Plasmonische photothermische Krebstherapie: Nanopartikel-eingebettete Tumorgewebe-imitierende Phantome zur Visualisierung der photothermischen Temperaturverteilung

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird das Protokoll zur Herstellung von Tumor-Gewebe-Phantomen vorgestellt, die optische Eigenschaften für die plasmonische photothermische Therapie replizieren. Es beschreibt die Phantompräparation, photothermische Bewertungen und die Validierung des entwickelten numerischen Modells auf der Grundlage photothermischer Temperaturmessungen zur Bewertung therapeutischer Parameter und bietet eine ethische, kostengünstige Alternative zu In-vivo-Studien für Vortests.

Zusammenfassung

Bei der plasmonischen photothermischen Therapie (PPTT), einer aufkommenden Krebsbehandlung, werden Nanopartikel (NPs) an einen Tumor abgegeben, gefolgt von Nahinfrarotbestrahlung (NIR), um lokale Wärme zu erzeugen, die Krebszellen zerstört. Vor der Verabreichung von PPTT müssen die therapeutischen Parameter -- NP-Konzentration, Bestrahlungsintensität und -dauer -- abgeschätzt werden. Dazu werden numerische Simulationen durchgeführt. Um jedoch eine robuste Berechnung zu gewährleisten, müssen diese Simulationen durch photothermische Experimente an Tumorgewebe nachahmenden Phantomen validiert werden, die die optischen Eigenschaften von Tumorgewebe nachahmen. Bei der PPTT werden die therapeutischen Parameter durch die Streuung und Absorption der einfallenden Strahlung durch das Gewebe und die NPs bestimmt. Daher können Validierungsexperimente an Phantomen durchgeführt werden, die den reduzierten Streukoeffizienten (μ_s') und Absorptionskoeffizienten (μ_a) des Zieltumors/-gewebes nachahmen.

Insbesondere enthält dieses Protokoll Anweisungen für die Herstellung von Phantomen, die μ s ' und μ_a von Brusttumoren nachahmen, die mit Goldnanostäbchen injiziert wurden und von normalem Brustgewebe umgeben sind. Das Protokoll beschreibt auch die NIR-Bestrahlung, die Temperaturüberwachung und die Validierung numerischer Ergebnisse durch den Vergleich von raumzeitlichen Temperaturen mit denen, die mit Thermoelementen gemessen werden. Die in dieser Studie vorgestellten Protokolle ermöglichten die Herstellung von Hydrogel-basierten zylindrischen Brusttumor-Gewebe-Phantomen mit Abmessungen (φ40 x 12 mm) und einer zentralen Tumorregion (φ20 x 6 mm), bestehend aus 1% Agarose als Basismatrix und Intralipid als Streubestandteil und Tumorregion, die mit Goldnanostäbchen bei einer Konzentration von 25 μg/ml eingebettet ist. Repräsentative Ergebnisse einer Fallstudie veranschaulichen die Anwendung von fabrizierten Phantomen zur Validierung numerischer Simulationen für PPTT. Die Studie kommt zu dem Schluss, dass die demonstrierten Protokolle wertvoll für die Durchführung photothermischer Experimente sind, die darauf abzielen, therapeutische Parameter vor in vivo-Experimenten zu optimieren und zu planen und numerische Simulationen für PPTT zu validieren.

Einleitung

Die plasmonische photothermische Therapie (PPTT) ist eine aufstrebende lokalisierte Krebsbehandlungsmethode, bei der Nanopartikel (NPs) an die Tumorstelle abgegeben werden, gefolgt von einer Bestrahlung mit Nahinfrarotstrahlung (NIR). Die NPs werden in der Regel über intratumorale (IT) oder intravenöse (IV) Wege verabreicht¹. Bei NIR-Bestrahlung führt die plasmonische Wechselwirkung der einfallenden Strahlung und der NPs zur Erzeugung von lokalisierter Wärme an der Oberfläche der NPs, die sich dann in das umgebende Tumorgewebe auflöst ^2,3. Diese lokale Erwärmung erhöht die Temperatur in der Tumorregion, was zum Absterben der Krebszellen durch thermische Ablation führt ^4,5. Eine wirksame Krebsbehandlung kann durch verschiedene biologische Prozesse erreicht werden, z. B. 46 ºC für 1 h⁶, 50-52 ºC für 4-6 min⁷ oder 60 ºC für sofortige Schäden⁸ durch verschiedene biologische Prozesse.

