טיפול בסרטן פוטותרמי פלזמוני: פנטומים המחקים רקמת גידול משובצים בננו-חלקיקים להמחשת התפלגות טמפרטורה פוטותרמית

Summary

מאמר זה מציג את הפרוטוקול להכנת פנטומים של רקמת גידול המשכפלים תכונות אופטיות לטיפול פוטותרמי פלזמוני. הוא מפרט הכנת פנטום, הערכות פוטותרמיות ואימות המודל המספרי שפותח המבוסס על מדידות טמפרטורה פוטותרמיות להערכת פרמטרים טיפוליים, ומציע אלטרנטיבה אתית וחסכונית למחקרי in vivo לבדיקות ראשוניות.

Abstract

טיפול פוטותרמי פלזמוני (PPTT), טיפול מתפתח בסרטן, כולל העברת ננו-חלקיקים (NPs) לגידול, ואחריו הקרנת אינפרא אדום קרוב (NIR) ליצירת חום מקומי שהורס תאים סרטניים. לפני מתן PPTT, יש להעריך את הפרמטרים הטיפוליים - ריכוז NP, עוצמת הקרנה ומשך הזמן. לשם כך מבוצעות סימולציות מספריות. עם זאת, כדי להבטיח חישוב חזק, יש לאמת סימולציות אלה באמצעות ניסויים פוטותרמיים על פנטומים המחקים רקמת גידול המשכפלים את התכונות האופטיות של רקמת הגידול. עבור PPTT, הפרמטרים הטיפוליים נשלטים על ידי פיזור וספיגה של קרינה על ידי הרקמה וה-NPs. לכן, ניתן לבצע ניסויי תיקוף על פנטומים המחקים את מקדם הפיזור המופחת (μ_s') ומקדם הספיגה (μ_a) של הגידול/רקמת המטרה.

באופן ספציפי, פרוטוקול זה מספק הוראות להכנת פנטומים המחקים μ_s ו-μ _של גידול שד המוזרק עם ננו-מוטות זהב, מוקף ברקמת שד רגילה. הפרוטוקול מפרט גם קרינת NIR, ניטור טמפרטורה ואימות תוצאות מספריות על ידי השוואת טמפרטורות מרחביות-זמניות לאלו שנמדדו באמצעות צמדים תרמיים. הפרוטוקולים שהוצגו במחקר זה אפשרו הכנת פנטומים גליליים של רקמת גידול שד מבוססי הידרוג'ל עם ממדים (φ40 x 12 מ"מ) ואזור גידול מרכזי (φ20 x 6 מ"מ), המורכב מ-1% אגרוז כמטריצת הבסיס ותוך ליפיד כמרכיב הפיזור ואזור הגידול המשובץ בננו-מוטות זהב בריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל. תוצאות מייצגות ממחקר מקרה ממחישות את היישום של פנטומים מפוברקים לאימות סימולציות מספריות עבור PPTT. המחקר מסכם כי הפרוטוקולים המודגמים הם בעלי ערך לביצוע ניסויים פוטותרמיים שמטרתם לייעל ולתכנן פרמטרים טיפוליים לפני ניסויים in vivo ולאמת סימולציות מספריות עבור PPTT.

Introduction

טיפול פוטותרמי פלזמוני (PPTT) הוא שיטת טיפול מקומית מתפתחת בסרטן הכוללת העברת ננו-חלקיקים (NPs) לאתר הגידול, ולאחר מכן הקרנה עם קרינה קרובה לאינפרא אדום (NIR). ה-NPs ניתנים בדרך כלל באמצעות נתיבים תוך-גידוליים (IT) או תוך ורידיים (IV)¹. עם הקרנת NIR, האינטראקציה הפלזמונית של הקרינה המתרחשת ו-NPs מובילה ליצירת חום מקומי על פני השטח של ה-NPs, אשר לאחר מכן מתפזר לרקמת הגידול שמסביב ^2,3. חימום מקומי זה מעלה את הטמפרטורה באזור הגידול, מה שמוביל למוות של תאים סרטניים באמצעות אבלציה תרמית ^4,5. ניתן להשיג טיפול יעיל בסרטן על ידי שמירה על טמפרטורות ספציפיות, כגון 46 מעלות צלזיוס למשך שעה^ו-6, 50-52 מעלות צלזיוס למשך 4-6 דקות⁷, או 60 מעלות צלזיוס לנזק מיידי⁸ באמצעות תהליכים ביולוגיים שונים.

