通过实时 FRET 显微镜和免疫荧光评估早期斑马鱼 Noonan 综合征模型中 ERK 活性调节的有效方案

摘要

RASopathies 是由 RAS-MAPK 通路过度激活引起的多系统遗传综合征。等待验证的潜在致病性变异不断出现，而临床前证据不佳限制了治疗。在这里，我们描述了我们的 体内 方案，通过 青少年报告斑马鱼的实时 FRET 成像来测试和交叉验证 RASopathy 相关的 ERK 激活水平及其胚胎发生过程中的药理学调节。

摘要

RASopathies 是由 ERK 过度激活引起的遗传综合征，可导致多系统疾病，也可能导致癌症易感性。尽管存在广泛的遗传异质性，但 RAS-MAPK 通路关键调节因子中的种系功能获得性突变是大多数病例的基础，并且由于先进的测序技术，影响 RAS-MAPK 通路的潜在致病性变异继续被鉴定出来。这些变异的致病性功能验证对于准确诊断至关重要，需要快速可靠的方案，最好 是在体内。 鉴于儿童早期有效治疗方法的稀缺性，此类方案，特别是如果在具有成本效益的动物模型中可扩展，有助于为药物重新定位/再利用提供临床前基础。

在这里，我们逐步描述了在斑马鱼胚胎中快速生成瞬时 RASopathy 模型的方案，并通过实时多光谱 Förster 共振能量转移 （FRET） 成像直接检查原肠胚形成过程中已经发生的活体疾病相关 ERK 活动变化。该协议使用最近建立并与商用显微镜硬件集成的转基因 ERK 报告基因。我们提供了通过表达 Shp2^D61G 获得的 Noonan 综合征 （NS） 斑马鱼模型的示例应用。我们描述了一种简单的方法，该方法能够在可用的低剂量 MEK 抑制剂进行药理学信号调节之前和之后在 NS fish 模型中记录 ERK 信号变化。我们详细介绍了如何在治疗前后从多光谱采集中生成、检索和评估比率式 FRET 信号，以及如何在早期通过经典免疫荧光对整个胚胎进行交叉验证结果。然后，我们描述了如何通过检查标准形态测量参数来查询胚胎形状的晚期变化，表明导致原肠胚形成受损，在受精后 6 小时通过活 FRET 评估 ERK 活性的相同胚胎。

引言

RASopathies 是损害正常发育并影响各种器官和组织的遗传综合征。这些情况通常是由参与 RAS/MAK 信号传导的关键基因和参与者的种系功能获得性 （GoF） 突变引起的，导致细胞外信号调节激酶 （ERK） 的过度激活（磷酸化增加）。ERK 通过易位到细胞核来调节发育过程中重要的一些基本过程 - 组织生长^{- 1,2}。参与 RAS-MAPK 通路的基因的体细胞突变是导致癌症的最常见事件³。因此，毫不奇怪，在 RASopathies 中也观察到癌症易感性。Noonan 综合征 （NS） 是最常见的 RASopathy² 形式，其特征是发育迟缓、身材矮小、严重程度不一的认知缺陷和心肌病。在大多数情况下，这种疾病是由 PTPN11 中的 GoF 突变引起的，PTPN11 是 2000 年初发现的第一个 RASopathy 基因⁴，编码酪氨酸磷酸酶 SHP2 蛋白，该蛋白充当该通路的正调节因子。

从那时起，由于在未确诊患者中呈指数级使用外显子组测序方法，影响 RAS-MAPK 相关因素的潜在致病性变异，并且可能与各种形式的 RASopathies 有关，不断被发现，并等待功能表征以实现有效的患者分层²。为了实现这一目标，需要保证在生物体水平上进行快速和信息丰富的功能验证的实验方案。采用经典和标准化的哺乳动物模型来测试意义未知的变异将成本高昂、极其耗时，并且需要在不透明的大型动物中使用侵入性方法。鉴于目前没有管理或治疗的贫穷或未确诊的 RASopathy 患者所代表的社会负担，这种策略显然与快速检测的要求不相容。对整个生物体中的关键表型特征和分子相关性进行定量评估的方案也将有助于通过重新利用/重新定位来加速 RASopathy 患者可能获得的药物的可能临床转化。

斑马鱼是研究影响早期发育的疾病的理想脊椎动物模型。首先，斑马鱼与人类具有高水平的遗传同源性。成年鱼的高繁殖力导致大量胚胎产生，这些胚胎体积小且发育迅速。胚胎在早期阶段是透明的，因此可以使用标准显微镜毫不费力地观察主要发育过程（上消化、原肠胚形成、轴和身体平面形成）。此外，可用于在发育过程中跟踪特定细胞行为和动态分子事件的转基因品系的可用性，以及生成遗传模型的先进技术，是无与伦比的。此外，可以在斑马鱼的多个层面（从生物体到细胞缺陷）评估表型读数，并且已经为包括 RASopathies⁵ 在内的几种疾病建立了专门的检测方法。此外，在早期阶段相对简单的药物给药浴浸方法，至少对于水溶性化合物，允许在 96 孔 格式中进行 体内高通量药物筛选。

从分子角度来看，使用标准方法（如免疫组织化学和免疫印迹）的研究有力地证明了 ERK 激活与鱼胚胎中 RASopathy 相关发育缺陷之间的相关性 ^6,7。最近开发的斑马鱼中的 EKAR 型 FRET 生物传感器 （Tg[ef1a：ERK biosensor-nes]， Teen） 提供了一种可靠的体内工具，可以在胚胎发生过程中以时空分辨的方式记录 ERK 激活。因此，它对于更好地评估 RASopathy 鱼模型中的动态 ERK 改变和药理学调节可能很有价值。

