   7. 진행하기 전에 TBE/포름아미드 아가로스 전기영동을 통해 in vitro synthesized mRNA의 품질과 무결성을 확인합니다. 1x TBE 용액 50mL에 아가로스 1.0g을 용해시키고 37% 포름아미드 5.5mL와 염료 젤 염색 3.5μL를 넣고 혼합하고 위에서 설명한 대로 겔을 캐스팅합니다.
      주의: 포름아미드를 취급할 때는 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 화학 물질 후드를 사용하십시오.
   8. 전사된 mRNA 1 μL와 2.5 μL의 2x Formamide Dye Loading Buffer를 뉴클레아제가 없는 물에 총 5 μL 부피로 혼합합니다. 몇 차례 피펫팅하여 성분을 철저히 혼합하고 gel lane에 샘플을 로드합니다. 예냉각된 1x TBE 버퍼에서 100mV로 10-15분 동안 젤을 실행합니다. 1kb DNA 및/또는 RNA Ladder도 실행합니다.
   9. 선택 사항: 70°C에서 10분 동안 래더와 mRNA를 변성시킵니다.
   10. 생성된 mRNA band를 표준 UV transilluminator에서 시각화하고 문서화합니다.
       참고: 장시간 실행과 고온은 RNA 분해 가능성을 높입니다.
   11. 합성된 capped RNA의 무결성과 크기가 최적인 경우, 반응에 다음을 추가하여 C-말단의 폴리아데닐화를 진행합니다: 뉴클레아제가 없는 물 36 μL, 5x 변성 로딩 버퍼 20 μL, 25 mM MnCl₂ 10 μL, 10 mM ATP 10 μL 및 폴리아데닐화 효소 4 μL(예: 정제된 대 장균 폴리(A) 중합효소). 몇 차례 피펫팅하여 반응을 철저히 혼합하고 최종 반응의 100 μL를 37 °C에서 추가로 1 시간 동안 배양합니다.
       참고: RNA가 polyA 꼬리로 인해 번진 것처럼 보이기 때문에 polyA 반응 후 겔 전기영동을 통해 RNA 품질을 확인하는 것은 바람직하지 않습니다.
   12. LiCl과 같은 적절한 염을 사용하여 합성된 capped 및 polyadenylated mRNA를 침전시키고 회수합니다. 간단히 말해서, 동일한 부피의 뉴클레아제가 없는 물과 표준 2.5M LiCl 용액(30μL)을 혼합하고 -20°C에서 >30분 동안 배양합니다.
       참고: 효율적인 침전은 2시간 후에 얻을 수 있지만 하룻밤 배양은 일반적으로 mRNA의 최종 수율을 증가시킵니다.
   13. 정제된 mRNA를 펠렛화하기 위해 17,949 × g 에서 4°C에서 30분 동안 반응을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 이제 펠릿을 ~1mL의 70% 에탄올(EtOH)로 세척하고 17,949 × g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 반응에서 오염 물질과 잔류 뉴클레오티드를 제거합니다.
   14. 펠릿을 자연 건조시킨 다음 뉴클레아제가 없는 물 20μL에 다시 현탁시킵니다. RT에서 부드럽고 반복적으로 피펫팅하여 RNA를 잘 용해하고 10분에 배양합니다.
       참고: EtOH 증발을 확인하기 위해 5분마다 펠릿을 확인하십시오. 재현탁할 때 RNA의 끈적거림을 고려하여 물에 제대로 용해될 때까지 피펫팅합니다.
   15. 분광 광도계에서 260nm 및 280nm(260/280 비율)에서 흡광도를 측정하여 준비된 mRNA의 농도와 순도를 평가합니다. 정확한 농도 추정을 보장하기 위해 RNA 준비의 다양한 스칼라 희석을 측정합니다.
       참고: 일반적으로 합성된 RNA의 농도는 1 - 2 μg/mL 범위이지만 최종 양은 CDS 길이와 출발 물질의 양에 따라 다를 수 있습니다.
   16. 품질을 평가하는 동안 mRNA 스톡을 얼음 속에 보관한 다음 5μL 분취량으로 분취하고 주입이 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
3. 배아 주입 및 약물 치료를 위한 표준 용액 및 재료 준비(2-3일, 그림 1B)
   1. 멸균 모세관(표준 모세관 치수: 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm)을 사용하여 제브라피시 배아용 미세주입 바늘을 당깁니다. 시중에서 판매되는 풀러 장치를 사용하고 출력 전압, 당기는 모드(1단계 또는 2단계) 및 당기는 힘 측면에서 원하는 설정을 적용하여 다양한 팁 길이, 직경 및 바늘 모양을 얻습니다. 제브라피쉬에 일반적으로 사용되는 바늘 특징은 Abdelrahman과 동료들¹¹을 참조하십시오.
      알림: 환경 조건(예: 습도 또는 실내 온도)이 바늘 당기는 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 최적 설정은 실험실마다 다를 수 있습니다. 설정은 정기적으로 다시 테스트하고 보정해야 합니다. 뽑힌 바늘은 RT에서 깨끗한 용기에 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
   2. 미세주입 용액을 제조하기 위해 이중 증류수(DD) 물 1L에 NaCl 101.7g, KCl 1.56g, MgSO₄ x 7H_2O2.96g, Ca(NO₃)₂ 4.25g 및 Hepes 35.75g을 용해시켜 pH 7.6에서 30x "Danieau" 원액을 준비합니다. 주입 혼합물의 가시 추적자로 사용하기 위해 DD 물에 5%의 페놀 레드 원액을 준비합니다.