חומרים פוטותרמיים שונים נחקרו ודווחו ליישום טיפול פוטותרמי, ויעילותם הטיפולית הוערכה באמצעות מחקרי מבחנה או in vivo . חומרים אלה כוללים חומרים אורגניים⁹ כגון צבעי אינפרא אדום קרוב (למשל, Indocyanine Green, IR780, IR820), חומרים פוטותרמיים מבוססי פולימרים (למשל, פולידופמין), וחומרים אנאורגניים¹⁰, כולל NPs מבוססי מתכת אצילית או NPs פלזמוניים (למשל, NPs זהב)¹¹, גופרית/תחמוצות מתכת מעבר¹² ו-MXenes¹³. בין אלה, NPs פלזמוניים, במיוחד NPs זהב, מציעים מספר יתרונות על פני חומרים פוטותרמיים מסורתיים (למשל, צבעים), כגון יציבות פוטותרמית טובה יותר, יעילות המרה פוטותרמית גבוהה יותר ותגובה פלזמונית ניתנת לכוונון באמצעות וריאציות צורה וגודל¹⁰. תכונות אלה הופכות את ה-NPs הזהב למועמדים אידיאליים לטיפול פוטותרמי, כאשר חלקם עוברים כעת ניסויים קליניים¹⁴.

כדי לייעל את היעילות הטיפולית ולהבטיח נזק תרמי מספיק לגידול במהלך PPTT, חיוני להעריך פרמטרים טיפוליים כגון מינון NP (במונחים של ריכוז) ופרמטרים של קרינת NIR (כולל עוצמת הקרינה ומשך ההקרנה) לפני היישום הפרה-קליני/קליני של PPTT. סימולציות מספריות משמשות בדרך כלל לקביעת פרמטרים אלה. שיטות מספריות שונות פותחו כדי להעריך נזק תרמי בתוך רקמת הגידול, כאשר שיטת בולצמן הסריג היא גישה כזו^15,16. עם זאת, כדי שהסימולציות הללו יהיו אמינות, יש לאמת אותן באמצעות אנלוגים של רקמות הידועים כפאנטומים מחקי רקמות. ניתן להכין פנטומים אלה כדי לשכפל את התכונות האופטיות, התרמיות, הביולוגיות או המכניות של רקמות אמיתיות, ולשמש כתחליפים לביצוע בדיקות ראשוניות, הערכת טיפול ואימות של מכשירים, חומרים או שיטות שפותחו לאחרונה המיועדים ליישומים ביולוגיים^17,18. זה יכול להפחית סבל מיותר של בעלי חיים או נבדקים אנושיים ולטפל בחששות אתיים הקשורים לניסויים כאלה^19,20.

התכנון והייצור של פנטום תלויים ביישום המיועד²¹. לדוגמה, במהלך פוטותרפיה כמו PPTT, מינון הקרינה המתרחשת מושפע מכמות האור הנספגת או מתפזרת על ידי ה-NPs והרקמות^22,23. לכן, פנטומים אופטיים המחקים את התכונות האופטיות, במיוחד מקדם הפיזור המופחת (μ_s^') ומקדם הספיגה (μ_a) של רקמות ביולוגיות, משמשים להערכות PPTT ואימות לאחר מכן של סימולציות מספריות^24,25. פנטומים אופטיים מורכבים בדרך כלל משלושה מרכיבים עיקריים: מטריצת בסיס, חומרי פיזור וחומרי ספיגה^17,26. מטריצת הבסיס מחזיקה את רכיבי הפיזור והקליטה בריכוזים מתאימים כדי לשכפל את התכונות האופטיות הרצויות. ניתן לסווג פנטומים אלה לפנטומים מוצקים, נוזליים וחצי מוצקים (הידרוג'ל), בהתאם לסוג מטריצת הבסיס. עבור מחקרים טיפוליים תרמיים כמו PPTT, פנטומי הידרוג'ל, במיוחד פנטומים מבוססי אגרוז, מועדפים בשל התאימות הביולוגית שלהם, הפיזור והספיגה האינהרנטיים הזניחים, תהליך הייצור הפשוט והגמישות ליציקה לצורות וגדלים רצויים המתאימים לגיאומטריות הגידול^19,22. והכי חשוב, ניתן להשתמש בפנטומים המוכנים על בסיס אגרוז עד ~70-80 מעלות צלזיוס בטמפרטורות בתפזורת, שכן טמפרטורת ההיתוך של פנטומים מסוג אגרוז היא ~80 מעלות צלזיוס¹⁹. עבור PPTT, מכיוון שטווח טמפרטורות של ~50-80 מעלות צלזיוס מספיק, ניתן להשתמש בפאנטומים מבוססי אגרוז כאלה להערכות פוטותרמיות מבוססות PPTT.

פנטומים שונים המחקים רקמות מבוססי הידרוג'ל פותחו ודווחו ליישומים שונים. מוסטרי ועמיתיו פיתחו פנטומים מחקי רקמות מבוססי אגרוז והדגימו את התועלת שלהם באימות מערכת אופטית חדשה^{שתוכננה 18}. במחקר אחר, הוכנו פנטומים תרמוכרומיים המחקים רקמות כדי למדוד את היקף הנזק התרמי במהלך טיפול באולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HIFU)²⁷. פנטומים מחקי רקמות מבוססי פוליאקרילאמיד הוכנו גם כדי לנתח את אפקט הקוויטציה במהלך טיפול בסרטן מבוסס HIFU²⁸. מטרת מחקר זה היא להדגים שיטה שלב אחר שלב לייצור פנטומים המחקים רקמת גידול יחד עם הפרוטוקול לניסויים פוטותרמיים מבוססי פנטום להערכות PPTT. פרוטוקול מפורט מוצע זה נועד לקדם את האימוץ והשחזור של הכנת הפנטום ושיטות ניסוי פוטותרמיות מבוססות פנטום לאחר מכן לבדיקת הביצועים הפוטותרמיים של ננו-מבנים שפותחו לאחרונה, ובכך לאמת את הסימולציות המספריות ולסייע בתכנון או אופטימיזציה של פרמטרים טיפוליים של PPTT. מאמר זה מתאר פרוטוקול הכנת פנטום שתוכנן במיוחד עבור גידולי שד תת-קרקעיים; עם זאת, ניתן להתאים את אותם שלבים לייצור סוגים שונים של רקמות גידול (בצורות וגדלים שונים) על ידי שינוי הרכב חומרי הספיגה והפיזור האופטיים. כדוגמה, ההערכות הפוטותרמיות המודגמות המחקות רקמות מבוססות פנטום שימשו במחקרים שדווחו בעבר כדי לאמת סימולציות PPTT עבור גידול זרוע תת-קרקעי²⁴, IDC^{תת-קרקעי 25} וגידולי עור²⁹.

מאמר זה מתאר את שלבי ההכנה של פנטום אופטי המחקה את μ של גידול שד תת-קרקעי או תת עורי, במיוחד קרצינומה דוקטלית פולשנית (IDC), הממוקמת 3 מ"מ מתחת לפני העור ומוקפת ברקמת שד רגילה. הפנטום הוא בעל גיאומטריה גלילית שהוכנה באמצעות אגרוז כמטריצת בסיס ותוך ליפיד (IL) כחומר הפיזור שנוסף בריכוזים מתאימים כדי לחקות μ_של רקמת שד תקינה וסרטנית. אגרוז, הידרוג'ל שקוף עם פיזור וספיגה זניחים, הוא מטריצת בסיס אידיאלית עבור פנטומים אופטיים^18,30. יתר על כן, IL, תחליב של 20% שומן המחקה את המבנה הדו-שכבתי של קרומי התאים, נמצא בשימוש נרחב כחומר פיזור^31,32 ונבחר למחקר זה כדי לשכפל את μ של רקמת שד תקינה וסרטנית. הפנטום נועד לחקות גידול שד (IDC) המוזרק עם ננו-מוטות זהב (AuNRs) כ-NPs פלזמוניים, מוקף ברקמת שד רגילה ללא AuNRs. מבין NPs זהב שונים המשמשים ב-PPTT, נבחרו AuNRs למחקר זה בשל התגובה הפלזמונית החזקה שלהם באזור ה-NIR והשימוש הנרחב בהם במחקרי PPTT פרה-קליניים, כולל אלה הכוללים חולי כלבים וחתולים¹⁴. הפרוטוקול מדגים הכנה של שני סוגים של פנטומים: האחד עם גידול עם התפלגות AuNR כפי שניתן לראות בהזרקה לווריד והשני עם גידול המשקף את התפלגות ה-AuNR שהושגה באמצעות הזרקת IT. בעקבות פרוטוקול הכנת הפנטום, מתוארים מערך הניסוי להקרנת NIR והשלבים לביצוע הערכות פוטותרמיות על הפאנטומים. לבסוף, ניתן מדריך שלב אחר שלב לפירוש תוצאות התפלגות הטמפרטורה המתקבלות מהערכות אלו ולהשוואת נתוני ניסוי עם תוצאות סימולציה מספרית. השוואה זו מסייעת לאמת שיטה מספרית מפותחת, המאפשרת כוונון לפרמטרי טיפול אופטימליים המותאמים במיוחד לגידול.

Protocol

הערה: הפאנטומים הוכנו באמצעות אגרוז ותוך ליפידים על סמך קומפוזיציות שדווחו בספרות כדי להשיג את התכונות האופטיות הרצויות. לא נעשה שימוש ברקמה ביולוגית אמיתית של חולים או גופות. לכן, הכנת הרפאים הללו חפה ממגבלות אתיות ואינה דורשת הסכמה מדעת.

1. בחירה או ייצור של תבנית מתאימה

1. . בחירת תבנית מתאימה
   1. בחרו תבנית התואמת את הצורה והמידות הרצויות לפאנטומים. עבור פנטומים גליליים עם אזור גידול המפוזר באופן אחיד עם NPs ומוקף ברקמה נורמלית, השתמשו בצלחת פטרי מזכוכית ובכוס קטנה כתבנית⁸ (איור 1A).
      הערה: שלבים אלה מיועדים להכנת פנטומים המחקים רקמת גידול בגיאומטריה גלילית. עבור צורות או גדלים אחרים, בחר תבנית מתאימה. אם תבנית מתאימה אינה זמינה, יש לייצר תבנית באמצעות הדפסה תלת מימדית (תלת מימד), כמפורט בשלב 1.2.
2. ייצור עובש על ידי הדפסת תלת מימד
   1. עצב מודל תלת מימד באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD) (למשל, SolidWorks, Autodesk Inventor או CATIA) בהתאם לצורה ולגודל הרצויים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, תכנן גליל חלול אחד (קוטר פנימי 40 מ"מ, עובי 2 מ"מ וגובה 12 מ"מ; ראה משלים file 1) ושתי תבניות מיסוך גליליות מוצקות (מידות φ20 x 6 מ"מ ו-φ14 x 3 מ"מ), כפי שמוצג באיור 1B.
      1. לעיצוב/שרטוט צילינדר חלול, בתוכנת CAD, צור שני עיגולים בקוטר של 40 מ"מ ו-44 מ"מ. לאחר מכן, הוצא את הגיאומטריה למשך 12 מ"מ.
      2. עבור תבניות מיסוך גליליות מוצקות, צור עיגולים בקוטר 20 מ"מ ו-14 מ"מ, ולאחר מכן הוצא ל-6 מ"מ ו-3 מ"מ, בהתאמה (ראה קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3). צייר מלבן (צדדים 44 מ"מ ו -5 מ"מ) בצד אחד של הגליל והוציא אותו ל -2 מ"מ.
   2. המר את דגמי התלת מימד לפורמט Gcode באמצעות תוכנה תואמת מדפסת תלת מימד (למשל, Cura) להדפסה.
   3. השתמש ב-Gcode זה כדי להדפיס את התבניות (למשל, כאן, באמצעות חומצה פולילקטית [PLA] φ1.75 מ"מ, 1 ק"ג של eSun) באמצעות מדפסת תלת מימד.
      הערה: המלבן נמשך כדי להשעות את תבניות המיסוך. ניתן לעצב ולייצר תבניות שונות להכנת פנטומים עם צורות רצויות אחרות.

2. הכנת תמיסות פנטום המחקות רקמות גידול²⁵

הערה: במחקר זה, פנטומים אופטיים מבוססי אגרוז בגיאומטריה גלילית המחקים רקמת גידול מוכנים להידמות לגידול שד תת-קרקעי המוזרק עם AuNRs, באמצעות הזרקת IT או IV, כפי שמוצג באיור 2. לפנטום ה-IT יש שני אזורים: אזור גידול מרכזי עם AuNRs ואזור רקמה נורמלי מסביב. לפנטום IV יש שלושה אזורים: אזור גידול עם AuNRs בפריפריה של הגידול, אזור גידול חשוף מרכזי ללא AuNRs ואזור רקמה תקינה מסביב. מכיוון שהתכונות האופטיות (μ_a ו-μ_s') שונות עבור גידול ורקמה נורמלית, מכינים פתרונות פנטום נפרדים לכל אזור בעל הרכבים שונים ונדון בנפרד.

1. הכנת תמיסת פנטום המדמה רקמת שד תקינה (פתרון 1)
   הערה: פתרון זה ישמש הן עבור פנטומים של IT והן עבור IV. שלבי ההכנה של פתרון 1 מוצגים באיור 3A.
   1. חשב את הנפח התיאורטי של התמיסה על סמך מידות התבנית.
      הערה: כאן, עבור התבנית הגלילית של φ40 x 12 מ"מ, הנפח המחושב הוא 15 ס"מ³ או 15 מ"ל לפנטום. מכיוון שצריך להכין שני פנטומים כאלה, הנפח הכולל הוא 15 מ"ל x 2, שהם 30 מ"ל. לכן, הכינו 35 מ"ל מהתמיסה כדי להסביר אידוי או שפיכה בשלב הכנת הפנטום.
   2. חשב את הכמות (משקל/ריכוז/נפח) של כל מרכיבי הפנטום - אגרוז (כחומר בסיס) ו- IL (כמרכיב פיזור) - שיש להוסיף לתמיסה של 35 מ"ל.
      1. הוסף 0.35 גרם אגרוז להכנת 35 מ"ל תמיסה המתאימה לריכוז של 1% w/v.
      2. להעריך את ריכוז IL המתאים μ רצוי של רקמת שד תקינה (כלומר, 10.1 ס"^{מ-1 33}) על סמך ריכוז IL לעומת נתוני μ_s הזמינים בספרות. לאחר מכן, חשב את נפח ה-IL (מלאי תחליב 20%) שיתווסף לתמיסת הפנטום באמצעות משוואה (1):
         (1)
         כאשר C₁ ו-V₁ הם ריכוז מלאי הריאגנטים (כאן 20% מלאי IL) ונפח תמיסת מלאי הריאגנטים שיש להוסיף (כאן יש לחשב), בהתאמה. C₂ הוא הריכוז הנדרש של המגיב (שיתקבל מהספרות) בפתרון העבודה הסופי, ו - V₂ הוא הנפח הכולל של פתרון העבודה הסופי (כאן, 35 מ"ל).
         הערה: כאן, עבור μ_של 10.1 ס"^מ-1, ריכוז ה-IL המוערך מהספרות המדווחת הוא 1.04%^34,35. באמצעות השלבים לעיל, נפח ה-IL (20% מלאי IL) שיתווסף הוא 1.82 מ"ל.
   3. שוקלים 0.35 גרם אגרוז ומוסיפים אותו ל-33.18 מ"ל מים נטולי יונים (DI) בכוס. מכסים את הכוס בנייר אלומיניום כדי למנוע אובדן מים.
   4. מחממים את הכוס המכילה את התמיסה על פלטה חמה בחום של 120 מעלות תוך כדי ערבוב עד שהתמיסה הופכת לשקופה.
   5. הורד את הטמפרטורה של הפלטה החמה ל 60 מעלות צלזיוס. לאחר 15 דקות מוסיפים 1.82 מ"ל IL תוך כדי ערבוב. שמור את התמיסה המתקבלת, תמיסה 1, תחת ערבוב בחום של 60 מעלות צלזיוס עד לשימוש (מוכן למזיגה).
      הערה: יש לשמור את תמיסת הפנטום בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס בתנאי ערבוב. אחרת, זה מוביל להתמצקות הפתרון.
2. הכנת תמיסת פנטום גידול משובצת AuNR (פתרון 2)
   הערה: פתרון זה ישמש הן עבור פנטומים של IT והן עבור IV. שלבי ההכנה של פתרון 2 מוצגים באיור 3B.
   1. חשב את נפח אזור הגידול שיש למלא (φ20 x 6 מ"מ).
      הערה: הנפח המשוער לשני פנטומים גידוליים כאלה הוא 3.8 מ"ל. אז, נפח התמיסה שיש להכין יהיה 4.5 מ"ל.
   2. חשב את כמות מרכיבי פנטום הגידול שיש להוסיף - אגרוז, IL ו- AuNRs - באמצעות שלבים דומים כפי שהוזכר בסעיף 2.1.
      1. הוסף 45 מ"ג להכנת 4.5 מ"ל תמיסה המתאימה לריכוז של 1% משקל/נפח.
      2. IL:μ_s' של גידול השד הוא 4.6 ס"^{מ-1 33} וכדי לחקות את אותו הדבר, ריכוז ה-IL המקביל הנדרש הוא 0.472%^34,35. לכן, הוסף 106.2 מיקרוליטר של IL מ-20% מלאי IL ל-4.5 מ"ל של תמיסת פנטום גידול.
      3. הריכוז הרצוי של AuNRs בפנטום הוא 25 מיקרוגרם/מ"ל. כדי להשיג את אותו הדבר, הוסף 3.21 מ"ל של תמיסת AuNRs (ריכוז מלאי: 35 מיקרוגרם/מ"ל) לתמיסת פנטום הגידול.
   3. מוסיפים 45 מ"ג אגרוז ל-1.18 מ"ל מי DI בכוס ומכסים אותה בנייר אלומיניום.
   4. מניחים את הכוס על צלחת חמה ומערבבים בחום של 120 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה הופכת שקופה.
   5. הפחיתו את טמפרטורת הפלטה החמה ל 60 מעלות צלזיוס והשאירו את התמיסה למשך 15 דקות.
   6. הוסף 106.2 מיקרוליטר של IL ו-3.21 מ"ל של תרחיף AuNR (35 מיקרוגרם/מ"ל) בתנאי ערבוב. שמור את התמיסה המתקבלת, תמיסה 2, תחת ערבוב בחום של 60 מעלות צלזיוס עד למזיגה.
3. הכנת תמיסת פנטום של גידול חשוף (ללא AuNRs) (פתרון 3)
   הערה: פתרון זה ישמש לפנטום IV בלבד. שלבי ההכנה של פתרון 2 מוצגים באיור 3C.
   1. חשב את הנפח התיאורטי של התרחיף שיש להוסיף ליצירת אזור גידול חשוף (~ φ20 x 6 מ"מ).
      הערה: הנפח המשוער של פנטומי גידול הוא 1.9 מ"ל. אז, נפח התמיסה שיש להכין יהיה 2.5 מ"ל.
   2. חשב את כמות מרכיבי פנטום הגידול שיש להוסיף - אגרוז ו- IL באמצעות שלבים דומים כפי שהוזכר בסעיף 2.1.
      1. הוסף 25 מ"ג אגרוז להכנת 2.5 מ"ל תמיסה כדי להשיג ריכוז של 1% משקל/נפח.
      2. IL:μ_s' של גידול השד הוא 4.6 ס"^{מ-1 33} וכדי לחקות את אותו הדבר, ריכוז ה-IL המקביל הנדרש הוא 0.472%^34,35. הוסף 59 מיקרוליטר של מלאי 20% IL.
   3. מוסיפים 25 מ"ג אגרוז ל-2.44 מ"ל מי DI בכוס ומכסים אותה בנייר אלומיניום.
   4. מניחים את הכוס על פלטה חמה ומערבבים בחום של 120 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה הופכת לשקופה.
   5. הפחיתו את טמפרטורת הפלטה החמה ל 60 מעלות צלזיוס והשאירו את התמיסה למשך 15 דקות.
   6. הוסף 59 מיקרוליטר IL לתמיסה בתנאי ערבוב. שמור את התמיסה המתקבלת, תמיסה 3, בתנאי ערבוב בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס עד למזיגה.