在 Teen 传感器中，报告基因中的特异性 ERK 底物在 ERK 激活时被磷酸化，触发构象变化，使荧光 CFP 供体 （D） 和荧光 Ypet（改进的 YFP）受体 （A） 靠近。如果 D 发射光谱与 A 的吸收光谱相当重叠，就会发生 FRET（从 D 到 A 的能量吸收）。这与 D 和 A 之间的距离成正比，因此，在 Teen 中，与 ERK 激活状态成正比。使用标准或共聚焦显微镜的标准和高级成像模块，可以在活体和固定样品中设置不同的成像方案。在 D 激发时，沿从 CFP 到 YFP 的指定发射光谱 （λ） 采集多光谱扫描，然后进行光谱“解混”算法是配准和量化 FRET 数据的最可靠方法之一⁸。它也可以应用于活斑马鱼标本，以记录 体内 组织动力学。

继之前的报告 ^6,9 和我们最近的应用⁷ 之后，我们在这里详细介绍了使用 Teen fish 评估 NS 模型动物极边缘细胞中 ERK 激活的分步工作流程，并将其与仅在发育后期可见的特征性体轴缺陷相关联。我们展示了如何在用可用的 MEKi 处理前后从活 NS 原肠中获取和检查定量 FRET 数据，以及如何通过针对磷酸化（活性）ERK 的标准免疫组织化学交叉验证结果或对胚胎伸长缺陷进行相关形态测量分析。

该工作流程可用于促进推定与 RASopathies 相关的新出现的变异和疾病基因的功能测试，并深入了解脊椎动物发育过程中 ERK 激活动力学在空间和时间上与胚胎形态缺陷的相关性。我们表明该方案也可用于测试调节 ERK 激活的候选药物的疗效。

研究方案

所有涉及动物饲养和繁殖的实验程序均根据意大利卫生部 （Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF） 授权的 ARRIVE 动物指南进行。所有 DNA/RNA 反应和成像过程都可以根据需要按比例放大或缩小，具体取决于所需的最终材料或测试的基因和变异的数量。

1. 瞬时斑马鱼 RASopathy 模型的生成和药物治疗

注：为了监测 RASopathy 相关变体的表达，可以使用在带有小非荧光标签（如 myc 或类似标签）的 cds 的框架中携带目标蛋白质所需编码序列 （cds） 的特异性构建体。这样，可以通过针对标签的标准蛋白质印迹来评估突变蛋白的表达水平。如果有针对目标特异性蛋白质的抗体，则可以避免使用标签。免疫荧光也可用于按照标准方案评估胚胎组织内的蛋白质表达。这种类型的对照实验可用于将突变蛋白表达与诱导的 ERK 激活水平相关联。鉴于显微镜检查过程中可能存在荧光发射串扰，不建议将荧光标签与 FRET 成像结合使用。

