אנו מודים למרכז גנטיקה Caenorhabditis (במימון המכון הלאומי לבריאות (NIH) במשרד של מחקר תשתית תוכניות P40 OD010440) עבור זנים. המחברים רוצה להודות בטיסט Roelens, אלי Lessman, סיפק לנו משוב בונה, המעבדה מנו ב CCNY, הנטר לשימוש של המעבדה שלהם עבור חלק הצילומים ועבור סיוע שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס PSC-הנטר TRADB-46-113 ולהעניק NIH 1SC2GM118275-01. טרשת נפוצה מומן בחלקו על ידי מוסד קנדי מלגת פוסט-דוקטורט בריאות (CIHR), E.K. נתמכה על ידי עלייה NIH/NIGMS הענק GM062981.

1. הגדרה על rec-8 RNAi (יום 1-3 באיור2)
פרוטוקול זה משתנה בין Kamath ו Ahringer30.
<ol><li>עבור אינדוקציה של rec-8 dsRNA ביטוי Escherichia coli, להכין תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) אגר צלחות31 בתוספת ריכוז סופי של 1 מ מ איזופרופיל-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) ו- µg 100/mL אמפיצילין. לאחסן בחושך ב 4 ° C עד השימוש, עד 4 שבועות.</li>
	<li>פס HT115 חיידקים נושאת את השיבוט rec-8 (W02A2.6) Ahringer המעבדה ספריה30 rec-8 השיבוט על גבי צלחות מרק לוריא (LB) בתוספת אמפיצילין µg/mL 100 ו- 50 µg/mL טטרציקלין. לגדול בין לילה ב שייקר ב 37 º C.</li>
	<li>יום 1, לחסן מושבות יחיד מן המושבות יחיד טרי מרוחים של החיידק HT115 e. coli נושא השיבוט RNAi rec-8 לתוך אמפיצילין המכיל 4 מ ל LB µg/mL 100 ו- 50 µg/mL טטרציקלין. לגדול התרבות חיידקים לילה ב מטרף או תוף רולר ב 37 º C.</li>
	<li>למחרת בבוקר (יום 2), זירוז ייצור של גדילי כפול (ds) RNA rec-8 W02A2.6 בתרבות חיידקי HT115 על-ידי הוספת ריכוז סופי של 1 מ מ IPTG, ומנענע למשך 40 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר אינדוקציה, זרע NGM/IPTG צלחות עם 100-200 µL של חיידקים rec-8 HT115 ואחסן צלחות בטמפרטורת החדר הלילה האפל (3 ביום).</li>
	<li>למחרת בבוקר (יום 4), להוסיף את המתח נמטודות הרצוי הלוחות חיידקים המושרה HT115 rec-8 כפי שמתואר בשלב 2.1 מתחת.</li>
</ol>2. יצירת ובידוד Tetraploids (יום 4-16 באיור2)
<ol><li>ביום הרביעי, מקום 3-4 צעירים L4 אנדרוגינוסים (הרביעי) הפרפרים והעשים של המתח דיפלואידי הרצוי על לוחות NMG/IPTG נזרע עם חיידקים rec-8 HT115 נפנתה יום לפני (שלב 1.5, לעיל). לגדול נמטודות ב 15 ° C בחושך.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.3 ו 1.4 החל 3 ימים לאחר שלב 2.1, אשר יהיה שלושה ימים לפני (F1s) הוא צאצא ראשון מהשלב הזה הופכים L4s. העיתוי של שלב זה יהיה תלוי כמה מהר זן נמטודות גדל ב 15 º C. כמה זנים מוטציה דיפלואידי הן מגדלי איטי, תזמון זה צריך משובח כוונון על מנת לבודד tetraploids.</li>
	<li>יום 8 (לאחר 4 ימים של טיפול הזנה של RNAi rec-8 ), העברה-20 (2 אנדרוגינוסים/צלחת פטרי) אנדרוגינוסים L4 F1 (הדור הראשון שקבורה) גדל בתוך לחלילית-8 HT115 חיידקים על גבי HT115 טרי המושרה rec-8 RNAi ולאפשר אותם self-fertilize.<ol>