   3. 4mL의 역삼투압 용수 4L에 4mL의 NaCl(5M), 680μL의 KCl(1M), 1.32mL의 CaCl₂ x 2H₂O(1M) 및 1.32mL의 MgSO₄ (1M)를 희석하여 배아 성장을 위한 E3 배지 용액을 준비합니다.
   4. 제품 데이터시트 및 용해도(1.036mL의 DMSO에 5mg을 용해하여 선택한 MEKi 10mM)에 따라 원하는 약물(이 예에서는 MEK 억제제[MEKi] PD032590)의 원액을 원액으로 준비합니다. 철저히 혼합하고 작은 부분 표본을 생성하여 사용할 때까지 -80 °C에서 보관합니다.
      참고: DMSO는 극성 및 비극성 화합물을 모두 용해하는 데 사용되는 일반적인 용매이며 물뿐만 아니라 광범위한 유기 용매에서 용해도를 보여줍니다.
   5. Artemia salina 낭종이 부화 용액(이전에 역삼투압 물에 용해된 바다 소금 30g/L에 Artemia salina 낭종 2g/L)에서 부화하도록 하여 최소 18시간 동안 지속적인 통기를 제공하여 살아있는 염수 새우 현탁액을 준비합니다.
      참고: 배양 조건 및 부화 시간은 시설 환경 조건 및 낭종 로트의 영향을 받을 수 있으므로 정기적으로 다시 테스트하고 필요한 경우 다시 설정해야 합니다.
4. Tg[ef1α:ERK biosensor-nes] (청소년) 물고기에 대한 번식 쌍 준비(3일차)
   1. 짝짓기 당일, 승인된 동물 시설 프로토콜에 따라 성체 쌍에게 정기적으로 먹이를 줍니다.
      1. 필터 크기가 다른 두 개의 스트레이너(필터 단계 I: 180μm, 필터 단계 II: 112μm)로 부화하지 않았거나 비어 있는 낭종을 필터링하여 부화한 염수 새우가 포함된 배양물을 세척합니다.
      2. 여과된 염수 200mL에 염수 새우를 모아 세척하여 10-15마리의 성어에게 약 5-10mL의 염수 새우 용액을 공급합니다.
         참고: 부화한 염수 새우 용액의 품질은 생명력, 운동성, 크기 및 색상을 확인하고 물고기가 소화할 수 없고 물고기의 위장관에 해를 끼칠 수 있는 부화하지 않았거나 빈 낭종을 제거해야 합니다. 번식 쌍의 경우, 먹이를 소화하고 높은 수질 수준을 유지하기 위해 번식 탱크에서 쌍을 격리하기 최소 3 시간 전에 하루의 마지막 식사를 제공하는 것이 바람직합니다.
   2. 지난 2주 동안(적어도) 짝짓기를 위해 짝을 이루지 않은 물고기 쌍을 선택하여 조난을 최소화하고 배우자 발달을 허용합니다. 선택한 성인 Teen 물고기 쌍 (일반적으로 1 : 2 ♀ 구성 ♂)을 적절한 번식 탱크에 적응시킵니다. 다음날 아침까지 탱크 칸막이를 사용하여 암컷과 수컷을 분리하십시오. 14/10시간의 표준 라이트/다크 주기를 보장합니다.
      참고: 그룹 십자가도 준비할 수 있습니다. 그러나 이 경우 산란이 다른 시간에 발생할 수 있으며 혼합 클러치에서 동일한 단계의 배아를 선택하는 것이 더 어려워집니다. 어두운 곳에서 밝은 곳으로 전환하는 것은 성공적인 짝짓기를 위해 매우 중요합니다.
5. WT 및 돌연변이 mRNA의 배아 채취 및 미세주입(4일차)
   1. 시설의 불이 켜지면 즉시 수컷과 암컷을 분리하는 탱크 칸막이를 제거하고 필요한 경우 어류가 방출하는 호르몬을 과도하게 희석하지 않고 수질을 높게 유지하기 위해 재순환 양식 시스템의 담수로 탱크 물의 약 20%를 변경합니다.
   2. 물고기를 방해하지 않고 정기적으로 알을 낳는지 확인하십시오 (보통 해가 뜨면 처음 30 분에서 1 시간 동안). 알(2-3mm)을 낳고 성인이 먹을 수 없도록 그리드로 분리된 탱크 바닥으로 떨어집니다. 성공적으로 번식한 성충을 격리하고 표준 여과기(예: 차 여과기)를 통해 계란이 들어 있는 탱크 물을 걸러내어 계란을 유지합니다.
      참고: 다른 짝짓기 라운드를 위해 동일한 물고기를 번식 탱크에 다시 넣거나 물고기를 원래 하우징 탱크로 되돌려 짝짓기 쌍, 날짜 및 성능을 기록하는 것이 가능합니다.
   3. 수집된 배아를 새로운 E3 배지로 세척하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 쌍에서 수정되지 않은 퇴화된 난자, 대변 및 기타 종류의 파편을 제거합니다.