1. 质粒线性化（第 1-2 天）（图 1A）
   注意：当在斑马鱼中生成由影响特定基因的 GoF 突变引起的瞬时疾病模型（此处为 RAsopathy）时，一种快速的方法是制备编码野生型 （WT） 和感兴趣的突变蛋白的 mRNA，然后应按照以下步骤将其注射到斑马鱼胚胎中。用作转录 mRNA 模板的质粒应包含克隆在 T7、Sp6 或 T3 聚合酶启动子下游和多聚腺苷酸化 （polyA） 信号上游的目标基因所需的全长 CDS（编码序列）。如果不可用，第一步是通过在合适的载体中克隆斑马鱼或人类所需的 CDS 来生产它¹⁰ ，并通过 SANGER 测序进行验证。对于克隆，请考虑额外的时间（平均 1 周，包括克隆、筛选集落以及分离和扩增正确的克隆）。
   1. 用合适的限制性内切酶线性化质粒，仅在 polyA 信号下游切割一次（此处为 KpnI）。为了实现高效的质粒线性化，将 3 γ （μg/μL） 质粒 DNA、2 μL 限制性内切酶 （20,000 Unit/mL） 和 10 μL 10x 反应缓冲液混合，最终体积为 100 μL，溶于无核酸酶水中。通过移液几次彻底混合组分，并将反应混合物在 37 °C 下孵育 2-4 小时。
   2. 通过在 1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳检查线性化的结果。
      1. 用无核酸酶的水稀释 10 倍 TBE 储备溶液（48.5 g Tris、11.4 mL 冰醋酸、20 mL 0.5 M EDTA [pH 8.0]）。
      2. 通过在微波炉中溶解 1.5 g 琼脂糖和终体积为 100 mL 的 1x TBE 溶液来制备琼脂糖凝胶。然后，加入 3.5 μL 染料凝胶染料。
      3. 通过将琼脂糖溶液倒入合适大小的腔室中来灌注凝胶，具体取决于条件/质粒的数量。放置梳子并等待约 1 小时，直到凝胶凝固;然后，取下电泳梳，将聚合凝胶放在合适的凝胶托盘中进行电泳。
      4. 将几 μL 消化质粒（“切割”）和 1.5 μL 6x 上样缓冲液（包含用于监测电泳的染料）混合，最终体积为 10 μL 无核酸酶水。以相同的方式制备带有未消化质粒（“未切割”）的单独对照样品。在琼脂糖泳道中上样样品，在第一个泳道中上样 1 Kb DNA 分子量标准。在 100 V 下进行 DNA 电泳 30 分钟。
      5. 可视化并记录在标准 UV 透射仪上运行产生的 DNA 条带。通过比较“切割”和“未切割”的 DNA 条带模式来检查质粒线性化的效率。
         注意：充分线性化的质粒作为一个尖锐的条带应该运行得更快。确保 DNA 切割完成，因为转录反应的起始是一个关键的限制步骤，环状质粒形式的存在可能会阻碍它，从而导致 mRNA 产量不佳。
   3. 使用市售的基于离心柱的 DNA 纯化试剂盒继续纯化线性化质粒，并将纯化的 DNA 制备物储存在 -20 °C 直至需要。
      注：可以使用 PCR 产物作为 mRNA 转录的模板，而不是线性化，前提是它包括终止密码子上游的聚合酶启动子序列和 polyA 信号序列下游。在继续之前，还应纯化 PCR 产物并在琼脂糖凝胶上检查。
2. In vitro mRNA 转录、纯化和质量控制（第 2-3 天） （图 1A)
   注意：用 RNAse 去污溶液仔细清洁工作区域和移液器。使用不含核酸酶的材料和试剂;戴手套。这将最大限度地减少 RNase 污染，并提高全长 mRNA 的产量。
   使用标准试剂盒转录编码线性化质粒中WT和突变蛋白的加帽和多聚腺苷酸化mRNA，并遵循制造商的说明进行转录。
   1. 将纯化的线性化质粒以 17,949 × g 离心几秒钟，以确保碎片收集在试管底部，而不会转移到转录反应中。
   2. 在室温 （RT） 下解冻除 NTP 和 CAP 类似物的混合物外的所有组分，它们保存在冰上。将聚合酶保持在 -20 °C 直至使用。
   3. 使用前将所有试剂以 17,949 × g 短暂离心，以防止试剂损失或意外污染，并短暂涡旋 10x 反应缓冲液和即用型 NTP/CAP 类似物混合物，直到它们完全溶解。将 10x 反应缓冲液保持在 RT 中。
   4. 将 600-800 ng 线性化和纯化的质粒加入到含有 10 μL 2x NTP/CAP 类似物混合物、2 μL 10x 反应缓冲液、2 μL SP6、T7 或 T3 酶（取决于质粒中 CDS 上游的特异性启动子）的溶液中，制备转录反应，最终体积为 20 μL，由无核酸酶水配制。通过上下吹打几次充分混合。
   5. 在热循环仪中于 37 °C 孵育转录反应。确保还将盖子的温度设置为 37 °C 并运行反应 2 小时。
   6. 要去除反应过程中未转录的残留质粒，请添加 1 μL 标准 DNAse 溶液（2 单位/μL）。通过移液几次充分混合反应物，并在 37 °C 下再孵育 30 分钟。
   7. 在继续之前，通过 TBE/甲酰胺琼脂糖电泳检查 体外 合成的 mRNA 的质量和完整性。将 1.0 g 琼脂糖溶解在 50 mL 1x TBE 溶液中，加入 5.5 mL 37% 甲酰胺和 3.5 μL 染料凝胶染色剂，混合，如上所述灌注凝胶。