<li>לחלופין, העברת 20 אנדרוגינוסים F1 L4 גדל החיידק rec-8 HT115 על גבי טרי המושרה HT115 rec-8 RNAi חיידקים יחד עם זכרים ללא טיפול של המתח זהה (2 אנדרוגינוסים עם פלטה/זכרים 4-6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום 13, התחל הקרנה על F2 (דור שקבורה) רומא המופיעות ארוך (לון) או באופן כללי גדול יותר מאשר הסוג הפרוע; ואז להעביר חיות לון בודדות על זנים OP50 או HB101 רגיל של חיידקים e. coli . המשך הקרנת F3 רומא (שקבורה השלישי); אולם, F3 רומא מ באותה הצלחת יכולה להיחשב זנים עצמאית אם הם הופכים הוקמה, כי הם יכולים להיות אחים מאותו הוקמה כבר אמא F2. הערה: tetraploids בשם מזוהים בקלות כי הם בבירור יותר diploids. אנדרוגינוסים פראי סוג הם שני שלישים קצר יותר tetraploids. כי זה ארוך יותר, גוף tetraploid עושה סיבוב נוסף כפי שהוא נע קדימה על ידי יצירת גלים sinusoidal כיפוף הגוף מהראש עד זנב (איור 3 א).</li>
	<li>לאפשר לון תולעים self-fertilize, מופצים על-ידי בחירת לון רומא עד רק לון רומא הינם הוליד בהיעדר rec-8 טיפול RNAi. פעולה זו עשויה להימשך שלושה דורות נוספים. תולעים לון לעיתים קרובות סטרילי, לא תשואה רומא.</li>
</ol>3. אימות Tetraploid זנים (סרט 1, איור 3 א, ב')
הערה: זנים Tetraploid הניתנים לאימות על ידי ספירת מספר הכרומוזומים שלהם oocytes מופרית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לשמש על המסך עבור מספר זוגות כרומוזום oocytes דיפלואידי מופרית (לפני לחטיבות meiotic), אם המתח יש סמן פלורסנט כרומוזומים. בהיעדרו של כרומוזום פלורסנט סמנים, נמטודות tetraploid יכולים להיות מוקרן על ידי תיקון של נמטודות מכתים עם צבע DNA; ראה להלן פרוטוקול לתיקון אתנול, חיית-כל 4 ′, צביעת dihydrochloride 6-Diamidine-2 ′-phenylindole (דאפי).
<ol><li>צביעת דאפי כל בעלי חיים הערה: זנים Tetraploid נושא 12 זוגות כרומוזום מחוברים הניתנים לאימות מאת דאפי מכתימה את החיות האלה, ספירת מספר גופים דאפי שלה oocytes מופרית.<ol>
<li>מקום 5 כדי 10 µL של המאגר M931 בשקופית מיקרוסקופ, ואז להעביר נמטודות 6-10 המסירה.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ ויבתר, צייר רוב M9 מהמסירה מבלי להסיר את נמטודות עם טישו ניקוי נטולת מוך. לאחר מכן, מיד להוסיף טיפה 10 µL של 90% אתנול על התולעים. לאפשר את התולעים להתייבש לחלוטין, אבל לא יותר מכמה שניות.</li>
		<li>ברגע האתנול מתאדה (ניתן לראות זאת כפי שזה קורה מתחת למיקרוסקופ ויבתר), להוסיף µL 10 נוספים של 90% אתנול על התולעים.</li>
		<li>חזור על שלב 3.1.3 שלוש פעמים נוספות.</li>
