חלק א הכנה לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הניתוח חולדה, לוודא את כל פתרונות מורכבים, אבל לא להוסיף כל האנזימים עדיין. Buffers, B ו החיץ לשטוף צריכים להיות מסוננים על סטריליות לפני האחסון. מאגרים צריכים להיות מאוחסנים 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 גם תרבות צלחות רקמות חייב להיות מצופה עם 10-20 מיקרוגרם / מ&quot;ל laminin ב 2 מ&quot;ל 1XSFM יום לפני, וגם צריך להיות מאוחסן על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניתוח, להכין את מכשירי ניתוח עיקור על ידי מהדק, מספריים, מלקחיים עם אתנול ו 70% ולתת להם להתייבש על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק 1 מ&quot;ל מלאים פתרון 0.5 מ&quot;ל הפרין (90 U / ml) היא מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו זה תרגול טוב לשטוף את מנגנון זלוף ידי פועל באמצעות אתנול 70%, באמצעות המשאבה peristaltic הפוך. סיים לאחר שטיפה עם אתנול, לשטוף את המנגנון עם מים מזוקקים פעמיים, ולבסוף לשטוף עם הצפת א לזרום דרך נאסף בכוס להציב אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את מנגנון זלוף לנקות, למלא את הצינור מזרק ימין עם 40 מ&quot;ל של הצפת ואת הצינור מזרק נשאר עם 40 מ&quot;ל של הצפת B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש בצינור זלוף אל קצה הצנתר על ידי מתן הצפת לזרום דרך המנגנון. מילוי למאגר מזרק לרמה 40 מ&quot;ל. ודא שאין בועות אוויר שנלכדו בצינור לאחר שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, לסגור את המאגר שסתום שסתום המזרק לחזור על התהליך עם B מאגר כזה צינורות טפטוף ערוכה עכשיו עם הצפת B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, מנגנון זלוף נשאר עם B חוצץ שסתום שסתום פתוח, אך עם הזרם הפסיק להשתמש הרגולטור על הקו הרביעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את המאגר זרימה למרות בכוס האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבר האחרון לעשות לפני הניתוח היא להוסיף את האנזימים הדרושים לפתרון המניות שלך, ואז לסנן את הפתרון אנזים בדיוק כמו פתרונות אחרים סוננו יום קודם לכן. לאחר סינון, פתרון זה אפשר להשאיר בטמפרטורת החדר. </li></ol> חלק II. הלב עכברוש לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרוטוקול הסטנדרטי בעקבות להרדים את עכברוש עם Isoflurane בתא הגזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור החתך על החזה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזה פתח באמצעות מספריים לחשוף לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק החדר השמאלי עם פתרון 0.5 מ&quot;ל הפרין (90 U / mL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלב עם חלק גדול של האאורטה המקום ללא פגע, בקרח קר הצפת B. </li></ol> חלק III. Myocytes בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב עכברוש טיפוסי צריך תשואה גבוהה של חלק בצורת מוט myocytes (בניגוד לתאי מעוגל מת) אם ההליך הבא הוא דבק כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, מהדק אל אבי העורקים הקטטר. קצה הצנתר לא צריך להיות חזק מדי ללב, כדי להבטיח זלוף טוב של הלב דרך העורק הכלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידק פעם לקשור את אבי העורקים אל קטטר עם תפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לפתוח את קו IV הרגולטור על מנת לאפשר קצב טפטוף מהיר (~ 60 טיפות / min) ולאפשר B הצפת לשטוף החוצה את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך לשטוף B חוצץ, השתמש במספריים קטנים מלקחיים כדי להסיר את הפרוזדורים וכל רקמת שומן או ריאות נצמד ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצפת B הוא סיים, לעבור את זרימת למאגר א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות הצפת מותר לזרום במשך 5 דקות, קטן מספר משימות יש לבצע במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לחמם את הפתרון אנזימים בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, כאשר מאגר מתרוקן מן המזרק (אבל עדיין קיימת בצינור), עומס 50 מ&quot;ל הפתרון אנזימים בתוך מזרק של המנגנון זלוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו זה צריך לבטל את כל זרימה דרך מן הקנקן אוסף באמבט מים (על ידי pipetting), עד לב הפתרון אנזימים perfuses. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פתרון אנזימים perfuses הלב, להפעיל את המשאבה peristaltic אשר מוגדר להעביר את פתרון האנזים מן הקנקן איסוף לחדש מזרק א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון אנזים לזרום דרך הלב עבור 10 דקות. כמו הלב מעכל, הוא מתחיל להיראות נפוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 37.5 μL של 0.1 מ &#39;CaCl 2 לפתרון האנזים מזרק לתת ריכוז יעיל של 0.1 מ&quot;מ Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות להעלות את ריכוז הסידן mM 0.2 ידי הוספת μL נוסף של 50 0.1 M CaCl 2 אל מזרק ולתת זלוף להמשיך במשך 10 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את החדרים ולהעביר מבחנה סטרילית קטן המכיל 20 מ&quot;ל אנזימים פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב כוס להגדיל את ריכוז הסידן מ&quot;מ 0.4 ידי הוספת 40 μL יותר של 0.1 מ &#39;CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לרכך את הלב לתוך 10 או יותר חתיכות עם זוג מספריים סטרילי קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הכוס במשך 5 דקות ב 37 מעלות עם נדנדה עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;CaCl 2 אללתת ריכוז יעיל של 0.6 mM Ca 2 + בעדינות triturate את חתיכות הלב עם pipet העברה פלסטיק 3-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דוגרים במשך 5 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 40 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;CaCl 2 בעדינות triturate כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד myocytes יחיד מעוכל מן הלא מעוכל רקמת חיבור באמצעות סינון דרך רשת סטרילי 500 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים להתיישב שפופרת 50 מ&quot;ל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant עם pipet העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend תאים הצפת לשטוף # 1 ולאפשר לתאים להסתפק 10-20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים ליישוב, לקחת aliquot קטן, ולהשתמש הפעם הזדמנות להעריך את האיכות ואת יכולת הקיום של התאים בתרחיף תחת מיקרוסקופ הפוכה. הכנה טובה יהיה אחוז גבוה (&gt; 80%) של מוט כמו תאים עם פסי פריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים התיישבו, להשליך את התאים supernatant ו resuspend