Verschiedene photothermische Wirkstoffe wurden für die Anwendung der photothermischen Therapie erforscht und berichtet, und ihre therapeutische Wirksamkeit wurde durch In-vitro - oder In-vivo-Studien bewertet. Zu diesen Mitteln gehören organische Materialien⁹ , wie z. B. Nahinfrarot-Farbstoffe (z. B. Indocyaningrün, IR780, IR820), photothermische Mittel auf Polymerbasis (z. B. Polydopamin) und anorganische Materialien¹⁰, einschließlich Edelmetall-basierter NPs oder plasmonischer NPs (z. B. Gold-NPs)¹¹, Übergangsmetallschwefel/-oxide¹² und MXene¹³. Unter diesen bieten plasmonische NPs, insbesondere Gold-NPs, mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen photothermischen Mitteln (z. B. Farbstoffen), wie z. B. eine bessere photothermische Stabilität, einen höheren photothermischen Umwandlungswirkungsgrad und eine einstellbare plasmonische Reaktion durch Form- und Größenvariationen¹⁰. Diese Eigenschaften machen Gold-NPs zu idealen Kandidaten für die photothermische Therapie, von denen einige derzeit klinische Studien durchlaufen¹⁴.

Um die therapeutische Wirksamkeit zu optimieren und eine ausreichende thermische Schädigung des Tumors während der PPTT zu gewährleisten, ist es wichtig, Behandlungsparameter wie die NP-Dosis (in Bezug auf die Konzentration) und die NIR-Strahlungsparameter (einschließlich Bestrahlungsintensität und -dauer) vor der präklinischen/klinischen Anwendung der PPTT abzuschätzen. Um diese Parameter zu ermitteln, werden in der Regel numerische Simulationen eingesetzt. Es wurden verschiedene numerische Methoden entwickelt, um thermische Schäden innerhalb von Tumorgewebe zu beurteilen, wobei die Gitter-Boltzmann-Methode ein solcher Ansatz ist^15,16. Damit diese Simulationen jedoch zuverlässig sind, müssen sie mit Hilfe von Gewebeanaloga validiert werden, die als gewebeähnliche Phantome bekannt sind. Diese Phantome können so präpariert werden, dass sie die optischen, thermischen, biologischen oder mechanischen Eigenschaften von echten Geweben replizieren und als Ersatz für die Durchführung von Vortests, Behandlungsbewertungen und Validierungen von neu entwickelten Geräten, Materialien oder Methoden dienen, die für biologische Anwendungen bestimmt sind^17,18. Dies kann unnötiges Leiden von Tieren oder Menschen verringern und ethische Bedenken ausräumen, die mit solchen Versuchen verbunden sind^19,20.

Die Konstruktion und Herstellung eines Phantoms hängt von der beabsichtigten Anwendung^{ab 21}. Bei Phototherapien wie PPTT wird beispielsweise die Dosis der einfallenden Strahlung durch die Menge an Licht beeinflusst, die von den NPs und Geweben absorbiert oder gestreut wird^22,23. Daher werden optische Phantome, die die optischen Eigenschaften, insbesondere den reduzierten Streukoeffizienten (μ_s^') und den Absorptionskoeffizienten (μ_a) biologischer Gewebe, nachahmen, für PPTT-Auswertungen und die anschließende Validierung numerischer Simulationen verwendet^24,25. Optische Phantome bestehen typischerweise aus drei Hauptbestandteilen: einer Basenmatrix, Streumitteln und Absorptionsmitteln^17,26. Die Basismatrix hält die Streu- und Absorptionskomponenten in geeigneten Konzentrationen, um die gewünschten optischen Eigenschaften zu replizieren. Diese Phantome können je nach Art der Basismatrix in feste, flüssige und halbfeste (Hydrogel) Phantome eingeteilt werden. Für thermisch-therapeutische Studien wie PPTT werden Hydrogel-Phantome, insbesondere Agarose-basierte Phantome, aufgrund ihrer Biokompatibilität, ihrer vernachlässigbaren inhärenten Streuung und Absorption, des einfachen Herstellungsprozesses und der Flexibilität, in die gewünschten Formen und Größen gegossen zu werden, die den Tumorgeometrien entsprechen, bevorzugt^19,22. Am wichtigsten ist, dass die vorbereiteten Phantome auf Agarosebasis bis zu ~70-80 ºC Bulk-Temperaturen verwendet werden können, da die Schmelztemperatur von Agarose-Phantomen ~80 ºC¹⁹ beträgt. Da für PPTT ein Temperaturbereich von ~50-80 ºC ausreichend ist, können solche Agarose-basierten Phantome für PPTT-basierte photothermische Auswertungen verwendet werden.