		<li>ברגע הטיפה האחרונה של אתנול התאדו, להוסיף 6 µL של דאפי או Hoechst לצבוע הריכוז הסופי מומלץ בתקשורת הרכבה של בחירה (לדוגמה, 1:1,000 לדילול דאפי 2 ng/µL ריכוז מניות ב- M9). לאחסון לטווח ארוך של השקופיות, 0.5% p-phenylenediamine מומס 20 מ מ טריס-HCl, pH 8.8, גליצרול 90% כפתרון antifade, במקום M9 בלבד, עשוי לשמש.</li>
		<li>מכסה את התולעים בשקופית עם coverslip, לאטום את הקצוות של coverslip עם לק. הציון במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (שלב 3.1.7) לפחות 10 דקות לאחר הוספת את coverslip. ניתן לאחסן שקופיות ללא antifade לכמה ימים ב 4 ° C לפני הבקיע, אבל האיכות של קרינה פלואורסצנטית מתחיל לרדת לאחר מספר ימים.</li>
		<li>באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה X 100, להבקיע במשחק oocyte מופרית הכי בוגרת, אשר נמצא בסמוך לגן spermatheca, טרם נכנס spermatheca את המספר של דאפי בודדים גופות (כרומוזום מהעשור זוגות) או הרחם.<ol>
<li>להבקיע בודדים גופות דאפי בתוך גרעין oocyte, השתמש להתמקד בסדר של המיקרוסקופ לנוע באיטיות מהחלק העליון של גרעין oocyte לתחתית במהלך ספירת. לאחר מכן, לספור מחדש באותו הגרעין תוך כדי הזזת המוקד בכיוון ההפוך (קרי, מהתחתית לצמרת של הגרעין) כדי לאשר את מספר הגופות דאפי שנספרו.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ציון oocyte מופרית הבוגר ביותר של כל אחד הגונדות שני ב אנדרוגינוסים לפחות עשרה לכל זן לון יציב. Oocytes פראי סוג יש 6 גופות דאפי על ממוצע, 5 זוגות אוטוזום את זוג כרומוזום המין. הנוכחות של 12 גופים דאפי oocyte זנים לון יציב מצביע על כך החיות בגן זן זה הן או חלקית (4 סטים של Autosomes, 3 X-chromosomes) או (4 סטים של Autosomes, 4 X-chromosomes) tetraploids.</li>
		<li>לחשב את המספר הממוצע של גופים דאפי נצפתה מן oocytes (לפחות 10) מרובים לכל זן. אמנם אגע כמה זוגות כרומוזום או על העליון של אחד את השני, אז המספר של דאפי גופות ב oocyte לעיתים קרובות הוא קטן יותר מאשר המספר הממשי של כרומוזום זוגות.</li>
		<li>(אופציונלי) עוד יותר לאמת יציב זנים לון איפה המספר הממוצע של דאפי גופות 12 כדי לבדוק אם הם מלא (4A, 4 X) או חלקי (4A, 3 X) tetraploids על ידי immunofluorescence מכתים נגד כרומוזום ציר חלבונים כגון HTP-332. זה מכתים יבחין כרומוזום זוגות על-ידי הצגת תבנית בצורת צלב של כרומוזומים ינותק יחיד נוכח tetraploid חלקית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בייצור גמטות הפלואידי (n) הוא המפתח ליצירת זיגוטה דיפלואידי (2n)-הפריה. הפחתה זו של הגנום מתבצע במהלך המיוזה עם שתי חלוקות תאים עוקבים אחרי שכפול גנום יחיד. כדי ליצור הפלואידי גמטות, C. elegans, כמו עם רוב metazoans אחרים, הפרדת maternally, בטון אבהי-נגזר homologs בליגה הראשונה, ואילו האחות chromatids של כל homolog ולברים בליגה השנייה. אחת דרך את הגנום כולו polyploidy מתעוררת בטבע היא דרך הדור של גמטות להיכשל חצי גודל הגנום שלהם במהלך המיוזה.