בעדינות הצפת לשטוף # 2. בואו התאים להסתפק בטמפרטורת החדר, שאמור שוב לקחת 10-20 דקות, לבטל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך הכביסה שוב עם הצפת לשטוף # 3, התאים יהיה מוכן תרבות. </li></ol> חלק ד &#39;. תא Myocyte תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend תאים מדיה סרום 5%. לפני העברת תאים בתרבית רקמה צלחות, לשטוף את הצלחות עם SFM 1x. העברת התאים בצפיפות הרצויה דגירה של CO 2 רקמה תרבות חממה 3-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת 1x SFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים יכול להיות מתורבת עבור עד ארבעה ימים ומשומשים, כנדרש על ניסויים. </li></ol> חלק ו &#39;תוצאות נציג / תוצאה לא צריך להיות יותר מ 70% myocytes לב לחיות תחת מיקרוסקופ הפוכה כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה. <img src="/files/ftp_upload/1308/fig1.jpg" alt="דמות 1" /> טבלה 1: מתכון פתרון עבור L 1 10X Ca 2 + ללא הצפת KH: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מסה </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 68.96 גרם </td><td> 1180 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 3.58 גר &#39; </td><td> 48 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 59.58 גרם </td><td> 250 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> 2.85 גר &#39; </td><td> 12.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 3.08 גר &#39; </td><td> 12.5 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> טבלה 2: פתרון מתכון הצפת 1 L: מוסיפים 1.98 גרם גלוקוז ל -100 מ&quot;ל חיץ 10X KH ומביאים נפח סופי של 1 ל התאם osmolarity למצב הפיזיולוגיה ליד (~ 300) עם גלוקוז. מביאים pH 7.4 עם NaOH. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> - </td><td> מסה </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> מאגר 10X KH </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 1.98 גר &#39; </td><td> 11 mM </td></tr><tr><td> מביאים L 1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מביאים pH 7.4 עם NaOH </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> התאם osmolarity מצב פיזיולוגי קרוב (~ 300) עם גלוקוז. </td></tr></tbody></table> לוח 3: פתרון מתכון Buffers אנזימים <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מסה </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> Collagenase Type II </td><td> 25 מ&quot;ג </td><td> 0.05% (w / v) </td></tr><tr><td> פרוטאז XIV </td><td> 10 מ&quot;ג </td><td> 0.02% (w / v) </td></tr><tr><td> ^ נם </td><td> 0.025 גרם </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> קרניטין </td><td> 0.020 גרם </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> טאורין </td><td> 0.031 גרם </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצה גלוטמית </td><td> 0.020 גרם </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 0.1 מ &#39;CaCl 2 </td><td> 12.5 UL </td><td> 25 אממ </td></tr><tr><td> הצפת </td><td></td><td> מילוי 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 4: פתרון מתכון ^ נם 25X / טאורין / BSA (B / T / B) <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מסה </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> ^ נם </td><td> 0.076 גרם </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> טאורין </td><td> 0.094 גרם </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> BSA </td><td></td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> הצפת </td><td></td><td> מלא עד 6 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 5: פתרון מתכון B הצפת ו Buffers שטפי <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מאגר: </td><td> ב </td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td></tr><tr><td> הוסף: </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.5 מ &#39;CaCl 2 </td><td> 0.4 מ&quot;ל </td><td> 0.1 מ&quot;ל </td><td> .125 מ&quot;ל </td><td> 0.15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> הריכוז הסופי של CaCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1.25 mM </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 25X B / T / B </td><td> --- </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מאגר בנפח הסופי </td><td> 200 מ&quot;ל </td><td> 50 מ&quot;ל </td><td> 50 מ&quot;ל </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 6: פתרון מתכון מדיה culturing <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2X סרום ללא מדיה (SFM) </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> </td><td rowspan="2"></td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> (לאחר דילול) </td></tr><tr><td> קרניטין </td><td> 0.099 גרם </td><td> 10 מ&quot;מ (5 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> טאורין </td><td> 0.063 גרם </td><td> 10 מ&quot;מ (5 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> קריאטין </td><td> 0.075 גרם </td><td> 10 מ&quot;מ (5 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> אנטיביוטי / Antimycotic </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1% (0.5%) (v / v) </td></tr><tr><td> Media 199 </td><td> 45 מ&quot;ל </td><td> מילוי 50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X SFM </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 מ&quot;ל </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Media 199 </td><td></td><td> מילוי 50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X מדיה סרום 5% </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 מ&quot;ל </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td><td> 5% (V / V) </td></tr><tr><td> Media 199 </td><td></td><td> מילוי 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CaVbeta+subunits,+and+lack+of+functional+reserve,+in+protein+kinase+A+modulation+of+cardiac+CaV1.2+channels.">Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels.</a> Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).</li><li>SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+modulatory+effects+of+five+human+auxiliary+beta2+subunit+splice+variants+on+L-type+calcium+channel+gating.">Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating.</a> Biophys. , 84-845 (2003).</li></ol>