3. הכנת פנטום מחקה רקמת גידול 24,25,36

1. מכינים את התבניות לשלב המזיגה. לשם כך, אטמו את תחתית התבניות הגליליות בעזרת פרפילם והניחו את תבנית המיסוך (φ20 x 6 מ"מ) במרכז.
2. יוצקים את תמיסה 1 לתוך התבניות הגליליות עד לסימון העליון של תבנית המסיכה ומניחים לה להתמצק (איור 4A).
3. לאחר ההתמצקות, הסר את תבנית המיסוך כדי ליצור חלל לאזור הגידול (איור 4B).
   הערה: הפרוטוקול יהיה זהה הן עבור פנטומים של IT והן עבור IV עד לשלב 3.3. התהליך יידון בנפרד עבור פנטומים של IT ו-IV לאחר שלב 3.3.
4. פנטום IT 24,25,36
   1. מלאו את החלל בתמיסה 2 ואפשרו לו להתמצק (איור 4C).
   2. הוסף את פתרון 1 לחלק העליון של הפנטום ואפשר לו להתמצק לחלוטין (איור 4D).
5. פנטום IV^24,25
   1. הכנס תבנית מיסוך קטנה יותר (φ14 x 3 מ"מ) ומלא את החלל סביבה בתמיסה 2 (איור 4E).
   2. לאחר ההתמצקות, הסר את התבנית הקטנה יותר ומלא את החלל שנותר בתמיסה 3 (איור 4F).
   3. הוסף את פתרון 1 למעלה ואפשר התמצקות מלאה (איור 4G).