זה ידוע כבר מעל 50 שנה את tetraploid C. elegans נמטודות הן קיימא ופורה. Nigon23, ו מאוחר יותר תלול בטירוף ו, הרמן22, שנוצר וזיהה קומץ של tetraploids C. elegans באמצעות שיבוש סגרגציה כרומוזום meiotic באמצעות טיפולי חום-הלם ושימוש גנטיים, בהתאמה. סינגל נוסף briggsae ג tetraploid זן נגזר באמצעות פרוטוקול זה למעלה מ-30 שנה מאוחר יותר24. Tetraploids אלה נוצלו לחקור איך C. elegans לקבוע אם להיות זכר או אנדרוגינוס, איך פלואידיות מווסת את קצב גדילתם וגודלם, וכדי לנתח זיווג ואת synapsis של מיוזה25,26, 38 , 39 , 40. אך אלה ומחקרים נוספים הדורשים שימוש tetraploids ספציפי או זנים triploid היו מוגבל על-ידי הקושי ביצירת זנים tetraploid בשיטה זו.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור של 4A מלאים יציב, 4 X ושל חלקי 4A, 3 X tetraploid Caenorhabditis נמטודות זנים מכל הראשוני הרקע הגנטי דיפלואידי או קריוטיפ ללא שימוש גנטיים.
Tetraploidy עלולה להיווצר על ידי יותר מאשר מנגנון אחד C. elegans:
תלול בטירוף ו, הרמן הציע כי זנים tetraploid שהם יצרו כנראה נגזר מצב ביניים triploid. זנים שלהם התקבלו באמצעות בחירה דורות מרובים או על ידי חציית את triploid בשם ביניים עם זכרים דיפלואידי22. הליקויים בעבודת כרומוזום למחיצות בתוך לחלילית-8 מוטציות כי נותן לעלות oocytes דיפלואידי, זרע להציע מנגנון אפשרי אחר, שבו חיות tetraploid שעלולות להתעורר עם rec-8 RNAi ערכת27.
אנדרוגינוסים RNAi שטופלו rec-8 יכול לייצר דיפלואידי oocytes ו spermatocytes, אשר להצמיח בעלי חיים tetraploid על הפריה. בקנה אחד עם האפשרות הזו היא העובדה כי חלק אנדרוגינוסים F2 משובטים הולידה זנים לון יציב בהדור הבא, אשר עולה כי את אנדרוגינוסים לון F2 משובטים שם כבר tetraploid. לפי שיטת החצייה, הדור הראשון של אנדרוגינוסים RNAi מטופלים rec-8 הוא חצה עם זכרים ללא טיפול. Spermatocytes דיפלואידי יכול להיווצר עדיין אצל גברים כי הצלב נעשה בנוכחות חיידקים לבטא dsRNA rec-8 , לכן, גברים נחשפים rec-8 RNAi במהלך ההזדווגות לפחות 3 ימים. לכן, polyploids לון בערכת cross-fertilizing יכול גם יצרו מן ההפריה של oocytes דיפלואידי על ידי הזרע דיפלואידי. זני tetraploid יציב שעלולים להתעורר גם הפריה בין גמטות דיפלואידי או במעבר triploid חיות המכיל oocytes של פלואידיות משתנה עם חיות דיפלואידי בייצור הזרע הפלואידי.
שיקולים חשובים:
העצמי-לעומת ערכות הפרייה:
ערכת להפרות עצמית rec-8 RNAi F1 אנדרוגינוסים ובא ערכת המערבים מעבר של אנדרוגינוסים שטופלו עם לא מטופל בשני זכרים הולידה 4A, 4 X ו- 4A, זנים tetraploid X 3. למרות polyploids עוד היו בתחילה שבודד הערכה עצמית המפרה, יותר של בעלי חיים polyploid אלה היו סטרילי, ובכך הן ערכות יעילים באופן דומה לייצר זנים יציב tetraploid. הסיבות להצלחת מוגברת ו עקרות בערכת עצמית המפרה נותר עלום. למרות שתי ערכות יעילים באופן דומה, הערכה עצמית המפרה היא קלה יותר כאשר היא אינה דורשת את הבידוד של הזכרים להזדווגות. בנוסף, כאשר המתח עניין לא יעיל או פגומה-הזדווגות, הערכה עצמית המפרה. עדיף שלא ערכת cross-fertilizing עשוי לשמש ליצירת tetraploids מורכבים המכילים יותר מ שתי גרסאות של כרומוזום יחיד.