הצעד הקריטי הוא המהירות שבה את הלב מבודד הוא תלה על מערכת זלוף. אורך תקופת עיכול אנזימטי עשוי להיות קצת שונה עבור כל חולדה. ההתאמה תלוי כמה רך הלב הופך לאחר תקופת סדירה של מערכת העיכול. ההתאוששות באיטיות של Ca 2 + לאחר עיכול אנזים חיוני להשגת Ca 2 +-סובלנית תאים ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6191</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9541</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9666</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical</td>
<td>LS004176</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease XIV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carnitine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C9500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3294</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Creatine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-009-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media 199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>variable flow chemical pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-077-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primary culture of adult rat heart myocytes

Cultured העיקרי מכרסמים מבוגרים לתאי לב הם מערכת מודל חשוב למחקר קרדיווסקולרי. עם זאת, הקמתה של החזקה, myocytes קיימא מבוגר תרבותי יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, שער הגבלת צעד עבור חוקרים רבים. כאן אנו תיאר פרוטוקול להשיג תשואה גבוהה של מבוגר לב myocytes עכברוש שנותרו קיימא בתרבות במשך כמה ימים. הלב הוא מבודד perfused עם collagenase ו פרוטאז תחת Ca נמוך<sup&gt; 2 +</sup&gt; התנאים להתאושש myocytes יחיד. Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; עמיד תאים מתקבלים על ידי עליות בשלבים ב Ca תאיים<sup&gt; 2 +</sup&gt; ריכוז בשלושה שלבים לשטוף הבאים. תאים מסוננים, resuspended במדיום תרבות, מצופה על תלושי laminin מצופה. Myocytes Cultured שהושגו באמצעות פרוטוקול זה הם קיימא עבור עד ארבעה ימים ומתאימים רוב הניסויים כולל electrophysiology, ביוכימיה, ביולוגיה מולקולרית הדמיה.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes at JoVE.com

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

primary-culture-of-adult-rat-heart-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Views.  Columbia University. במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.

Video: Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

השתלת רקמות מהונדסות בלב החולדה

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...