Verschiedene Hydrogel-basierte gewebeähnliche Phantome wurden für verschiedene Anwendungen entwickelt und berichtet. Mustari et al. entwickelten Agarose-basierte gewebeähnliche Phantome und demonstrierten deren Nutzen bei der Validierung eines neu entwickelten optischen Systems¹⁸. In einer anderen Studie wurden gewebeähnliche thermochrome Phantome hergestellt, um das Ausmaß der thermischen Schädigung während der hochintensiven fokussierten Ultraschalltherapie (HIFU) zu messen²⁷. Polyacrylamid-basierte gewebeähnliche Phantome wurden auch hergestellt, um den Kavitationseffekt während der HIFU-basierten Krebstherapie zu analysieren²⁸. Das Ziel dieser Studie ist es, eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Herstellung von Tumorgewebe-ähnlichen Phantomen zusammen mit dem Protokoll für phantombasierte photothermische Experimente für PPTT-Auswertungen zu demonstrieren. Dieses vorgeschlagene detaillierte Protokoll zielt darauf ab, die Akzeptanz und Reproduzierbarkeit der Phantompräparation und der nachfolgenden phantombasierten photothermischen Experimentiermethoden zum Testen der photothermischen Leistung neu entwickelter Nanostrukturen zu fördern, wodurch die numerischen Simulationen validiert und die Vorbehandlungsplanung oder Optimierung der therapeutischen Parameter von PPTT unterstützt werden. In diesem Artikel wird ein Phantompräparationsprotokoll beschrieben, das speziell für Brusttumoren unter der Oberfläche entwickelt wurde. Die gleichen Schritte können jedoch für die Herstellung verschiedener Tumorgewebetypen (unterschiedlicher Formen und Größen) angepasst werden, indem die Zusammensetzung der optischen Absorptions- und Streumittel verändert wird. Als Beispiel wurden die demonstrierten phantombasierten photothermischen Auswertungen in zuvor berichteten Studien eingesetzt, um PPTT-Simulationen für Unterarmtumoren²⁴, IDC²⁵ unter der Oberfläche und Hauttumoren²⁹ zu validieren.

Diese Arbeit beschreibt die Präparationsschritte eines optischen Phantoms, das die μ_s eines suboberflächen- oder subkutanen Brusttumors nachahmt, insbesondere des invasiven duktalen Karzinoms (IDC), das sich 3 mm unter der Hautoberfläche befindet und von normalem Brustgewebe umgeben ist. Das Phantom ist von zylindrischer Geometrie und wird unter Verwendung von Agarose als Basismatrix und Intralipid (IL) als Streumittel hergestellt, das in geeigneten Konzentrationen zugesetzt wird, um μ_s von normalem und krebsartigem Brustgewebe nachzuahmen. Agarose, ein transparentes Hydrogel mit vernachlässigbarer Streuung und Absorption, ist eine ideale Basismatrix für optische Phantome^18,30. Darüber hinaus wird IL, eine 20%ige Fettemulsion, die die Doppelschichtstruktur von Zellmembranen nachahmt, häufig als Streumittel^{verwendet 31,32} und wurde für diese Studie ausgewählt, um die μ_s von normalem und krebsartigem Brustgewebe zu replizieren. Das Phantom ist so konzipiert, dass es Brusttumore (IDC) nachahmt, die mit Goldnanostäbchen (AuNRs) als plasmonische NPs injiziert wurden, umgeben von normalem Brustgewebe ohne AuNRs. Unter den verschiedenen Gold-NPs, die in PPTT verwendet werden, wurden AuNRs aufgrund ihrer starken plasmonischen Reaktion im NIR-Bereich und ihrer weit verbreiteten Verwendung in präklinischen PPTT-Studien, einschließlich solcher mit Hunde- und Katzenpatienten, für diese Studie ausgewählt¹⁴. Das Protokoll demonstriert die Präparation von zwei Arten von Phantomen: eines mit einem Tumor mit AuNR-Verteilung, wie sie bei der IV-Injektion zu sehen ist, und der andere mit einem Tumor, der die AuNR-Verteilung widerspiegelt, die durch IT-Injektion erreicht wurde. Im Anschluss an das Phantompräparationsprotokoll werden der Versuchsaufbau für die NIR-Bestrahlung und die Schritte zur Durchführung photothermischer Auswertungen an den Phantomen beschrieben. Abschließend wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Interpretation der aus diesen Auswertungen gewonnenen Temperaturverteilungsergebnisse und zum Vergleich der experimentellen Daten mit numerischen Simulationsergebnissen gegeben. Dieser Vergleich hilft bei der Validierung einer entwickelten numerischen Methode, die es ermöglicht, optimale Behandlungsparameter zu finden, die speziell auf einen Tumor zugeschnitten sind.