שינויים ומגבלותיה:
כיום, פרוטוקול זה כרוך rec-8 RNAi טיפול על ידי האכלת חיידקים לבטא dsRNA עבור הגן rec-8 . לפיכך, פרוטוקול זה לא עובד במינים Caenorhabditis להגיב RNAi מאכילים, או מוטציות פגומים ההתפשטות סביבתי או מערכתית של RNAi בין רקמות-41,-42,-43. פוטנציאל ניתן לפתור בעיה זו על ידי החדרת RNAi טיפול על ידי הזרקה ישירה של dsRNA עניין ישירות לתוך germline.
חיות triploid להפיקם באמצעות מעבר של tetraploid חיה דיפלואידי שממנו הופק, כי ערכה זו אינו יוצר יציב זנים triploid44,45. רק 15% מכלל הביצים הוליד triploids הפתח, הצאצאים שלהם בעיקר סטרילי רומא עקב אנאפלואידיה. בנוסף, הוא צאצא פורה ששרדו כמה נוטים להיות מלא או בסמוך diploids בתוך כמה דורות. זה סביר, לפחות בחלקו, כי oocytes חלקית מתקן טריזומיה מאת פנקסי כרומוזום השלישית לגוף קוטב meiotic במחלקה הראשונה.
מגבלה בלתי עבירים של פרוטוקול זה היא כי זה לא עובד עבור ביצוע tetraploids של מוטציות המשפיעות על רכיבים של מכונות RNAi כי הם עמידים בפני טיפול RNAi46.
פתרון בעיות:
RNAi rec-8:
כמה שיקולים מכריעים עבור פרוטוקול זה מוצלח. הראשונה היא להשתמש IPTG טריים וצלחות IPTG NMG טרי עבור אינדוקציה של ייצור dsRNA rec-8 חיידקים חיידקים HT115 נושא השיבוט rec-8 (W02A2.6). IPTG הוא רגיש אור וזה חשוב לצמצם חשיפה קלה צלחות. ניתן לאחסן IPTG צלחות עד חודש ב 4 ° C בחושך. שנית, rec-8 (W02A2.6) RNAi HT115 זני חיידקים מן הספריה Ahringer (Kamath ו- Ahringer 2003) הניב הפנוטיפ rec-8 חזקה יותר מאשר אחרים זמינים rec-8 HT115 שיבוטים.
זן tetraploid תחזוקה:
זני tetraploid גדלים באיטיות ומפיקים לכל היותר 50 progenies לכל דור47. כל זני tetraploid מזוהה יציבים יחסית, אך הם יכולים לשבור ולהפוך כאשר דיפלואידי הדגיש (תקשורת אישית ג'ונתן הודג'קין ותצפיות שלנו שלא פורסמו). לכן, חשוב לציין כי כאשר זנים tetraploid גדלים 25 ° c, חום-בהלם, מורעבים, או קפוא, מופשר, הם יכולים במהירות לחזור diploidy, לכן חשוב להמשיך לאסוף את החיות לון כאשר מפשירה זנים אלו או כאשר חשיפת זנים אלו בתנאים מלחיצים שעלולות לגרום להם לחזור.