      참고: 배아 과잉 인구를 피하기 위해 직경 90mm의 페트리 접시에 ~n = 100개의 수정란을 수집합니다.
   4. E3 배지에서 2% 아가로스를 성형하여 얻은 맞춤형 미세주입판에 수정된 십대 난자를 배열하고 정렬하여 미세주입 중에 난자를 포함하고 제한해야 하는 적절한 레인을 생성합니다.
      참고: 이 목적을 위해 맞춤형 또는 상업용 금형을 사용할 수 있습니다.
   5. 다음과 같이 돌연변이 배아를 생성하기 위해 새로운 미세주입 혼합물을 준비합니다: 20 μL의 최종 부피를 위해 0.3x Danieau 용액(원액에서 희석됨)에 용해된 30-60 pg의 캡핑 및 폴리아데닐화 mRNA(여기서는 shp2)를 추가합니다. 0.2 μL(0.05%)의 Phenol Red 원액을 미세주입 추적자로 추가합니다.
   6. 마이크로로더 피펫을 사용하여 2 μL의 주입 재료로 니들을 백로드합니다. 시중에서 판매되는 압력 미세주입 장치를 사용하여 Teen zebrafish 배아의 단일 세포 단계에 용액을 주입하고 압력 및 시간 설정을 수동으로 조정하여 바늘 및 배아 품질에 따라 각 주입을 보정합니다. 문헌^11,12에서 사용할 수 있는 표준 제브라피시 미세주입 프로토콜을 참조하십시오.
   7. 최적의 발달을 위해 통제된 사육 조건(온도: 28°C, 습도: 70%, 명암주기: 14/10시간)에서 미세주입된 십대 배아를 키우고 증착 후 3시간 이내에 흐리거나 퇴화하는 난자를 청소합니다.
   8. 수정 후 ~4시간(hpf)에서 적절한 램프 및 필터 설정(465-500nm)이 있는 표준 형광 실체현미경을 사용하여 배아의 형광(리포터 발현)을 스크리닝합니다. FRET 이미징에는 Teen-positive fish를 사용하고 면역조직화학(IHC) 평가에는 음성 형제자매를 사용합니다(아래 참조).
      참고: Tol2 기반 전이유전자¹³의 발현에서 알려진 가변성을 감안할 때, 배아는 다양한 수준의 Teen 형광을 나타낼 수 있습니다. 배치 내 형광의 개인 간 변동성을 제어하기 위해 주입되지 않은 형제를 검사하는 것이 좋으며, FRET 이미징의 낮은 동적 범위를 고려하여 기초 형광 수준이 매우 낮은 배아를 폐기하는 것이 좋습니다.
6. MEK 억제제(MEKi)를 사용한 제브라피시 배아 처리(4일차)
   1. 10mM 원액 1μL를 E3 배지로 9μL로 희석하여 MEKi PD0325901(1mM)의 중간 용액을 준비합니다. 중간 용액을 사용하여 최종 저선량 용액을 얻습니다. 0.75 μL의 1 mM 중간 용액과 2.25 μL의 E3 배지를 혼합하여 총 3 mL의 MEKi PD0325901의 저용량(0.25 μM)을 준비합니다. 0.75μL의 10% DMSO를 2.25mL의 E3 배지로 희석하여 대조군(Ctrl) 용액을 얻습니다.
   2. 6-웰 플레이트의 다른 웰에 동일한 수의 배아 풀을 놓고 수조 침지로 처리를 시작합니다: 각 웰에 대해 E3 배지를 비히클 제어(0.0025% DMSO) 또는 원하는 농도(0.25μM, 0.0025% DMSO)의 희석 약물을 포함하는 E3 배지로 교환합니다. 웰당 3mL의 약물 용액을 사용하십시오.
      참고: 캐리어(DMSO)의 다양한 농도로 인한 영향을 제거하려면 대조 용액과 처리 용액이 동일한 최종 DMSO 농도를 갖도록 하는 것이 중요합니다.
   3. 후속 분석(여기: 형태 분석 및 IHC 검증)을 위해 원하는 발달 단계까지 수집하기 전에 처리된 배아를 28°C에서 유지하십시오.

2. gastrula 단계에서 RASopathy 제브라피시 모델의 실시간 다중 스펙트럼 FRET 이미징 및 데이터 분석

1. 라이브 이미징을 위한 가스트룰라 장착(4일차)(그림 2A)
   1. 1.5g의 저융점 아가로스(LMA) 1.5g을 1x PBS에 용해시켜 1.5% LMA/E3를 만들어 살아 있는 배아를 위한 장착 배지를 준비합니다.
      참고: 발달 단계와 물고기를 억제해야 하는 특정 필요성에 따라 0.8에서 1.5% 사이의 아가로스 농도를 선택하십시오. 갓 만든 LMA 용액을 원하는 형식의 분취액으로 분배하고 LMA를 RT에서 중합 상태(몇 달 동안 안정)로 보관합니다. 이는 박테리아 및 곰팡이 오염을 최소화하지만 사용 전에 LMA 부분 표본의 품질을 정기적으로 점검합니다.
   2. 시료를 장착하기 전에 1.5% LMA 분취액을 50°C의 써모믹서 또는 멸균수조에서 용융합니다. 용해되면 써모 믹서의 온도를 약 30 °C로 낮추십시오.