Protokoll

HINWEIS: Die Phantome wurden unter Verwendung von Agarose und Intralipid auf der Grundlage von in der Literatur berichteten Zusammensetzungen hergestellt, um die gewünschten optischen Eigenschaften zu erzielen. Es wurde kein echtes biologisches Gewebe von Patienten oder Leichen verwendet. Daher ist die Herstellung dieser Phantome frei von ethischen Zwängen und erfordert keine informierte Einwilligung.

1. Auswahl bzw. Herstellung einer geeigneten Form

1. . Auswahl eines geeigneten Werkzeugs
   1. Wählen Sie eine Form, die der gewünschten Form und den gewünschten Abmessungen für die Phantome entspricht. Bei zylindrischen Phantomen mit einer Tumorregion, die gleichmäßig mit NPs verteilt und von normalem Gewebe umgeben ist, verwenden Sie eine Petrischale aus Glas und ein kleines Becherglas als Form⁸ (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Diese Schritte dienen zur Herstellung von Tumorgewebe-ähnlichen Phantomen in zylindrischer Geometrie. Wählen Sie für andere Formen oder Größen eine geeignete Form aus. Wenn keine geeignete Form verfügbar ist, stellen Sie eine im dreidimensionalen (3D) Druck her, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
2. Herstellung von Formen durch 3D-Druck
   1. Entwerfen Sie ein 3D-Modell mit CAD-Software (Computer-Aided Design) (z. B. SolidWorks, Autodesk Inventor oder CATIA) entsprechend der gewünschten Form und Größe. Um diesem Protokoll zu folgen, entwerfen Sie einen Hohlzylinder (Innendurchmesser 40 mm, Dicke 2 mm und Höhe 12 mm; siehe Zusatzdatei 1) und zwei massive zylindrische Abdeckformen (Abmessungen φ20 x 6 mm und φ14 x 3 mm), wie in Abbildung 1B gezeigt.
      1. Für die Konstruktion/Zeichnung von Hohlzylindern erstellen Sie in der CAD-Software zwei Kreise mit Durchmessern von 40 mm und 44 mm. Extrudieren Sie dann die Geometrie für 12 mm.
      2. Erstellen Sie für feste zylindrische Maskierungsformen Kreise mit den Durchmessern 20 mm und 14 mm und extrudieren Sie dann für 6 mm bzw. 3 mm (siehe Ergänzende Datei 2 und Ergänzende Datei 3). Zeichnen Sie ein Rechteck (Seiten 44 mm und 5 mm) auf einer Seite des Zylinders und extrudieren Sie es um 2 mm.
   2. Konvertieren Sie die 3D-Modelle mit einer 3D-Drucker-kompatiblen Software (z. B. Cura) in das Gcode-Format für den Druck.
   3. Verwenden Sie diesen Gcode, um die Formen (z. B. hierin unter Verwendung von Polymilchsäure [PLA] φ1,75 mm, 1 kg eSun) unter Verwendung eines 3D-Druckers zu drucken.
      HINWEIS: Das Rechteck wird gezeichnet, um die Maskierungsformen aufzuhängen. Es können verschiedene Formen entworfen und hergestellt werden, um Phantome mit anderen gewünschten Formen herzustellen.

2. Herstellung von Tumorgewebe imitierenden Phantomlösungen²⁵

HINWEIS: In dieser Studie wurden Agarose-basierte optische Phantome mit zylindrischer Geometrie, die Tumorgewebe nachahmen, so präpariert, dass sie einem Brusttumor unter der Oberfläche ähneln, der mittels IT- oder IV-Injektion mit AuNRs injiziert wurde, wie in Abbildung 2 gezeigt. Das IT-Phantom besteht aus zwei Regionen: einer zentralen Tumorregion mit AuNRs und einer umgebenden Region des Normalgewebes. Das IV-Phantom besteht aus drei Regionen: einer Tumorregion mit AuNRs an der Tumorperipherie, einer zentralen nackten Tumorregion ohne AuNRs und einer umgebenden Normalgewebsregion. Da sich die optischen Eigenschaften (μ_a und μ_s') für Tumor- und Normalgewebe unterscheiden, werden für jede Region mit unterschiedlicher Zusammensetzung separate Phantomlösungen hergestellt, die gesondert besprochen werden.

1. Herstellung einer Phantomlösung, die normales Brustgewebe nachahmt (Lösung 1)
   HINWEIS: Diese Lösung wird sowohl für IT- als auch für IV-Phantome verwendet. Die Vorbereitungsschritte von Lösung 1 sind in Abbildung 3A dargestellt.
   1. Berechnen Sie das theoretische Volumen der Lösung basierend auf den Abmessungen der Form.
      HINWEIS: Hier beträgt das berechnete Volumen für die zylindrische Form von φ40 x 12 mm 15 cm³ oder 15 mL pro Phantom. Da zwei solcher Phantome vorbereitet werden müssen, beträgt das Gesamtvolumen 15 mL x 2, was 30 mL entspricht. Bereiten Sie daher 35 ml der Lösung vor, um Verdunstung oder Verschüttung während des Phantomvorbereitungsschritts zu berücksichtigen.
   2. Berechnen Sie die Menge (Gewicht/Konzentration/Volumen) aller Phantombestandteile - Agarose (als Ausgangsmaterial) und IL (als Streubestandteil) -, die der 35-ml-Lösung zugesetzt werden sollen.
      1. Fügen Sie 0,35 g Agarose hinzu, um 35 ml Lösung herzustellen, die einer Konzentration von 1 % w/v entspricht.
      2. Schätzen Sie die IL-Konzentration, die den gewünschten μ_s normalem Brustgewebe (d. h. 10,1 ^{cm-1 33}) entspricht, basierend auf der IL-Konzentration im Vergleich zu μ in der Literatur verfügbaren Daten. Berechnen Sie als Nächstes das Volumen von IL (20 % Emulsionsmaterial), das der Phantomlösung mit Hilfe von Gleichung (1) zugesetzt werden soll:
         (1)
         Dabei sind C₁ und V₁ die Konzentration des Reagenzbestands (hier 20 % IL-Stamm) bzw. das Volumen der zuzugebenden Reagenzstammlösung (hier ist es zu berechnen). C₂ ist die erforderliche Konzentration des Reagenzes (aus der Literatur zu erhalten) in der endgültigen Arbeitslösung, und V₂ ist das Gesamtvolumen der endgültigen Arbeitslösung (hier 35 ml).
         HINWEIS: Hier beträgt die aus der Literatur geschätzte IL-Konzentration für μ_s' von 10,1 ^cm-1 1,04%^34,35. Mit den obigen Schritten beträgt das Volumen von IL (20% IL-Bestand), das hinzugefügt werden soll, 1,82 ml.
   3. Wiegen Sie 0,35 g Agarose und geben Sie sie zu 33,18 ml deionisiertem (DI) Wasser in einem Becherglas. Decken Sie den Becher mit Alufolie ab, um Wasserverlust zu vermeiden.
   4. Das Becherglas mit der Lösung auf einer heißen Platte auf einer heißen Platte bei 120 °C unter Rühren erhitzen, bis die Lösung durchsichtig wird.
   5. Senken Sie die Temperatur der Heizplatte auf 60 ºC. Nach 15 Minuten 1,82 mL IL unter Rühren hinzufügen. Die resultierende Lösung, Lösung 1, bis zur Verwendung (ausgießbereit) bei 60 ºC unter Rühren aufbewahren.
      HINWEIS: Die Phantomlösung bei 60 ºC muss unter Rührbedingungen aufbewahrt werden. Andernfalls führt es zur Verfestigung der Lösung.
2. Herstellung von AuNR-eingebetteter Tumorphantomlösung (Lösung 2)
   HINWEIS: Diese Lösung wird sowohl für IT- als auch für IV-Phantome verwendet. Die Vorbereitungsschritte von Lösung 2 sind in Abbildung 3B dargestellt.
   1. Berechnen Sie das Volumen der zu füllenden Tumorregion (φ20 x 6 mm).
      HINWEIS: Das ungefähre Volumen für zwei solcher Tumorphantome beträgt 3,8 ml. Das zu präparierende Lösungsvolumen beträgt also 4,5 ml.
   2. Berechnen Sie die Menge der hinzuzufügenden Tumorphantomkomponenten - Agarose, IL und AuNRs - unter Verwendung ähnlicher Schritte wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
      1. Fügen Sie 45 mg hinzu, um 4,5 ml Lösung herzustellen, was einer Konzentration von 1 % w/v entspricht.
      2. IL:μ_s' des Brusttumors beträgt 4,6 ^{cm-1 33} und um dies nachzuahmen, beträgt die entsprechende IL-Konzentration 0,472%^34,35. Fügen Sie daher 106,2 μl IL aus 20 % IL-Stamm zu 4,5 mL Tumorphantomlösung hinzu.
      3. Die gewünschte Konzentration von AuNRs im Phantom beträgt 25 μg/ml. Um dasselbe zu erreichen, geben Sie 3,21 mL AuNRs-Lösung (Stammkonzentration: 35 μg/mL) in die Tumorphantomlösung.
   3. Geben Sie 45 mg Agarose zu 1,18 mL DI-Wasser in ein Becherglas und decken Sie es mit einer Alufolie ab.
   4. Stellen Sie das Becherglas auf eine heiße Platte und rühren Sie bei 120 °C, bis die Lösung transparent wird.
   5. Reduzieren Sie die Temperatur der Heizplatte auf 60 ºC und lassen Sie die Lösung 15 Minuten einwirken.
   6. 106,2 μl IL und 3,21 mL AuNR-Suspension (35 μg/ml) unter Rührbedingungen zugeben. Lassen Sie die resultierende Lösung, Lösung 2, bis zum Ausgießen bei 60 ºC unter Rühren.
3. Präparation einer Phantomlösung für den nackten Tumor (ohne AuNRs) (Lösung 3)
   HINWEIS: Diese Lösung wird nur für IV-Phantome verwendet. Die Vorbereitungsschritte von Lösung 2 sind in Abbildung 3C dargestellt.
   1. Berechnen Sie das theoretische Volumen der Suspension, die hinzugefügt werden soll, um eine nackte Tumorregion zu erzeugen (~ φ20 x 6 mm).
      HINWEIS: Das ungefähre Volumen für Tumorphantome beträgt 1,9 ml. Das zu präparierende Lösungsvolumen beträgt also 2,5 ml.
   2. Berechnen Sie die Menge der zuzugebenden Tumorphantombestandteile - Agarose und IL - unter Verwendung ähnlicher Schritte wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
      1. Fügen Sie 25 mg Agarose hinzu, um 2,5 ml Lösung herzustellen, um eine Konzentration von 1 % w/v zu erreichen.
      2. IL:μ_s' des Brusttumors beträgt 4,6 ^{cm-1 33} und um dies nachzuahmen, beträgt die entsprechende IL-Konzentration 0,472%^34,35. 59 μl 20 % IL-Stamm zugeben.
   3. Geben Sie 25 mg Agarose zu 2,44 mL DI-Wasser in ein Becherglas und decken Sie es mit einer Alufolie ab.
   4. Stellen Sie das Becherglas auf eine heiße Platte und rühren Sie bei 120 °C, bis die Lösung transparent wird.
   5. Reduzieren Sie die Temperatur der Heizplatte auf 60 ºC und lassen Sie die Lösung 15 Minuten einwirken.
   6. Geben Sie 59 μl IL unter Rühren in die Lösung. Die resultierende Lösung, Lösung 3, bis zum Ausgießen unter Rühren bei 60 ºC aufbewahren.

3. Herstellung eines Tumorgewebe-imitierenden Phantoms 24,25,36

1. Bereiten Sie die Formen für den Gießschritt vor. Versiegeln Sie dazu den Boden der zylindrischen Formen mit Parafilm und platzieren Sie die Abdeckform (φ20 x 6 mm) in der Mitte.
2. Gießen Sie Lösung 1 bis zur oberen Markierung der Abdeckform in die zylindrischen Formen und lassen Sie sie erstarren (Abbildung 4A).
3. Entfernen Sie nach der Erstarrung die Abdeckform, um einen Hohlraum für die Tumorregion zu schaffen (Abbildung 4B).
   HINWEIS: Das Protokoll ist für IT- und IV-Phantome bis Schritt 3.3 identisch. Der Prozess wird für IT- und IV-Phantome nach Schritt 3.3 separat besprochen.
4. IT Phantom 24,25,36
   1. Füllen Sie den Hohlraum mit Lösung 2 und lassen Sie ihn erstarren (Abbildung 4C).
   2. Geben Sie Lösung 1 an die Oberseite des Phantoms und lassen Sie es vollständig erstarren (Abbildung 4D).
5. IV Phantom^24,25
   1. Setzen Sie eine kleinere Abdeckform (φ14 x 3 mm) ein und füllen Sie den Hohlraum um sie herum mit Lösung 2 (Abbildung 4E).
   2. Entfernen Sie nach dem Erstarren die kleinere Form und füllen Sie den verbleibenden Hohlraum mit Lösung 3 (Abbildung 4F).
   3. Geben Sie Lösung 1 nach oben und lassen Sie die vollständige Verfestigung zu (Abbildung 4G).

4. Einsetzen der Thermoelemente in das Phantom 24,25,36

HINWEIS: Zur Überwachung der räumlichen Temperaturverteilung werden Thermoelemente vom Typ K an verschiedenen radialen (r) und axialen (z) Positionen in das Phantom eingesetzt, wie in Abbildung 2 dargestellt. Für das Einsetzen von Thermoelementen an genauen Stellen werden Glaskapillaren als Führungen verwendet, um die Präzision zu gewährleisten. Die Thermoelementpositionen werden als (r, z) bezeichnet, wobei der Mittelpunkt auf der Oberseite des Tumors in der Tiefe z = 3 mm als Referenzpunkt sowohl für IT- als auch für IV-Phantome dient und als (0, 3) bezeichnet wird, wie in Abbildung 2A, B gezeigt. Bei der Auswahl radialer und axialer Lokalisationen zur Quantifizierung der thermischen Schädigung in der Tumorregion sind die Lokalisationen an der Tumorperipherie (sowohl radial als auch axial) entscheidend. Das Erreichen der erforderlichen Temperaturen an diesen peripheren Punkten während der NIR-Bestrahlung gewährleistet eine vollständige Tumorablation. Somit werden die Thermoelemente an radialen Extrempunkten (des Tumors) bei z = 3 und 9 mm, d. h. (10, 3) und (10, 9), platziert, und ein Thermoelement wird an der Tumor-Gewebe-Grenzfläche bei z = 9 mm (periphere axiale Lage), d. h. (0, 9), platziert, wie in Abbildung 2A, B dargestellt. Um die axiale Temperaturverteilung zu beurteilen, wird zusätzlich ein Thermoelement zwischen den Positionen (0, 3) und (0, 9) eingesetzt, das als (0, 6) bezeichnet wird. Um schließlich den Temperaturanstieg in der umgebenden gesunden Geweberegion zu beurteilen, wird ein Thermoelement bei (15, 3) eingesetzt.

1. Schneiden Sie die Glaskapillaren auf geeignete Längen zu, so dass diese die gewünschten radialen und axialen Stellen innerhalb des Phantoms erreichen.
2. Setzen Sie Thermoelemente in diese Glaskapillaren ein und punktieren Sie nacheinander an den angegebenen radialen und axialen Phantomstellen.
3. Sobald alle Thermoelemente an Ort und Stelle sind, legen Sie das Phantom vorsichtig in eine Petrischale aus Glas für die anschließende NIR-Bestrahlung, wie in Abbildung 5A gezeigt.

5. Exposition gegenüber NIR-Strahlung und Messung der daraus resultierenden photothermischen Temperaturen³⁶

1. Platzieren Sie die Petrischale aus Glas, in der sich das Phantom befindet (mit Thermoelementen eingesetzt), so, dass der zentrale Bereich der Oberseite des Phantoms senkrecht zur Spitze der optischen Faser der NIR-Lichtquelle steht, wie in Abbildung 5A dargestellt.
   HINWEIS: Der Strahldurchmesser auf der Phantomoberfläche kann durch Ändern des Abstands zwischen der Oberfläche und der Glasfaserspitze eingestellt werden. Dabei wird ein Abstand von 9 mm eingehalten, um einen Strahldurchmesser von 20 mm zu erreichen, der die zentrale Tumorregion abdeckt.
2. Schließen Sie das Datenerfassungssystem an den Computer an und öffnen Sie die LabVIEW-Software.
3. Schalten Sie die NIR-Lichtquelle (Abbildung 5B) und die Play-Taste in der Software gleichzeitig ein, um Temperaturdaten zu Beginn der Bestrahlung aufzuzeichnen.
4. Bestrahlen Sie das Phantom 20 Minuten lang, schalten Sie dann die NIR-Lichtquelle aus und stoppen Sie die Aufnahme.
5. Plotten Sie die aufgezeichneten Temperatur- und Zeitdaten.

6. Temperaturvergleich mit Simulationsergebnissen^24,25

HINWEIS: Experimente werden in der Regel wiederholt, und die Temperaturen werden in festgelegten Zeitintervallen an allen Thermoelementstandorten aufgezeichnet. Für die Validierung werden die folgenden Schritte ausgeführt:

1. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der experimentellen Temperaturen an allen Thermoelementpositionen (r, z).
2. Berechnen Sie die Temperaturen an den betrachteten Thermoelementpositionen numerisch.
3. Die aus den Experimenten erhaltene mittlere Temperatur und die durch Simulation erhaltene Temperatur an allen Thermoelementstandorten in Bezug auf die Zeit sind dargestellt, siehe Abbildung 6.
4. Berechnen Sie den mittleren quadratischen Fehler (RMSE) und den mittleren absoluten Fehler (MAE) für alle Thermoelementstandorte, um den Temperaturunterschied zu quantifizieren und die Validierung zu bewerten, wie in Tabelle 1 gezeigt.
   HINWEIS: MAE und RMSE werden anhand der Gleichungen 2 bzw. 3 berechnet.
   (2)
   (3)
   Dabei sind TE, TS und N die experimentell ermittelte Temperatur, die numerisch berechnete Temperatur und die Anzahl der Datenpunkte (hier werden die Temperaturen jeweils 20 Minuten lang pro Sekunde aufgezeichnet; daher = 1.200). I steht für Zeit, Augenblicke.

Ergebnisse

Abbildung 6 zeigt die zeitlichen Mitteltemperaturen, die während Experimenten mit einem AuNR-eingebetteten Tumor-Gewebe-Phantom an allen Thermoelementstandorten erhalten wurden, wie in Abbildung 2 gezeigt, verglichen mit den Temperaturen, die während der Simulationen an entsprechenden Thermoelementstandorten erhalten wurden. Hier wurden die Experimente 4x für jede Verteilung, d.h. IT- und IV-V...

Diskussion

In dieser Arbeit wird das Protokoll für die Präparation von Agarose-basierten Tumorgewebe-ähnlichen optischen Phantomen vorgestellt. Die Phantome sind so konzipiert, dass sie die optischen Eigenschaften von Tumor- und Normalgewebe für ihre Verwendung in Studien für PPTT nachahmen. In dieser Studie wird die Anwendung dieser Phantome zur Validierung numerischer Methoden während der PPTT hervorgehoben. Der kritischste Schritt in diesem Protokoll besteht darin, die Temperatur der Phant...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6	Base matrix for phantoms
Deionized (DI) water (18.2 MΩ)	NA	NA	Solvent for the preparation of phantom solutions
Gold nanorods (AuNRs)	Nanopartz	A12-10-808	Plasmonic nanoparticles
Intralipid (20% emulsion stock)	Sigma-Aldrich	68890-65-3	Scattering agent of phantoms
Parafilm	Parafilm M	380020	To seal the bottom of cylindrical mold
Polylactic acid filament	eSun	NA	Material for molds (1.75 mm dia wire)
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3D Printer	Creality	Ender-3	For printing molds
Data acquisition (DAQ) system	National Instruments	cDAQ-9171	For recording temperatures
DI water unit	Merck Millipore	Direct-Q3	For DI water
Hot plate with magnetic stirrer	IKA	C-MAG HS 4	For phantom solutions preparation
NIR light source	NA (In-house developed)	NA	For NIR irradiation of phantoms, (800/50 nm; Center wavelength: 800 nm, Bandwidth: 50 nm)
Optical Fiber (1/2" × 12")	Edmund Optics	38-659	For NIR irradiation of phantoms
Type K thermocouples	RS Components	RS Pro 397-1589	For temperature monitoring at various phantom locations during NIR irradiation
Weighing Balance	Wensar	PGB 200	For weighing agarose
Name of Software	Company	Catalog Number	Comments/Description
Autodesk Inventor 2021	Autodesk	NA	For mechanical designing of molds
Cura 5.7	Ultimaker	NA	For converting mechanical design to Gcode for 3D printing
Matlab R2024b	MathWorks	NA	For numerical simulations and temperature data plots
Name of Labwares used	Company	Catalog Number	Comments/Description
Beakers (50 mL)	Borosil	1000D12	For phantom solution preparations
Beakers (10 mL)	Borosil	1000006	For phantom solution preparations
Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf Research plus, 1-channel, variable	3123 000 063	For adding constituents into the phantom solution
Pipette (10-100 µL)	Eppendorf Research plus, 1-channel, variable	3123 000 047	For adding constituents into the phantom solution
Spatula	Borosil	LASC8888M06	For weighing agarose and demolding the phantoms from the molds
Tips (100-1000 µL)	Tarsons	521016	For adding constituents into the phantom solution
Tips (10-100 µL)	Tarsons	521010Y	For adding constituents into the phantom solution