יישומים אפשריים:
חקירה של האפקט או את התפקיד של כל הגנום polyploidization האבולוציה, מחזור התא, ביטוי גנים ופיתוח אורגניזמים רב תאיים הסתמכה על השוואות בין: תאים באורגניזם המכילים פלואידיות שונים, באותו התא סוגי קשר הדוק מינים עם פלואידיות שונים, או מינים אשר עברו האירועים polyploidization האחרונים אבולוציונית, בידוד פיזי3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. למרות tetraploids יכול להיגזר דג זברה ומערכות מודל של העכבר, הצאצאים שלהם הם סטרילי או קטלני embryonically16,17. בנוסף, המערכות הללו דגם יש מחזורי החיים הארוכים, בהשוואה ל- C. elegans, ואת השיטות הזמינות כדי ליצור חיות polyploid הן מורכבות ולא יעיל. לכן, זנים של C. elegans נגזר על ידי שיטה זו תהיה אינסטרומנטלי לקדם כל חקירה על תופעות ועל תפקידיה של כל הגנום polyploidy אורגניזמים רב תאיים.
מאז triploid הנגזרות של tetraploid על ידי חוצה את tetraploid המקורי דיפלואידי, השוואה בין diploids, triploids tetraploids זה רק נבדלים מספר העותקים הגנום, מספק הזדמנות ייחודי וחסר תקדים הערכת שווי ערך חיות/איברים/תאים עם גודל הגנום שונים (או מנה ג'ין). גמישות ונוחות ערכת המתוארים כאן אפשרה לנו ליצור עשרות זנים tetraploid מרקע גנטי דיפלואידי או karyotypes. כמה זנים אלה שימשו כבר למנגנונים שאילתה של כרומוזום הומולוגי זיווג, synapsis במהלך המיוזה27.
זני tetraploid פראי סוג של מוטציה נושא סמנים פלורסנט תספק דרכים חדשות חקירה כדי להבין את קשרי הגומלין בין יחס הגודל של גרעיני/ציטוזול הגנום על החיה תאיים/סלולרי/עוגב ו כל שינוי קנה מידה, הגנום כולו polyploidization על הסתגלות, היווצרות המינים, מנה ג'ין, ביטוי ופיתוח רקמות ו עוגב. בנוסף המחקר של שינוי קנה מידה ביולוגית, הדור של זנים tetraploid יהיה משמעותי נוסף שאילתות של שאלות עקרוניות ביולוגיים הרלוונטיים יציבות הגנום איתות, חוץ-תאית, endoreduplication, הגנום כולו שכפול, ג'ין המינון, הסתגלות ללחץ, התפתחות של עמידות סמים, ואת מנגנון היווצרות המינים...

Polyploidy כל הגנום קיימת ברחבי הטבע אשר לעתים קרובות צעד שנדרש לצורך הסתגלות היווצרות המינים, organogenesis, ריפוי פצעים, דרוג ביולוגי; זה ידוע גם לקדם סרטן והן עמידות בפני תרופות1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. תעשיות החקלאות, דוגה ליצור צמחים polyploid דגים, רכיכות על ידי טיפול כימי (למשל, קולכיצין ו- orzalin) כדי לקבל שיעורי צמיחה מהירה, מגושם היבול והמשק החי13, 14,15. ייצור ניסיוני ולא יעיל של tetraploids קיימת עבור דג זברה של עכבר דגם מערכות16,17. עם זאת, רוב או כל polyploid multicellular שנוצרו על ידי בעלי החיים embryonically קטלני או סטרילי, ולכן לא אידיאלי במחקרי מעבדה על ההשפעות של polyploidy האורגניזם multicellular. כתוצאה מכך, כל הבנה של כל הגנום polyploidization אורגניזמים רב תאיים הוגבלה מינים קרובים אבולוציונית האחרונות polyploidization אירועים18,19,20 . נתיב כדי לקדם שאילתות של תפקיד ביולוגי או ההשלכות של polyploidization הוא השימוש של מערכת דגם C. elegans . חשוב, C. elegans הוא מערכת גנטית צייתן בדרך כלל קיים דיפלואידי, מכילה רק 5 autosomes (א) וכרומוזום מין אחד (X) לכל הגנום, הוא שקוף ומאפשר ויוו השגחה של תהליכים ביולוגיים, ו יש מחזור חיים קצר של 3-4 ימים (מביצה לבוגר בגרו). C. elegans הוכח להיות מסוגל לשחזר כמו tetraploid, אשר הוא הסוג הנפוץ ביותר של כל הגנום polyploidy בטבע. Triploid בעלי חיים יכול להיווצר על ידי חציית tetraploids עם diploids, אבל פלואידיות שלהם אינו יציב, ולהיות הזנים דיפלואידי בתוך כמה דורות.