4. החדרת הצמדים התרמיים בתוך הפנטום 24,25,36

הערה: כדי לנטר את התפלגות הטמפרטורה המרחבית, צמדים תרמיים מסוג K מוכנסים בתוך הפנטום במיקומים רדיאליים (r) וציריים (z) שונים, כפי שמוצג באיור 2. עבור החדרת צמד תרמי במקומות מדויקים, נימי זכוכית משמשים כמדריכים להבטחת דיוק. מיקומי הצמד התרמי מסומנים כ-(r, z), כאשר נקודת האמצע על פני השטח העליונים של הגידול בעומק z = 3 מ"מ משמשת כנקודת ייחוס הן לפנטומים של IT והן ל-IV ומסומנת כ-(0, 3), כפי שמוצג באיור 2A,B. בעת בחירת מיקומים רדיאליים וציריים לכימות נזק תרמי באזור הגידול, המיקומים בפריפריה של הגידול (הן רדיאליים והן ציריים) הם קריטיים. השגת הטמפרטורות הנדרשות בנקודות היקפיות אלו במהלך הקרנת NIR מבטיחה אבלציה מלאה של הגידול. לפיכך, הצמדים התרמיים ממוקמים בנקודות קיצון רדיאליות (של הגידול) ב-z = 3 ו-9 מ"מ, כלומר (10, 3) ו-(10, 9), וצמד תרמי אחד ממוקם בממשק הגידול-רקמה ב-z = 9 מ"מ (מיקום צירי היקפי), כלומר, (0, 9) כפי שמתואר באיור 2A,B. בנוסף, כדי להעריך את התפלגות הטמפרטורה הצירית, מוכנס צמד תרמי בין מיקומים (0, 3) ו-(0, 9), המסומן כ-(0, 6). לבסוף, כדי להעריך את עליית הטמפרטורה באזור הרקמה הבריאה שמסביב, מוחדר צמד תרמי אחד ב-(15, 3).

1. חותכים את נימי הזכוכית לאורכים מתאימים כך שאלו יגיעו למיקומים הרדיאליים והציריים הרצויים בתוך הפנטום.
2. הכנס צמדים תרמיים בתוך נימי הזכוכית הללו ונקב במיקומי פנטום רדיאליים וציריים מוגדרים בזה אחר זה.
3. לאחר שכל הצמדים התרמיים נמצאים במקומם, הנח בזהירות את הפנטום בצלחת פטרי מזכוכית להקרנת NIR לאחר מכן, כפי שמוצג באיור 5A.

5. חשיפה לקרינת קרינה בלתי מייננת ומדידת טמפרטורות פוטותרמיות כתוצאה מכך³⁶

1. הנח את צלחת הפטרי מזכוכית המכילה את הפנטום (מוכנס עם צמדים תרמיים) כך שהאזור המרכזי של המשטח העליון של הפאנטום יהיה מאונך לקצה הסיב האופטי של מקור האור NIR, כפי שמתואר באיור 5A.
   הערה: ניתן לכוונן את קוטר האלומה על משטח הפנטום על ידי שינוי המרחק בין המשטח לקצה הסיב האופטי. כאן, נשמר מרחק של 9 מ"מ כדי להשיג קוטר קרן של 20 מ"מ, המכסה את אזור הגידול המרכזי.
2. חבר את מערכת רכישת הנתונים (DAQ) למחשב ופתח את תוכנת LabVIEW.
3. הפעל את מקור האור NIR (איור 5B) והפעל את כפתור התוכנה בו-זמנית כדי להקליט נתוני טמפרטורה בתחילת ההקרנה.
4. הקרינו את הפנטום למשך 20 דקות, ולאחר מכן כבו את מקור האור NIR והפסקו את ההקלטה.
5. התוויית נתוני הטמפרטורה המוקלטת לעומת נתוני הזמן.

6. השוואת טמפרטורה עם תוצאות סימולציה ^24,25

הערה: ניסויים חוזרים על עצמם בדרך כלל, והטמפרטורות נרשמות במרווחי זמן מוגדרים בכל מיקומי הצמד התרמי. לצורך אימות, השלבים הבאים מתבצעים:

1. חשב את הממוצע וסטיית התקן של טמפרטורות הניסוי בכל מיקומי הצמד התרמי (r, z).
2. חשב טמפרטורות במיקומי צמד תרמי נחשבים מבחינה מספרית.
3. תרשים הטמפרטורה הממוצעת שהתקבלה מהניסויים והטמפרטורה שהושגה על ידי סימולציה בכל מיקומי הצמד התרמי ביחס לזמן, מוצג באיור 6.
4. חשב את השגיאה הריבועית הממוצעת (RMSE) והשגיאה המוחלטת הממוצעת (MAE) עבור כל מיקומי הצמד התרמי כדי לכמת את ההבדל בטמפרטורה כדי להעריך את האימות, כפי שמוצג בטבלה 1.
   הערה: MAE ו-RMSE מחושבים באמצעות משוואות 2 ו-3, בהתאמה.
   (2)
   (3)
   כאשר TE, TS ו-N הם הטמפרטורה המתקבלת בניסוי, הטמפרטורה מחושבת מספרית ומספר נקודות הנתונים (כאן, הטמפרטורות נרשמות בכל שנייה למשך 20 דקות; מכאן, = 1,200), בהתאמה. אני מייצג רגעי זמן.

תוצאות

איור 6 מציג את הטמפרטורות הממוצעות הטמפורליות שהתקבלו במהלך ניסויים עם פנטום רקמת גידול משובץ AuNR בכל מיקומי הצמד התרמי, כפי שמוצג באיור 2, בהשוואה לטמפרטורות שהתקבלו במהלך סימולציות במיקומי צמד תרמי מתאימים. כאן, הניסוי?...

Discussion

מאמר זה מציג את הפרוטוקול להכנת פנטומים אופטיים המחקים רקמת גידול מבוססת אגרוז. הפאנטומים מתוכננים באופן שמחקה את התכונות האופטיות של גידול ורקמות נורמליות לשימוש בהם במחקרים ל-PPTT. במחקר זה, מודגש היישום של פנטומים אלה לאימות שיטות מספריות במהלך PPTT. השלב הקריטי ביותר בפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6	Base matrix for phantoms
Deionized (DI) water (18.2 MΩ)	NA	NA	Solvent for the preparation of phantom solutions
Gold nanorods (AuNRs)	Nanopartz	A12-10-808	Plasmonic nanoparticles
Intralipid (20% emulsion stock)	Sigma-Aldrich	68890-65-3	Scattering agent of phantoms
Parafilm	Parafilm M	380020	To seal the bottom of cylindrical mold
Polylactic acid filament	eSun	NA	Material for molds (1.75 mm dia wire)
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3D Printer	Creality	Ender-3	For printing molds
Data acquisition (DAQ) system	National Instruments	cDAQ-9171	For recording temperatures
DI water unit	Merck Millipore	Direct-Q3	For DI water
Hot plate with magnetic stirrer	IKA	C-MAG HS 4	For phantom solutions preparation
NIR light source	NA (In-house developed)	NA	For NIR irradiation of phantoms, (800/50 nm; Center wavelength: 800 nm, Bandwidth: 50 nm)
Optical Fiber (1/2" × 12")	Edmund Optics	38-659	For NIR irradiation of phantoms
Type K thermocouples	RS Components	RS Pro 397-1589	For temperature monitoring at various phantom locations during NIR irradiation
Weighing Balance	Wensar	PGB 200	For weighing agarose
Name of Software	Company	Catalog Number	Comments/Description
Autodesk Inventor 2021	Autodesk	NA	For mechanical designing of molds
Cura 5.7	Ultimaker	NA	For converting mechanical design to Gcode for 3D printing
Matlab R2024b	MathWorks	NA	For numerical simulations and temperature data plots
Name of Labwares used	Company	Catalog Number	Comments/Description
Beakers (50 mL)	Borosil	1000D12	For phantom solution preparations
Beakers (10 mL)	Borosil	1000006	For phantom solution preparations
Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf Research plus, 1-channel, variable	3123 000 063	For adding constituents into the phantom solution
Pipette (10-100 µL)	Eppendorf Research plus, 1-channel, variable	3123 000 047	For adding constituents into the phantom solution
Spatula	Borosil	LASC8888M06	For weighing agarose and demolding the phantoms from the molds
Tips (100-1000 µL)	Tarsons	521016	For adding constituents into the phantom solution
Tips (10-100 µL)	Tarsons	521010Y	For adding constituents into the phantom solution