      注意： 处理甲酰胺时，请穿戴个人防护装备 （PPE） 并使用化学头罩。
   8. 将 1 μL 转录的 mRNA 与 2.5 μL 2x 甲酰胺染料上样缓冲液在无核酸酶的水中混合，总体积为 5 μL。通过移液几次彻底混合组分，然后将样品加载到凝胶泳道中。将凝胶在预冷的 1x TBE 缓冲液中以 100 mV 运行10-15 分钟。同时运行 1 kb DNA 和/或 RNA 分子量标准。
   9. 可选：将分子量标准和 mRNA 在 70 °C 下变性 10 分钟。
   10. 在标准紫外透射仪上可视化和记录得到的 mRNA 条带。
       注：长运行和高温会增加 RNA 降解的可能性。
   11. 如果合成的加帽 RNA 的完整性和大小最佳，则通过添加以下试剂进行 C 端多聚腺苷酸化：36 μL 无核酸酶水、20 μL 5x 变性上样缓冲液、10 μL 25 mM MnCl₂、10 μL 10 mM ATP 和 4 μL 聚腺苷酸化酶（如纯化的大 肠 杆菌 Poly（A） 聚合酶）。通过移液几次充分混合反应物，并将 100 μL 的最终反应在 37 °C 下再孵育 1 小时。
       注：不建议在 polyA 反应后通过凝胶电泳检查 RNA 质量，因为 RNA 会因 polyA 尾部而出现拖尾。
   12. 使用适当的盐（如 LiCl）沉淀并回收合成的加帽和多聚腺苷酸化 mRNA。简而言之，将等体积的无核酸酶水和标准 2.5 M LiCl 溶液 （30 μL） 混合，并在 -20 °C 下孵育 >30 分钟。
       注：2 小时后可获得高效沉淀，但过夜孵育通常会增加 mRNA 的最终产量。
   13. 为了沉淀纯化的 mRNA，将反应物在 4°C 下以 17,949 × g 离心 30 分钟，并去除上清液。现在，用 ~1 mL 的 70% 乙醇 （EtOH） 洗涤沉淀，并在 4 °C 下以 17,949 × g 离心 15 分钟，以去除反应中的污染物和残留核苷酸。
   14. 将沉淀物风干，然后将其重新悬浮在 20 μL 无核酸酶的水中。通过在 RT 下轻轻重复移液使 RNA 充分溶解，并在 10 分钟时孵育。
       注：每 5 分钟检查一次沉淀，以确保 EtOH 蒸发。重悬时，鉴于 RNA 的粘性，移液直至其正确溶解在水中。
   15. 通过在分光光度计中测量 260 nm 和 280 nm（260/280 比率）处的吸光度来评估制备的 mRNA 的浓度和纯度。测量 RNA 制备物的不同标量稀释度，以确保正确的浓度估计。
       注：通常，合成的 RNA 浓度为 1 至 2 μg/mL，但最终量可能因 CDS 长度和起始材料量而异。
   16. 在评估质量时，将 mRNA 原液保存在冰中，然后将其分装成 5 μL 等分试样并储存在 -80 °C 直至需要注射。
3. 胚胎注射和药物治疗的标准溶液和材料的制备（第 2-3 天， 图 1B）
   1. 使用无菌毛细管（标准毛细管尺寸：1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm）拉动斑马鱼胚胎的显微注射针。使用市售的拉拔装置，并在输出电压、拉动模式（一步或两步）和拉拔力方面应用所需的设置，以获得可变的尖端长度、直径和针形状。有关斑马鱼常用的针特征，请参阅 Abdelrahman 及其同事¹¹。
      注：最佳设置可能因实验室而异，因为环境条件（如湿度或室温）会影响针头拔针结果。应定期重新测试和校准设置。拔出的针头可以在 RT 中存放在干净的容器中几个月。
   2. 通过将 101.7 g NaCl、1.56 g KCl、2.96 g MgSO₄ x 7H₂O、4.25 g Ca（NO₃）₂ 和 35.75 g HEPES 溶解在 1 L 双蒸 （DD） 水中，制备 pH 值为 7.6 的 30x“Danieau”储备溶液用于制备显微注射溶液。还制备 5% 酚红的 DD 水储备液，用作注射混合物的可见示踪剂。
   3. 通过稀释 4 mL NaCl （5 M）、680 μL KCl （1 M）、1.32 mL CaCl₂ x 2H₂O （1 M） 和 1.32 mL MgSO₄ （1 M） 在终体积为 4 L 反渗透水中，制备用于胚胎生长的 E3 培养基溶液。
   4. 根据产品数据表和溶解度（通过将 5 mg 溶解在 1.036 mL DMSO 中，将 10 mM 所选 MEKi PD032590）制备所需药物的储备液（在本例中：MEK 抑制剂 [MEKi] ）作为储备液。充分混合并生成小等分试样以在 -80 °C 下储存直至使用。
      注：DMSO 是一种常用溶剂，用于溶解极性和非极性化合物，在各种有机溶剂和水中均具有溶解性。
   5. 让 卤虫盐 沼藻囊肿在 28-30 °C 的孵化溶液（2 g/L 卤 藻囊肿 溶于 30 g/L 先前溶于反渗透水中的海洋盐中）孵化至少 18 小时，制备活盐水虾悬浮液，提供恒定的通气。
      注：培养条件和孵化时间可能受设施环境条件和包囊批次的影响，应定期重新测试，必要时重新设置。