ב העשורים האחרונים רק קומץ של קיימא הפורה של C. elegans זנים tetraploids היו מבודדים במעבדה, באמצעות אסטרטגיה מפרך, יוצר רק מוגבל סוגי זנים21,22, 23. אסטרטגיה זו יוצר tetraploids C. elegans באמצעות טיפולי הלם חום, אשר ככל הנראה משפיע על כרומוזום ההפרדה גמטות, הקרנה לבעלי polyploid בשם באמצעות סמנים גנטיים. Tetraploids האלו היו מאוד שימושי בירור של איך זה תולעים נימיות קובע אם להיות זכר או אנדרוגינוס. לימודי מאוחר יותר להשתמש זנים זמין כדי לחקור את הצמיחה, מנה ג'ין, ורגולציה של synapsis במהלך המיוזה הזה24,25,של נמטודות21,26. למרבה הצער, מחקרים אלה היו מוגבל על ידי הקושי ביצירת זנים חדשים tetraploid, על רקע גנטיים זנים אלו הכילו. המוצג כאן הוא פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת tetraploids יציב, אשר שימש ליצירת זנים ללמוד ויסות synapsis במהלך המיוזה27.
כמו בטבע, polyploidization יכול להיווצר על ידי היווצרות של דיפלואידי במקום גמטות הפלואידי. מציאת שלנו כי מוטציה רכיב rec-8 מיוזה ספציפי cohesin מייצר זרע דיפלואידי, oocytes עולה כי הורסים את הגן rec-8 יגרום בייצור של רומא tetraploid (איור 1)27, 28,29. יצירת זנים tetraploid פשוט כרוך הורסים rec-8 על ידי התערבות RNA (RNAi), במשך שני דורות על מנת phenocopy התכונה rec-8 גמטות דיפלואידי מוטציה. בשם polyploids ניתן לזהות בקלות על ידי שלהם יותר מאשר גודל גוף נורמלי. Polyploids מאושרות כמו tetraploids מלאה או חלקית על-ידי ספירת מספר כרומוזומים לכל גרעין יציב קווים הם הוקמה לאחר.
האסטרטגיה המתוארים כאן מאפשר את הדור של יציבה tetraploid Caenorhabditis נמטודות זנים מכל הראשונית הרקע הגנטי דיפלואידי או קריוטיפ ללא שימוש גנטיים. מאחר פרוטוקול זה יותר יעיל, תכליתי, ופשוט יותר ערכת בעבר, הוא יתרחב את הכלים הדרושים כדי לבצע שאילתה על התפקידים של polyploidization בתהליכי יסוד של פיתוח, יציבות הגנום באבולוציה multicellular אורגניזמים. המגבלה רק הנראה לעין בשימוש של פרוטוקול זה הוא עמיד בפני RNAi גנטי ברקעים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Motic Microscopy</td>
			<td>SMZ171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>T3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar, 5 kg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89140-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone, BD Bacto</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Trihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG, dioxane-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox Broth</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>89126-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Lennox</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>89126-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Trihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP</td>
			<td>Koptec, VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, monobasic dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC271750025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>W02A2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>RCE1182-202299820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of ploidy in caenorhabditis elegans

מנגנונים המערבות כל הגנום polyploidy תפקיד חשוב ב ההתפתחות והשינויים; כמו כן, דור חריג של תאים tetraploid נמצא קשור ההתקדמות של סרטן והן ההתפתחות של עמידות לתרופות. עד עכשיו, זה לא היה ריאלי לתמרן בקלות את פלואידיות של חיה multicellular ללא יצירת בעיקר סטרילי רומא. שהוצגו כאן הוא פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת tetraploid Caenorhabditis elegans חיות מכל כל זן דיפלואידי. שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור דעה קדומה באזור הבידוד כרומוזום במהלך המיוזה, בסופו של דבר הגדלת פלואידיות