   3. 라이브 이미징을 위해 단일 주입된 Teen⁺ 배아(여기서는 Shp^D61G를 발현하는 가스트룰라)를 직경 35mm의 유리 바닥 접시 중앙에 배치하고 얇은 털을 사용하여 방향을 지정합니다. 과량의 E3 배지를 제거하고 LMA 한 방울을 위에 올려 놓고 RT에서 중합되도록 두어 배아를 고정시킵니다.
      참고: 중합 과정이 시작될 때 물고기는 원하는 위치로 방향을 잡을 수 있습니다. 조직 손상을 방지하기 위해 35°C 이하의 온도에서 LMA를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 현미경 매개변수 설정 및 gastrulae의 다중 스펙트럼 FRET 이미징 수행(4일차) (그림 2B)
   참고: 이 프로토콜은 FRET 이미징을 수행하는 데 필요한 모든 하드웨어와 소프트웨어를 갖춘 모든 컨포칼 현미경 플랫폼의 사용에 적용됩니다. 여기서는 파장선이 458-476-488-496-514nm인 아르곤 이온 레이저가 장착된 컨포칼 현미경, 여기광과 방출광을 분리하는 프로그래밍 가능한 음향 광학 빔 스플리터(AOBS), 두 개의 스펙트럼 하이브리드(HyD) 검출기 및 스테이지 인큐베이터를 사용하여 샘플의 라이브 이미징 중에 안정적인 온도(28°C에서) 및 습도 조건을 유지했습니다.
   설명된 바와 같이 라이브 멀티 스펙트럼 FRET 이미징 프로토콜은 Fasano et al.에서 보여준 바와 같이 초기 gastrulae를 넘어 다양한 발달 단계의 배아에 적용할 수 있습니다.⁷. 이후 발달 단계(예: 24hpf)에 대해 더 큰 z-스택을 고려해야 하며, 스펙트럼 FRET 이미지 획득 중에 다중 스펙트럼 검출 단계를 허용하기 위해 적절한 z-및 t-간격 설정을 고려해야 합니다.
   1. 획득을 시작하기 최소 1시간 전에 인큐베이터 컨트롤러를 켜고 온도를 28°C로 설정하여 제브라피시 배아를 건강한 상태로 유지합니다. 인큐베이터 온도가 안정화되면 배아와 함께 이미징 접시를 샘플 홀더에 놓고 10x/dry 대물렌즈(개구수 0.4)를 사용하여 샘플을 빠르게 시각화합니다.
   2. 참조된 소프트웨어의 Laser Configuration(레이저 구성)에서 아르곤 이온 레이저를 켜고 슬라이더를 사용하여 레이저 출력을 50%로 조정합니다. Hardware Settings(하드웨어 설정)에서 이미지를 획득할 8비트 심도 해상도를 선택합니다.
   3. 획득 패널에서 분광 감지 XYλZ 스캐닝 모드를 선택하고 다음 획득 매개변수를 설정합니다: 형식 이미지: 512 x 512 px; 400 Hz의 스캐닝 속도; 광학 줌 0.75.
   4. 아르곤 이온 레이저의 458nm 레이저 라인을 활성화하고 강도 값을 일반적으로 <10%(여기서는 8.5%)로 설정합니다.
   5. HyD 검출기를 선택하고 원하는 값(여기서는 500)을 입력하여 검출기의 감도(게인)를 조정합니다.
      참고: 약하게 형광을 사용하는 살아있는 샘플의 경우 배경 잡음을 덜 축적하려면 광전자 증배관(PMT)보다는 하이브리드 검출기를 사용하는 것이 좋습니다.
      참조된 소프트웨어에서 염료의 방출 스펙트럼을 표시하려면 검출기를 활성화해야 합니다.
   6. 시작하려면 첫 번째 검출기(HyD)를 활성화하고 청록색 형광 단백질(CFP) 을 선택하여 방출 곡선을 표시합니다. 소프트웨어의 검출기 표시줄에 있는 드롭다운 메뉴를 열어 CFP 방출 곡선에 대한 선택 목록을 엽니다. 이제 두 번째 검출기를 활성화하여 두 번째 염료 노란색 형광 단백질(YFP)의 방출 곡선을 표시합니다. Ypet 방출 곡선도 표시하려면 두 번째 검출기를 활성화한 다음 두 번째 검출기를 끈 후 스펙트럼 이미지에 나타날 YFP 방출 곡선 을 선택합니다.
      알림: 이 단계가 완료되면 스펙트럼 수집 모드에서는 하나의 감지기만 사용되므로 두 번째 감지기를 비활성화해야 합니다.
   7. 실시간 수집을 시작하려면 가장 강렬한 신호 방출 범위(이 경우 YFP)에 감지 커서를 배치하여 샘플을 시각화하고 z-stack LAS X 창에서 샘플 두께의 시작 및 끝 위치를 결정하고 설정합니다.
   8. λ-스캔 범위 속성의 경우 감지 범위의 시작(460nm) 및 끝(570nm)을 설정합니다. 감지 대역 폭 : 5 nm; λ 스캔 단계 크기 : 5 nm. z-stack 획득을 시작합니다.
      참고: 표시된 매개변수를 통해 사용자는 허용 가능한 해상도로 비교적 빠른 이미징을 얻을 수 있지만 다른 설정을 사용할 수 있습니다. Fluorifier Disc Settings에서 자동으로 삽입된 NOTCH 필터를 선택 취소하여 단일 강도 손실을 방지할 수 있습니다.
   9. MEKi 노출 시 실시간 신호 변화를 평가하려면 유리 접시에 단일 돌연변이 배아(여기서는 Shp2^D61G)를 장착하고 약물 처리 전후의 이미지를 촬영합니다. 이러한 실시간 실험의 경우, 이미징 세션 중에 용해된 약물이 포함된 용액을 최대 2mL까지 투여하여 수조에 담궈 약물 치료를 직접 수행합니다.
3. 비율계량 FRET 이미지를 얻기 위한 이미지 후처리 및 다중 스펙트럼 염료 분리(5일차) (그림 2C)
   1. 공여체(CFP)와 수용체(Ypet) 방출을 분리하려면 스펙트럼 블리드스루(SBT)라고 하는 FRET 채널에서 두 분자의 형광 방출의 기여를 제거해야 합니다.
      1. 공개적으로 사용 가능한 염료/형광 단백질 데이터베이스를 참조하여 표준 CFP 방출 스펙트럼(여기 및 방출 스펙트럼)을 기준으로 .cvs 파일을 표시하고 다운로드합니다.
      2. .cvs 파일의 데이터 패널에서 Text to columns(텍스트를 열로) 옵션을 선택하고 쉼표를 구분 기호로 사용하여 데이터를 열로 분할합니다. 결과 파일에는 제거해야 하는 추가 정보(예: CFP 여기, CFP 2P)가 포함됩니다. 파장 및 방출에 상대적인 컬럼 데이터만 유지합니다.
      3. CFP 방출 열에서 501nm 이후의 모든 강도 데이터를 제거합니다.
      4. 460에서 500nm까지 조정된 CFP 방출 스펙트럼 파일을 .xls 형식( 그림 2C에서 "eCFP modified"라고 함)으로 저장합니다.
      5. 동일한 절차를 반복하여 YFP 단백질 방출 스펙트럼을 다운로드 및 처리하고 파장 및 방출에 상대적인 컬럼 데이터만 유지합니다. 최대 524nm의 모든 방출 값을 제거합니다. 조정된 YFP 방출 스펙트럼 파일을 525에서 650nm in.xls 형식( 그림 2C에서 "525nm의 Ypet"이라고 함)으로 저장합니다.
      6. 소프트웨어의 구성 창에서 사용할 수 있는 염료 데이터베이스에서 스펙트럼 블리드 스루(SBT)를 제외하려면 CFP 및 YFP에 대해 두 개의 조정된 참조 방출 스펙트럼을 삽입하고 저장하십시오.
   2. 이미징 세션에서 결과 스펙트럼 이미지 파일을 선택하고 Process 창을 연 다음 Dye Separation 도구에서 Spectral Dye Separation을 선택합니다. 염료 분리에 대한 설정을 다음과 같이 구성합니다. 대화 상자 왼쪽의 드롭다운 목록에서 첫 번째 위치에서 새 CFP 방출 스펙트럼(eCFP 수정됨)을 선택하고 스펙트럼 데이터베이스에서 새 YFP 방출 스펙트럼(525nm의 Ypet)을 선택합니다.
   3. Rescale(재스케일)에서 Per Channel(채널당)을 선택하여 채널을 개별적으로 스케일링한 다음 이미지의 λ-스캔에서 신호 강도가 가장 큰 것을 선택합니다(그림 2B의 오른쪽에 감지 단계를 보여주는 패널에서 흰색 화살표로 표시된 FRET 채널 방출 피크 레벨에서 스펙트럼 스캔의 14단계에 해당).). 그런 다음 샘플의 Z 스캔을 따라 이동하고 마진 영역에서 관심 영역을 강조하는 광학 섹션을 선택합니다.
   4. 동물 극의 마진 영역에서 ROI 선택 모드를 사용하여 최상의 스펙트럼을 가진 영역을 정의합니다. 디스플레이 창 상단에 표시된 ROICrosshair를 클릭하여 십자선을 불러오고 측정 영역에 40 복셀 값을 입력하여 참조 ROI의 크기를 조정합니다. ROICrosshair로 관심 영역을 정확하게 정의합니다. 이미지 다이어그램에서 데이터 정규화를 선택한 다음 적용을 클릭하여 구성된 설정으로 염료 분리를 수행합니다.
   5. 두 채널이 분리된 상태에서 얻은 이 새로 생성된 파일을 열고 데이터 시각화를 위해 3차원 이미지 시리즈(최대 강도 투영)에서 2차원 투영 이미지를 생성합니다.
   6. 프로세스 창에서 자르기를 선택하여 채널을 CH1 및 CH2(또는 FRET) 채널이라는 두 개의 개별 파일로 분리합니다.
   7. 프로세스 창에서 이미지 결합을 선택하고 CH2 파일을 선택하여 첫 번째 옵션에 삽입한 다음 CH1 파일을 선택하고 두 번째 옵션에 삽입합니다. 계수 5를 사용하여 재스케일을 설정하고 비율 연산을 선택합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 비율계량 이미지(YFP/CFP)가 포함된 새 파일을 생성합니다. 후속 데이터 분석을 위해 파일을 저장합니다.
4. FRET 신호 및 이미지 렌더링의 정량적 분석(5-6일차)(그림 2D)
   1. FRET/CFP 비율계량 이미지에서 FRET 신호를 정량적으로 측정하려면 예상 효과에 기반한 선험적 통계적 평가에 따라 N>2 배아(복제)에 대한 실험을 수행합니다. 오픈 소스 소프트웨어인 Fiji와 같은 이미지 처리 패키지를 사용합니다. 스펙트럼 이미징 및 염료 분리에서 얻은 이미지 파일을 오픈 소스 Fiji와 같은 이미지 분석 패키지로 가져옵니다.
   2. gastrulae 이미지에 대한 ROI 선택을 시작하기 전에 Analyze 기능 | 측정 설정 | Area(면적), Integrated density(통합 밀도) 및 Mean grey value(평균 회색 값)와 같은 관심 매개변수를 선택합니다.
   3. 관심 영역(이 특정 연구에서는: gastrula의 여백)을 툴바에서 polygon selection tool을 사용하여 선택합니다. Analyze(분석) | 도구 | ROI 관리자.
   4. 선택한 ROI에서 측정을 수행하려면 Analyze(분석) | 측정. 각 ROI 및 이미지/조건에 대해 이 단계를 반복합니다.
      참고: 필요한 경우 이미지를 로 저장합니다. TIFF 형식. 여러 이미지에서 파생된 모든 ROI 측정값을 하나의 ROI 파일로 저장할 수 있습니다. ROI 관리자 목록의 각 측정값 이름을 각 샘플/이미지에 상대적인 올바른 이름으로 바꿉니다.
   5. 각 조건(여기서는 돌연변이 및 돌연변이 + 치료)에 대해 선택한 각 ROI에 대한 FRET/CFP 비율의 모든 값을 추출하고 예를 들어 실험 그룹을 열로, 각 원시 값을 행으로 구성하여 워크시트에 구성합니다.
   6. 적절한 소프트웨어를 사용하여 다양한 실험 조건 간 FRET 신호의 통계적 차이를 평가하고 그래프 생성 및 데이터 시각화를 수행할 수 있습니다.
      참고: 오픈 소스 및 라이선스 소프트웨어는 데이터 분석 및 그래프 작성 솔루션에 사용할 수 있습니다.
   7. 모든 원시 측정값과 각 실험 조건에 대한 반복 횟수를 고려하여 통계적 평가를 위한 특정 프로젝트를 구성합니다. 단일 생물학적 복제에 대한 통계 분석을 위해 각 그룹이 열로 정의되는 하나의 그룹화 변수가 있는 열 테이블을 만듭니다. 둘 이상의 생물학적 복제에 대한 통계 분석을 위해 두 개 이상의 그룹화 변수, 즉 하나는 열(예: 실험 조건)로 정의되고 다른 하나는 행(예: 반복의 평균 값)으로 정의되는 그룹화된 테이블을 만듭니다.
   8. 워크시트에서 실험 그룹을 적절하게 정렬한 후 데이터 분포(정규성 검정, 예: D'Agostino-Pearson, Anderson-Darling)를 평가하고 결과에 따라 가장 적합한 통계 검정을 선택합니다.
      1. 파라메트릭 데이터(가우스 분포 따름)에 대해서는 일원분산분석을 수행하고 비모수 데이터에 대해서는 Kruskal-Wallis 검정을 수행합니다. 더 많은 요인(유전 및 약물 농도)이 존재하는 경우 Two-Way ANOVA를 고려하십시오. 각 조건의 평균 FRET 값을 서로 비교하고(다중 비교) 사후 검정(예: 모수 및 비모수 데이터에 대한 Tukey의 검정 및 Dunn의 검정)을 사용하여 다중 비교를 수정합니다.

3. FRET 결과의 IHC 검증 및 gastrulation 결함의 상관 형태 분석

1. tERK 및 pERK에 대한 IHC를 위한 용액 및 배아 고정 준비 및 장착(7일차)(그림 3A)
   1. IHC에 필요한 작업 솔루션을 준비합니다.
      1. NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4 14.4g, KH2PO4 2.4g을 DD 물 1L에 용해시켜 10x PBS의 원액을 제조한다. 용액을 멸균 상태로 유지하기 위해 고압멸균합니다.
      2. 10% Triton X-100 8mL를 1x PBS 100mL의 최종 부피에 용해시켜 0.8% PBS-Triton(PBSTr) 용액을 준비합니다.
      3. 100% 글리세롤 3mL, 7.5mL 및 12mL를 각각 15mL의 1x PBS로 희석하여 20%, 50% 및 80% 글리세롤 용액을 준비합니다.
   2. 10mL의 최종 부피 1x PBS에 이전에 용해된 250μL의 10% Triton X-100에 2.5mL의 16% PFA를 혼합하여 4% 파라포름알데히드(PFA)/0.25% PBSTr(고정 용액)을 준비합니다. 이 솔루션을 사용하여 4°C에서 하룻밤 사이에 6hpf의 배아를 고정할 수 있습니다. 효율적인 고정과 세척을 위해 튜브당 2mL 튜브와 최대 5개의 배아를 사용합니다.
      알림: 각 고정 라운드마다 새로운 정착제를 준비하는 것이 좋습니다. 주의: 포름알데히드 16%를 취급할 때는 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 화학 물질 후드 아래에 착용하십시오.
   3. 튜브에 0.8% PBSTr 1.5mL를 몇 차례 채워 2mL 튜브의 배아를 세척합니다. 배아를 새로운 2 mL tube로 옮기고 사용할 때까지 1x PBS에 배아를 보관합니다.
      참고: 초기 제브라피시 배아의 취급에 익숙하지 않은 경우, 피펫팅 중 배아 손실을 방지하기 위해 실체 현미경 아래에서 작업하십시오. "낮은 바인딩" 플라스틱 용기를 사용하여 배아가 튜브 벽에 끈적거릴 수 있는 것을 줄입니다.
2. pERK 및 tERK에 대한 조직 투과화 및 IHC(7-9일차)
   참고: IHC 결과는 실험실마다 다를 수 있는 여러 변수에 따라 달라지며 프로토콜의 특정 최적화가 필요할 수 있습니다.
   1. 고정된 제브라피시 배아를 0.8% PBSTr 1mL로 RT에서 3 x 10분 동안 세척합니다.
   2. RT에서 2분 동안 0.8% PBSTr(1:1,000)로 희석된 2μL의 Proteinase K로 샘플을 투과합니다.
   3. 1mL의 0.8% PBSTr로 샘플을 3 x 10분 동안 세척하고 실온에서 20분 동안 500μL의 4% PFA/1x PBS로 샘플을 접두어로 조직의 투과화를 중지합니다. 그런 다음 0.8% PBSTr 1mL에서 3 x 10분 동안 샘플을 세척합니다.
      참고: 조직 투과화에 사용되는 방법과 시간은 항원 유형, 조직 보존 품질 및 환경 요인의 영향을 받을 수 있는 중요한 단계입니다. 귀중한 샘플에 적용하기 전에 프로토콜을 최적화하십시오.
   4. 5% 정상 염소 혈청(NGS), 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1% DMSO를 포함하는 1x 블로킹 버퍼(BB)로 샘플을 배양하고, 다음과 같이 준비합니다: 0.8% PBSTr 1.5mL의 최종 부피에서 75μL의 100% NGS, 150μL의 10% BSA 및 15μL의 100% DMSO를 배양합니다. 튜브당 200μL의 용액을 사용하고 용액의 RT에서 20-30분 동안 배아를 배양합니다.
   5. 이전 단계에서 1x BB를 제거하고 원하는 1차 항체(여기서: 1μL의 1차 마우스 단클론 항체 p44/42 MAPK, 총 ERK, tERK, + 1μL의 토끼 다클론 phospho-p44/42 MAPK, 인산화된 ERK, pERK 희석)를 포함하는 용액에서 샘플을 새로 준비한 1x BB 용액 250μL에서 배양합니다. 튜브당 200μL의 용액을 사용하고 20°C에서 밤새 용액에 배아를 배양합니다.
   6. 비특이적 결합을 제거하려면 0.8% PBSTr 1mL로 샘플을 여러 번 세척합니다(먼저 10분마다 세척한 다음 30분마다 세척).
   7. 갓 준비한 1x BB에서 RT에서 20분 동안 샘플을 배양합니다.튜브당 200μL를 사용합니다.
   8. 이전 단계에서 1x BB를 제거하고 2차 항체(1x BB 용액 600μL에 형광 488 접합 염소 항 마우스 1μL, + 형광 접합 633 염소 항토끼 1μL)를 혼합하여 샘플을 배양합니다. 배아를 20°C에서 밤새 부드럽게 흔듭니다.
      참고: FRET 이미징에 사용된 것과 동일한 배치의 음성(형질전환 아님) Teen fish에 대해 IHC를 수행했습니다. 대안적으로, Teen⁺ fish도 사용할 수 있지만, 이 경우 CFP 또는 YFP의 방출 스펙트럼과 겹치지 않는 형광단에 접합된 2차 항체를 대신 사용해야 합니다.
   9. 위에서 설명한 대로 비특이적 결합을 제거합니다.
   10. RT에서 각 용액당 15분 동안 글리세롤/1x PBS 용액(20%, 50%, 80%)의 구배로 샘플을 세척합니다. 4°C에서 90% 글리세롤/1x PBS로 샘플을 보관합니다.
       알림: 형광 감쇠 가능성을 최소화하려면 샘플을 어두운 곳에 보관하십시오.
3. 면역염색 조직의 컨포칼 현미경 및 정량 분석(10-11일차)(그림 3B-E)
   1. 앞에서 설명한 대로 배아를 장착합니다.
   2. 컨포칼 현미경 검사 획득 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 80%의 백색 레이저, 형광 접합 염소 안티 마우스의 경우 507 - 551nm의 형광 방출 범위(이 경우 tERK에 사용되는 488nm의 방출 스펙트럼), 형광 접합 염소 안티 토끼의 경우 644 - 740nm(이 경우 633nm의 방출 스펙트럼, pERK에 사용됨). 순차 획득 모드, 512 x 512 픽셀의 형식 스캔 및 400Hz의 속도를 선택합니다. 4 - 5 μm의 z-step 크기 두께와 1의 표준 디지털 줌으로 스캔의 시작과 끝을 정의합니다. Water Immersion 25x 대물렌즈(0.05 개구수 포함)를 사용하여 6hpf에서 전체 가스트룰라를 획득합니다.
      주의: 이 프로토콜에는 해로울 수 있는 레이저의 적용이 포함됩니다. 따라서 특정 국가 요구 사항에 따라 인력 교육이 필요합니다.
   3. 컨포칼 이미지 획득 후 오픈 소스 소프트웨어인 Fiji와 같은 이미지 처리 패키지를 사용하여 얻은 원시 이미지 파일을 검사합니다.
      1. 피지에서는 이미지 메뉴와 하위 메뉴 색상에서 채널 분할 명령을 사용하여 단일 채널 이미지(총 ERK: 채널 = 0, C = 0, pERK: 채널 =1, C = 1)를 얻고 이미지 | 스택 | Z 프로젝트.
      2. 앞에서 설명한 대로 ROI 강도 측정 절차를 반복하고 데이터를 워크시트로 추출합니다.
      3. 실험 그룹 간에 원하는 ROI에서 p-ERK 신호 강도 변화를 추론하려면 p-ERK 염색의 원시 통합 밀도 값을 t-ERK 신호의 원시 통합 밀도로 나누어 p-ERK/t-ERK 비율을 계산합니다. 2.4단계에서와 같이 통계적 유의성 평가를 진행합니다.
         참고: 이미징 매개변수의 설정은 특정 요구 사항에 따라 각 샘플의 지속 시간, 원하는 이미지 품질 및 획득할 평면 수를 고려하여 수정할 수 있습니다.
4. 11개의 hpf 배아에서 축 측정(배아 고정을 위한 4일차, 데이터 수집 및 분석을 위한 12일차)(그림 4A-D)
   1. gastrulation(11hpf)이 끝나면 RT에서 20분 동안 1x PBS에 4% PFA로 배아를 고정하고 1x PBS에서 여러 번 세척한 다음 이미지 획득까지 4°C에서 보관합니다.
   2. 새로운 1x PBS가 포함된 12웰 플레이트의 단일 웰에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 측면으로 향하게 합니다.
   3. 타원형(Y/X 배아 축 비율 > 1)의 존재 여부, 제브라피쉬의 특징적인 중력병증 표현형 및 처리 효능의 결과로 인한 배아 축 비율의 형태학적 구조를 평가하기 위해 3.4x 배율 대물렌즈(0.63x 스캐닝 대물렌즈 x 8.60 줌 계수)가 있는 실체 현미경을 사용하여 명시야 모드에서 이미지를 캡처하여 전체 배아의 이미지를 획득합니다.
   4. 이미지 파일을 오픈 소스 Fiji와 같은 이미지 분석 패키지로 가져옵니다.
      1. 배아의 축 길이(x, 단축, 단축, y, 장축)를 도구 모음에서 직선 도구를 선택하고 Analyze | 측정. 선택한 측정을 수행한 후 ROI 관리자 목록에 추가하고 위의 FRET 이미징 분석에 대해 설명한 대로 ROI 파일을 저장합니다.
         참고: 각 배아 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다.
   5. 계속해서 워크시트의 데이터를 내보내고 장축의 길이(y)를 단축의 길이(x)로 나누어 축 비율을 계산합니다. 평균, 평균의 표준 편차 또는 다른 반복 실험 평균의 표준 오차를 계산합니다.
   6. 2.4단계와 같이 통계 데이터 분석을 진행합니다.

결과

이 프로토콜은 최근에 확립된 ERK 제브라피시 센서 ^6,9에 적용된 표준 라이브 FRET 이미징 방법을 사용하여 제브라피시 배아에서 일시적인 RASopathy 모델을 신속하게 생성하고 초기 돌연변이의 ERK 변동을 평가하는 간단한 워크플로우를 보여줍니다. 최근 동일한 실험 워크플로우 내에서 ^6,7

토론

수십 년에 걸친 연구와 무수한 돌연변이로 인해 매우 이질적인 형태의 RASopathies가 생성되었음에도 불구하고, 진단되지 않은 환자에 대한 염기서열분석 노력에서 알 수 없는 중요성을 가진 유전적 변이가 계속 나타나고 있습니다. 실제로, 많은 경우 임상적 특징에만 근거한 진단은 어려울 수 있으며 염기서열분석 결과를 검증하기 위한 기능적 유전체 접근 방식은 여전히 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Mini-sub Cell GT Horiziontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1704406	Gel Elecrophoresis
PC-100 Vertical puller	Narishige	-	Needle puller
PowerPac Universal Power Supply	Bio-Rad	1645070	Gel Elecrophoresis
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Plasmid preparation
Softwares
Biorender	Biorender	CC-BY 4.0 license	Cartoon elaboration for Figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Data analyses
Fiji software	ImageJ	15.3t	Imaging rendering and quantitative analyses (FRET signals measurements, ERK fluorescence intensity in IHC assay, embryo axes lenght)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Statistical data analyses
iControl spectrophotometer software	Tecan	v. 2.0	RNA quantification
Illustrator	Adobe	26.0.3 (64-bit)	Figure assembling
LASX software	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Imaging acquisition for spectral FRET experiments and embryo imaging for axes lenght measurements
Q9 Mini 18.02-SN software	Uvitec	-	Gel image acquisition