4. 为 Tg[ef1α：ERK biosensor-nes] （青少年） 鱼准备繁殖对（第 3 天）
   1. 交配当天，根据批准的动物设施协议定期喂养成年对。
      1. 用两个不同过滤器尺寸的过滤器过滤掉未孵化或空的囊肿，清洁含有孵化盐水虾的培养物（过滤步骤 I：180 μm，过滤步骤 II：112 μm）。
      2. 收集过滤后的盐水虾，并在 200 mL 反渗透水中清洗，用大约 5-10 mL 的盐水虾溶液喂养 10-15 条成年鱼。
         注意：检查孵化的盐水虾溶液的质量，查看它们的活力、运动性、大小和颜色，并确保去除未孵化或空的囊肿，这些囊肿对鱼来说是不可消化的，可能对鱼的胃肠道造成伤害。对于繁殖对，最好在将配对隔离在繁殖池中之前至少 3 小时提供一天中的最后一餐，以允许食物消化并保持高水质水平。
   2. 选择在过去 2 周内（至少）未配对交配的鱼对，以尽量减少痛苦并允许配子发育。将选定的成年 青少年 鱼对（通常采用以下成分：1 ♂ ： 2 ♀ ）适应适当的繁殖池。使用水箱隔板将雌性和雄性分开，直到第二天早上。确保 14/10 小时的标准光照/暗循环。
      注意：也可以安排组交叉。然而，在这种情况下，产卵可能发生在不同的时间，从混合窝中选择同一阶段的胚胎变得更加困难。从深色到浅色的过渡对于成功交配至关重要。
5. 胚胎收集和 WT 和突变 mRNA 的显微注射（第 4 天）
   1. 设施内的灯一打开，就拆下分隔雄性和雌性的水箱隔板，如有必要，用来自循环水产养殖系统的淡水更换大约 20% 的水箱水，以保持水质高，而不会过度稀释鱼释放的激素。
   2. 不要打扰鱼，定期检查产卵情况（通常在日光的前 30 分钟到 1 小时）。产卵（2-3 毫米）并落到水箱底部，由网格隔开，这样成虫就不能吃它们。隔离成功繁殖的成鱼，并通过标准过滤器（如滤茶器）过滤含有鸡蛋的水箱水以保留鸡蛋。
      注意：可以将同一条鱼放回繁殖箱中进行另一轮交配，或者将鱼放回原来的饲养箱中，记录交配对、日期和性能。
   3. 用新鲜的 E3 培养基清洗收集的胚胎，并使用巴斯德移液管从成对中取出未受精、退化的鸡蛋、粪便和其他种类的碎片。
      注意：在直径为 90 mm 的培养皿中收集 ~n = 100 个受精 的青少年 卵，以避免胚胎数量过多。
   4. 通过在 E3 培养基中塑造 2% 琼脂糖来获得定制的显微注射板中排列和对齐受精 的青少年 卵子，以产生适当的泳道，这些泳道在显微注射过程中必须包含和限制卵子。
      注意：为此，可以使用定制或商业模具。
   5. 制备新鲜的显微注射混合物以生成突变胚胎，如下所示：30-60 pg 加帽和多聚腺苷酸化 mRNA（此处为 shp2）溶于 0.3x Danieau 溶液（从储备液中稀释）中，最终体积为 20 μL。加入 0.2 μL （0.05%） 酚红储备溶液作为显微注射示踪剂。
   6. 使用微量装载器移液器将 2 μL 注射材料倒装到针头上。使用市售的压力显微注射装置将溶液注射到青少年斑马鱼胚胎的单细胞阶段，手动调整压力和时间设置，以根据针头和胚胎质量校准每次注射。请参阅文献^11,12 中提供的标准斑马鱼显微注射方案。
   7. 在受控饲养条件下（温度：28 °C，湿度：70%，光照/黑暗周期：14/10 小时）培养显微注射 的青少年 胚胎以实现最佳发育，并在沉积后接下来的 3 小时内清除任何看起来浑浊或退化的鸡蛋。
   8. 在受精后 ~4 小时 （hpf），使用具有适当灯和滤光片设置 （465-500 nm） 的标准荧光立体显微镜筛选胚胎的荧光（报告基因表达）。使用 青少年阳性鱼进行 FRET 成像，使用阴性兄弟姐妹进行免疫组织化学 （IHC） 评估（见下文）。
      注意：鉴于基于 Tol2 的转基因¹³ 表达的已知可变性，胚胎可以显示不同水平的 Teen 荧光。建议检查未注射的兄弟姐妹，以控制批次内荧光的个体间变异性，并且考虑到 FRET 成像的低动态范围，丢弃基础荧光水平极低的胚胎。
6. 用 MEK 抑制剂 （MEKi） 处理斑马鱼胚胎（第 4 天）
   1. 通过将 1 μL 的 10 mM 储备液和 9 μL 的 E3 培养基稀释，制备 MEKi PD0325901 （1 mM） 的中间溶液。使用中间溶液获得最终的低剂量溶液。通过将 0.75 μL 的 1 mM 中间溶液与 2.25 μL 的 E3 培养基混合，制备总体积为 3 mL 的低剂量 （0.25 μM） MEKi PD0325901。用 2.25 mL E3 培养基稀释 0.75 μL 10% DMSO，得到对照 （Ctrl） 溶液。
   2. 将等数胚胎池置于 6 孔板的不同孔中，并通过浴浸开始处理：对于每个孔，将 E3 培养基与含有载体对照（0.0025% DMSO）或所需浓度（0.25 μM，0.0025% DMSO）的稀释药物的 E3 培养基交换如前所述。每孔使用 3 mL 药物溶液。
      注：为了消除不同浓度的载体 （DMSO） 引起的任何影响，确保对照溶液和处理溶液具有相同的最终 DMSO 浓度非常重要。
   3. 在收集胚胎之前，将处理过的胚胎保持在 28 °C，直到后续测定所需的发育阶段（此处：形态学分析和 IHC 验证）。

2. 原肠期 RASopathy 斑马鱼模型的实时多光谱 FRET 成像和数据分析

1. 用于实时成像的安装原浆（第 4 天）（图 2A）
   1. 通过将 1.5 g 低熔点琼脂糖 （LMA） 溶解在 1x PBS 中以制备 1.5% LMA/E3 来制备活胚胎的封固剂。
      注：根据发育阶段和抑制鱼的具体需要，从 0.8% 到 1.5% 中选择琼脂糖浓度。将新鲜制备的 LMA 溶液以所需形式的等分试样分发，并在 RT 下以聚合状态储存 LMA（稳定几个月）。这样可以最大限度地减少细菌和真菌污染，但在使用前要定期检查 LMA 等分试样的质量。
   2. 样品封固前，将 1.5% LMA 等分试样在 50 °C 的热混合器或无菌水浴中熔化。 溶解后，将热混合器的温度降低至约 30 °C。
   3. 将单个注射的 Teen ⁺ 胚胎（这里是表达 Shp^D61G 的原肠）放在直径为 35 毫米的玻璃底培养皿的中心进行实时成像，并使用一根细毛定向。去除多余的 E3 培养基，并在顶部滴一滴 LMA 并使其在 RT 下聚合，从而固定胚胎。
      注意：在聚合过程开始时，可以将鱼定向到所需的位置。严禁建议在不高于 35 °C 的温度下使用 LMA，以免损伤组织。
2. 设置显微镜参数并进行原肠胚的多光谱 FRET 成像（第 4 天）（图 2B)
   注意：该协议适用于使用任何配备执行 FRET 成像所需的所有硬件和软件的共聚焦显微镜平台。在这里，我们使用了配备波长线为 458-476-488-496-514 nm 的氩离子激光器、分离激发光和发射光的可编程声光分束器 （AOBS）、两个光谱混合 （HyD） 检测器和一个载物台培养箱，以在样品的实时成像期间保持稳定的温度（28 °C）和湿度条件。
   如Fasano等人所示，所描述的实时多光谱FRET成像方案可以应用于早期原肠胚之后不同发育阶段的胚胎。⁷.在后期开发阶段（例如，24 hpf）应考虑更大的 z 堆栈以及适当的 z 和 t 间隔设置，以允许在光谱 FRET 图像采集期间进行多光谱检测步骤。
   1. 在开始采集前至少 1 小时打开培养箱控制器，并将温度设置为 28 °C，以保持斑马鱼胚胎处于健康状态。培养箱温度稳定后，将带有胚胎的成像皿放在样品架上，并使用 10 倍/干燥物镜（数值孔径为 0.4）快速观察样品。
   2. 在参考软件的 Laser Configuration（激光配置 ）中，打开氩离子激光器并使用滑块将 激光功率 调整到 50%。在 硬件设置中，选择将获取图像的 8 位深度分辨率 。
   3. 在采集面板中选择光谱检测 XYλZ 扫描模式，并设置以下采集参数：格式图像：512 x 512 px;扫描速度 400 Hz;光学变焦为 0.75。
   4. 激活氩离子激光器的 458 nm 激光线并设置其强度值，通常为 <10%（此处为 8.5%）。
   5. 选择一个 HyD 探测器，并通过输入所需的值（此处为 500）来调整探测器的灵敏度（增益）。
      注：对于活的弱荧光样品并积累较少的背景噪声，建议使用混合检测器而不是光电倍增管 （PMT）。
      在参考软件中，显示染料的发射光谱需要激活检测器。
   6. 首先，激活第一个检测器 （HyD） 并选择 青色荧光蛋白 （CFP） 以显示其发射曲线。打开软件 检测器 栏的下拉菜单，打开 CFP 发射曲线的选择列表。现在，激活第二个检测器以显示第二个染料 黄色荧光蛋白 （YFP） 的发射曲线。要同时显示 Ypet 发射曲线，请激活第二个探测器，然后在关闭第二个探测器后选择将出现在光谱图像中的 YFP 发射曲线 。
      注意：完成此步骤后，应停用第二个检测器，因为在光谱采集模式下仅使用一个检测器。
   7. 要开始实时采集，请将检测光标定位在最强信号发射的范围（在本例中为 YFP 的信号）范围内，以可视化样品，在 z 堆栈 LAS X 窗口中决定并设置样品厚度的开始和结束位置。
   8. 对于 λ 扫描范围属性，请设置以下参数：检测范围的开始 （460 nm） 和结束 （570 nm）; 检测带宽度：5 nm; λ 扫描步长：5 nm。开始 z 堆栈采集。
      注意：指示的参数允许用户获得具有可接受分辨率的相对较快的成像，但可以使用不同的设置。在 Fluorifier Disc Settings（荧光片设置）中，可以取消选择自动插入的 NOTCH 滤光片，以避免单次强度损失。
   9. 为了评估 MEKi 暴露后的实时信号变化，将单个突变胚胎（此处为 Shp2^D61G）安装在玻璃皿中，并在药物治疗前后成像。对于这些实时实验，在成像过程中使用最多 2 mL 含有溶解药物的溶液，通过浴浸泡直接进行药物处理。
3. 图像后处理和多光谱染料分离以获得比率式 FRET 图像（第 5 天）（图 2C)
   1. 为了分离供体 （CFP） 和受体 （Ypet） 发射，请务必消除两种分子在 FRET 通道中荧光发射的贡献，称为光谱渗漏 （SBT）。
      1. 请参阅公开可用的染料/荧光蛋白数据库，以显示和下载相对于标准 CFP 发射光谱（激发和发射光谱）的 .cvs 文件。
      2. 在 .cvs 文件的 Data 面板中 ，选择 Text to columns 选项，并使用逗号作为分隔符将数据拆分为多个列。生成的文件将包含应删除的其他信息（例如 CFP 激发、CFP 2P）。仅保留相对于波长和发射的色谱柱数据。
      3. 在 CFP 发射列中，删除 501 nm 以上的所有强度数据。
      4. 以 .xls 格式保存从 460 到 500 nm 的改编后的 CFP 发射光谱文件（在 图 2C 中称为“eCFP modified”）。
      5. 重复相同的步骤以下载和处理 YFP 蛋白质发射光谱，并仅保留相对于波长和发射的色谱柱数据。去除所有高达 524 nm 的发射值。将 525 至 650 nm 的改编 YFP 发射光谱文件保存为in.xls格式（在 图 2C 中称为“525 nm 的 Ypet”）。
      6. 为了允许在软件的 Configuration 窗口提供的染料数据库中排除光谱渗漏 （SBT），请插入并保存两个适用于 CFP 和 YFP 的参考发射光谱。
   2. 从成像会话中选择生成的光谱图像文件，打开 Process（处理）窗口，然后在 Dye Separation（染料分离）工具中选择 Spectral Dye Separation（光谱染料分离）。按如下方式配置染料分离的设置：在对话框左侧的下拉列表中，在第一个位置选择新的 CFP 发射光谱（修改的 eCFP），并从光谱数据库中选择新的 YFP 发射光谱（来自 525 nm 的 Ypet）。
   3. 在 “重新缩放”下，选择 “每通道 ”以单独缩放通道，然后在图像的 λ扫描 中，选择信号强度最大的通道（对应于FRET通道发射峰水平上光谱扫描的步骤14，由图 2B右侧显示检测步骤的面板中的白色箭头表示）).然后，沿着样品的 Z 扫描移动，并选择突出显示边缘区域感兴趣区域的光学部分。
   4. 在动物杆的边缘区域上使用 ROI 选择模式来定义具有最佳光谱的区域。单击显示窗口顶部指示的 ROICrosshair 以调用十字准线，并通过在测量区域中输入 40 个体素的值来调整参考 ROI 的大小。通过 ROICrosshair 精确定义感兴趣的区域。在图像图中，选择 Data normalization（数据标准化），然后单击 Apply（应用）以使用配置的设置执行染料分离。
   5. 打开这个新生成的文件，将两个通道分开，并从三维图像系列（最大强度投影）中生成二维投影图像，用于数据可视化。
   6. 在 Process（处理 ）窗口中，选择 Crop（裁剪 ）以将通道分成两个单独的文件，即 CH1 和 CH2（或 FRET）通道。
   7. 在“处理”窗口中，选择“合并图像”，选择 CH2 文件并将其插入到第一个选项中，然后选择 CH1 文件并将其插入到第二个选项中。设置因子为 5 的重新缩放，然后选择 Ratio作。然后，单击 Apply 生成包含比率图像 （YFP/CFP） 的新文件。保存文件以进行后续数据分析。
4. FRET信号和图像渲染的定量分析（第5-6天）（图2D）
   1. 对于来自 FRET/CFP 比率图像的 FRET 信号的定量测量，根据基于预期效果的 先验 统计评估，对 N>2 个胚胎（重复）进行实验。使用图像处理包，例如开源软件 Fiji。将从光谱成像和染料分离获得的图像文件导入到图像分析包中，例如开源 Fiji。
   2. 在开始对原浆图像进行 ROI 选择之前，使用 Analyze 函数 |设置测量 | 选择感兴趣的参数，例如 Area、Integrated density 和 Mean gray value。
   3. 使用工具栏中的多边形选择工具选择感兴趣的区域（在本特定研究中：原肠的边缘）。通过单击 Analyze |工具 |ROI 管理器。
   4. 要在选定的 ROI 中执行测量，请单击 Analyze |测量。对每个 ROI 和图像/条件重复这些步骤。
      注意：如果需要，请将图像另存为 。TIFF 格式。可以将来自多个图像的所有 ROI 测量值保存为一个 ROI 文件。使用相对于每个样本/图像的正确名称重命名 ROI 管理器列表中的每个度量。
   5. 对于每个条件（此处的突变体和突变体 + 处理），提取获得的每个选定 ROI 的所有 FRET/CFP 比率值，并通过组织例如，将实验组组织在列中，将每个原始值组织在行中。
   6. 使用任何合适的软件来评估不同实验条件下 FRET 信号的统计差异，并用于图形生成和数据可视化。
      注意：开源和许可软件可用于数据分析和绘图解决方案。
   7. 组织一个特定的统计评估项目，考虑所有原始测量值和每个实验条件的重复次数。对于单个生物仿行的统计分析，请创建一个具有一个分组变量的列表，每个组由一列定义。对于多个生物重复的统计分析，请创建至少具有两个分组变量的分组表，一个由列定义（例如，实验条件），另一个由行定义（例如，重复的平均值）。
   8. 在工作表中适当安排实验组后，评估数据分布（正态性检验，例如 D'Agostino-Pearson、Anderson-Darling）并根据结果选择最合适的统计检验。
      1. 对参数数据（服从高斯分布）执行单因子方差分析，对非参数数据执行 Kruskal-Wallis 检验。如果存在更多因素（遗传和药物浓度），请考虑使用双向方差分析。将每个条件的平均 FRET 值相互比较（多重比较），并使用 事后 检验（例如，分别用于参数和非参数数据的 Tukey 检验和 Dunn 检验）校正多重比较。

3. FRET 结果的 IHC 验证和原肠胚形成缺陷的相关形态测量分析

1. 针对 tERK 和 pERK 的 IHC 溶液的制备和胚胎固定和安装（第 7 天）（图 3A）
   1. 准备 IHC 所需的工作溶液。
      1. 通过将 80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na₂HPO₄ 和 2.4 g KH₂PO₄ 溶解在 1 L DD 水中，制备 10x PBS 的储备溶液。高压灭菌溶液以保持无菌。
      2. 通过将 8 mL 的 10% Triton X-100 溶解在最终体积为 100 mL 的 1x PBS 中，制备 0.8% PBS-Triton （PBSTr） 溶液。
      3. 通过分别稀释 3 mL、7.5 mL 和 12 mL 的 100% 甘油，制备 20%、50% 和 80% 甘油溶液，最终体积为 15 mL 的 1x PBS。
   2. 通过将 2.5 mL 的 16% PFA 混合在 250 μL 的 10% Triton X-100 中，制备 4% 多聚甲醛 （PFA）/0.25% PBSTr（固定液），该溶液先前溶解在终体积为 10 mL 的 1x PBS 中。使用该解决方案在 4 °C 下以 6 hpf 固定胚胎过夜。 使用 2 mL 试管，每管最多 5 个胚胎，以实现高效固定和洗涤。
      注：建议为每轮固定准备新鲜的固定剂。注意：处理 16 的甲醛时，请穿戴个人防护装备 （PPE） 并戴在化学罩下。
   3. 用 1.5 mL 的 0.8% PBSTr 填充试管几次，洗涤 2 mL 试管中的胚胎。将胚胎转移到新的 2 mL 试管中，并将胚胎储存在 1x PBS 中直至使用。
      注意：如果不熟悉早期斑马鱼胚胎的处理，请在立体显微镜下工作，以避免移液过程中胚胎丢失。使用“低结合”塑料器皿来减少胚胎对管壁的可能粘性。
2. 针对 pERK 和 tERK 的组织透化和 IHC（第 7-9 天）
   注意：IHC 结果取决于多个变量，这些变量可能因实验室而异，因此可能需要对方案进行特定优化。
   1. 在 RT 下，在 1 mL 的 0.8% PBSTr 中洗涤固定的斑马鱼胚胎 3 x 10 分钟。
   2. 在 RT 下，用 2 μL 蛋白酶 K 在 0.8% PBSTr （1：1,000） 中稀释 2 分钟，透化样品。
   3. 通过在 1 mL 的 0.8% PBSTr 中洗涤样品 3 x 10 分钟来终止组织的透化，并在室温下将样品后固定在 500 μL 的 4% PFA/1x PBS 中 20 分钟。然后，在 1 mL 的 0.8% PBSTr 中洗涤样品 3 x 10 分钟。
      注：用于组织透化的方法和时间是关键步骤，可能受抗原类型、组织保存质量和环境因素的影响。在将实验步骤应用于珍贵样品之前对其进行优化。
   4. 用含有 5% 正常山羊血清 （NGS）、1% 牛血清白蛋白 （BSA）、1% DMSO 的 1x 封闭缓冲液 （BB） 孵育样品，制备方法如下：75 μL 100% NGS、150 μL 10% BSA 和 15 μL 100% DMSO，终体积为 1.5 mL 0.8% PBSTr。每管使用 200 μL 溶液，并在溶液中在 RT 下孵育胚胎 20-30 分钟。
   5. 从上一步中取出 1x BB，并在含有所需一抗混合物的溶液中孵育样品（此处：稀释 1 μL 小鼠一抗 p44/42 MAPK、总 ERK、tERK，+ 1 μL 兔多克隆磷酸化-p44/42 MAPK、磷酸化 ERK、pERK）在 250 μL 新鲜制备的 1x BB 溶液中。每管使用 200 μL 溶液，并将胚胎在 20 °C 的溶液中孵育过夜。
   6. 为了消除非特异性结合，用 1 mL 的 0.8% PBSTr 洗涤样品数次（先每 10 分钟洗涤一次，然后每 30 分钟洗涤一次）。
   7. 将样品在新鲜制备的 1x BB 中在 RT 下孵育 20 分钟。每管使用 200 μL。
   8. 从上一步中取出 1x BB，并将样品与二抗混合物（1 μL 荧光 488 偶联山羊抗小鼠，+ 1 μL 荧光偶联 633 山羊抗兔在 600 μL 1x BB 溶液中）。让胚胎在 20 °C 下轻轻摇动过夜。
      注意：我们对来自同一批次的阴性（非转基因） 青少年 鱼进行了 IHC，用于 FRET 成像。或者，也可以使用 Teen⁺ 鱼，但在这种情况下，应改用与荧光团偶联的二抗，这些荧光团与 CFP 或 YFP 的发射光谱不重叠。
   9. 如上所述消除非特异性结合。
   10. 在室温下，用甘油/1x PBS 溶液（20%、50%、80%）的梯度洗涤样品，每种溶液 15 分钟。将样品储存在 4 °C 的 90% 甘油/1x PBS 中。
       注：为了最大限度地减少可能的荧光衰减，请将样品存放在黑暗中。
3. 免疫染色组织的共聚焦显微镜检查和定量分析（第 10-11 天）（图 3B-E）
   1. 如前所述安装胚胎。
   2. 将共聚焦显微镜采集参数设置如下：80% 的白色激光，荧光偶联山羊抗小鼠的荧光发射范围为 507 - 551 nm（在这种情况下，发射光谱为 488 nm，用于 tERK），荧光偶联山羊抗兔为 644 - 740 nm（在这种情况下，发射光谱为 633 nm，用于 pERK）。选择顺序采集模式、512 x 512 像素的格式扫描和 400 Hz 的速度。使用 4 - 5 μm 的 z 步长尺寸和 1 的标准数字变焦定义扫描的开始和结束。使用水浸 25 倍物镜（数值孔径为 0.05）以 6 hpf 采集整个原肠胚
      注意：该协议包括使用可能有害的激光;因此，需要根据国家的具体要求进行人员培训。
   3. 共聚焦图像采集后，检查使用图像处理包（如开源软件 Fiji）获得的原始图像文件。
      1. 在斐济，使用菜单图像和子菜单颜色中的命令分割通道来获取单通道图像（总 ERK：通道 = 0，C = 0;pERK：通道 = 1，C = 1），并通过单击图像 |堆栈 |Z 项目。
      2. 如前所述重复 ROI 强度测量过程，并将数据提取到工作表中。
      3. 为了推断实验组之间所需 ROI 中的 p-ERK 信号强度变化，通过将 p-ERK 染色的原始积分密度值除以 t-ERK 信号的原始积分密度来计算 p-ERK/t-ERK 比率。继续进行第 2.4 步中的统计显着性评估。
         注意：成像参数的设置可以根据具体需要进行修改，并考虑每个样品的持续时间、所需的图像质量以及要采集的平面数。
4. 11 个 hpf 胚胎的轴测量（第 4 天用于胚胎固定，第 12 天用于数据采集和分析）（图 4A-D）
   1. 在原肠胚形成结束时 （11 hpf），在 RT 下用 4% PFA 的 1x PBS 溶液固定胚胎 20 分钟，在 1x PBS 中洗涤数次，并在 4 °C 下储存直至图像采集。
   2. 使用巴斯德移液管在含有新鲜 1x PBS 的 12 孔板的单个孔中横向定位胚胎。
   3. 为了评估椭圆形（Y/X 胚胎轴比> 1）、斑马鱼特征性 Rasopathy 表型的存在以及由于治疗效果而对胚胎轴比率的形态学拯救，使用具有 3.4 倍放大倍率物镜（0.63 倍扫描物镜 x 8.60 缩放因子）的立体显微镜获取整个胚胎的图像，只需在 明场模式下捕获图像。
   4. 将图像文件导入到图像分析包中，例如开源 Fiji。
      1. 通过从工具栏中选择 直线工具 并单击 Analyze |测量。执行选定的测量后，将它们添加到 ROI 管理器列表中，并按照上述 FRET 成像分析的说明保存 ROI 文件。
         注意：对每个胚胎图像重复这些步骤。
   5. 继续在工作表中导出数据，并通过将长轴的长度 （y） 除以短轴的长度 （x） 来计算轴比率。计算不同仿行的均值、均值的标准差或均值的标准误。
   6. 按照步骤 2.4 进行统计数据分析。

结果

该协议展示了一个简单的工作流程，可以在斑马鱼胚胎中快速生成瞬时 RASopathy 模型，并使用应用于最近建立的 ERK 斑马鱼传感器的标准活 FRET 成像方法评估早期突变体中的 ERK 波动 ^6,9。正如最近显示的 ^6,7 在同一实验工作流程中，FRET 结果可以通过标准 IHC 对全胚胎的磷酸化和总 ERK ?...

讨论

尽管经过数十年的研究和无数突变导致现在绘制了高度异质性的 RASopathies，但对未确诊患者的测序工作中继续出现意义未知的遗传变异。事实上，在许多情况下，仅基于临床特征的诊断可能具有挑战性，验证测序结果的功能性基因组方法仍然至关重要。此外，尽管一些可用的抗癌分子（即 MEK 抑制剂）被提议用于治疗 RASopathies 的一个子集，并且一些成功案例开始出现，但...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Mini-sub Cell GT Horiziontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1704406	Gel Elecrophoresis
PC-100 Vertical puller	Narishige	-	Needle puller
PowerPac Universal Power Supply	Bio-Rad	1645070	Gel Elecrophoresis
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Confocal microscope
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Plasmid preparation
Softwares
Biorender	Biorender	CC-BY 4.0 license	Cartoon elaboration for Figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Data analyses
Fiji software	ImageJ	15.3t	Imaging rendering and quantitative analyses (FRET signals measurements, ERK fluorescence intensity in IHC assay, embryo axes lenght)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Statistical data analyses
iControl spectrophotometer software	Tecan	v. 2.0	RNA quantification
Illustrator	Adobe	26.0.3 (64-bit)	Figure assembling
LASX software	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Imaging acquisition for spectral FRET experiments and embryo imaging for axes lenght measurements
Q9 Mini 18.02-SN software	Uvitec	-	Gel image acquisition