C. elegans. אסטרטגיה זו מסתמכת על ההפחתה ארעית של ביטוי של הגן rec-8 לייצר גמטות דיפלואידי. מוטציה rec-8 מייצר גמטות דיפלואידי פוטנציאלי שיוכל לייצר את tetraploids על הפריה. ערכת צייתן זו שימש ליצירת זנים tetraploid נושאת מוטציות, כרומוזום rearrangements כדי לזכות בתובנה dynamics כרומוזומלית ואינטראקציות במהלך השיוך synapsis של מיוזה. שיטה זו יעילה ליצירת זנים tetraploid יציב ללא סמנים גנטיים, ניתן להחיל על כל זן דיפלואידי, יכול לשמש כדי להפיק triploid C. elegans. שיטה פשוטה זו שימושית עבור חוקרים אחרים השאלות הביולוגיות היסוד הרלוונטיים יציבות הגנום, ג'ין המינון, קנה מידה ביולוגית, איתות חוץ-תאית, הסתגלות ללחץ, התפתחות של עמידות לתרופות, ו מנגנונים של היווצרות המינים.

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

שיטה זו מאפשרת לדור של נמטודות Caenorhabditis tetraploid ו- triploid של כל זן דיפלואידי. זני polyploid שנוצר על ידי שיטה זו השתמשו ללמוד אינטראקציות כרומוזום ב- meiotic prophase, שיטה זו שימושית לבחינת שאלות בסיסיות חשובות תא, התפתחותית, אבולוציונית, וביולוגיה סרטן.

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

manipulation-of-ploidy-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Genetics

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

10.9K Views.  City University of New York. שיטה זו מאפשרת לדור של נמטודות Caenorhabditis tetraploid ו- triploid של כל זן דיפלואידי. זני polyploid שנוצר על ידי שיטה זו השתמשו ללמוד אינטראקציות כרומוזום ב- meiotic prophase, שיטה זו שימושית לבחינת שאלות בסיסיות חשובות תא, התפתחותית, אבולוציונית, וביולוגיה סרטן.

Video: Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are two types of HM based on microscopic morphological evaluation, complete HM (CHM) and partial HM (PHM). These can be further subdivided based on the parental contribution to the molar genomes. Such characterization of HM, by morphology and genotype analyses, is crucial for patient management and for the fundamental understanding of this intriguing pathology. It is well documented that morphological analysis of HM is subject to wide interobserver variability and is not sufficient on its own to accurately classify HM into CHM and PHM and distinguish them from hydropic non-molar abortions. Genotyping analysis is mostly performed on DNA and tissues from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) products of conception, which have less than optimal quality and may consequently lead to wrong conclusions. In this article, detailed protocols for multiplex genotyping and flow cytometry analyses of FFPE molar tissues are provided, along with the interpretation of the results of these methods, their troubleshooting, and integration with the morphological evaluation, p57KIP2 immunohistochemistry, and fluorescence in situ hybridization (FISH) to reach a correct and robust diagnosis. Here, the authors share the methods and lessons learned in the past 10 years from the analysis of approximately 400 products of conception.

Hydatidiform moles are abnormal human pregnancies with heterogeneous aetiologies that can be classified according to their morphological features and parental contribution to the molar genomes. Here, protocols of multiplex microsatellite DNA genotyping and flow cytometry of formalin-fixed paraffin-embedded molar tissues are described in detail, together with results&#8217; interpretation and integration.

דנ א של מיקרולוווין הגנוזות וזרימה Cy, בדיקות פלוטודיה של פורמאלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות טוחנת

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב