إعداد الجزء الأول للجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من الجراحة الفئران ، تأكد أن جميع الحلول ، ولكنها لا تضيف أي الانزيمات حتى الان. يجب على جميع المخازن ألف وباء ، وغسل العازلة تتم تصفيته للعقم قبل التخزين. يجب على جميع المخازن المؤقتة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون مطلية 6 لوحات زراعة الأنسجة بشكل جيد مع 10-20 ميكروغرام / مل في laminin 1XSFM مل (2) وقبل يوم وكذلك ، ويجب أن يتم تخزينها في 37 درجة مئوية في حاضنة 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من الجراحة ، وإعداد الأدوات الجراحية بواسطة تعقيم المشبك ، مقص ، وملقط مع الايثانول 70 ٪ والسماح لهم الجاف على منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء حقنة مليئة 1 مل 0.5 مل من محلول الهيبارين (90 يو / مل) جاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن هو الممارسة السليمة لغسل الجهاز الارواء عن طريق تشغيل من خلال الايثانول 70 ٪ ، وذلك باستخدام مضخة تمعجية في الاتجاه المعاكس. بمجرد الانتهاء الشطف مع الإيثانول ، شطف مع الماء المقطر جهاز مزدوج ، وأخيرا مع شطف ألف الاحتياطي تدفق من خلال تجمع في كوب توضع في حمام مائي 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد جهاز نضح تنظيفها ، وملء الأنبوب حقنة الحق مع 40 مل من الاحتياطي ألف والمحاقن أنبوب اليسار مع 40 مل من الاحتياطي B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس الأنبوب نضح لغيض من القسطرة عن طريق السماح الاحتياطي ألف إلى تدفق من خلال اجهزتها. الملء إلى المخزن المؤقت للحقنة إلى مستوى 40 مل. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحتبسة في الأنبوب بعد هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، أغلق العازلة صمام محبس حقنة وتكرار هذه العملية مع B الاحتياطي بحيث يتم تستعد الآن للأنابيب العازلة نضح مع باء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، بقي الجهاز الارواء مع B الاحتياطي فتح صمام محبس ، ولكن مع توقف تدفق باستخدام منظم على خط الرابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل العازلة على الرغم من التدفق في الدورق جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آخر شيء يجب القيام به قبل الجراحة هو اضافة الانزيمات اللازمة لمحلول المخزون الخاص بك ، ومن ثم تصفية حل انزيم تماما كما كانت الحلول الأخرى التي تمت تصفيتها في اليوم السابق. تصفيتها مرة ، يمكن ترك هذا الحل في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> الجزء الثاني. تشريح الجرذ القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول قياسي بعد الموت ببطء الفأر مع Isoflurane في غرفة الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم منطقة شق في الصدر مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح صدره وباستخدام مقص كشف القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ البطين الأيسر مع 0.5 مل من محلول الهيبارين (90 يو / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القلب مع إزالة جزء كبير من الشريان الأورطي سليمة ، في مكان مؤقت باء الجليد الباردة </li></ol> الجزء الثالث. Myocytes العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يكون قلب فأر نموذجية تسفر عن جزء كبير من قضيب على شكل myocytes (على العكس من خلايا ميتة مدورة) إذا تم الالتزام بها بشكل صحيح إلى الإجراء التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبدأ ، المشبك الأبهر إلى القسطرة. لا ينبغي للطرف القسطرة يتم دفع بعيدا جدا في قلب لضمان التروية الجيدة للقلب عن طريق الشريان التاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرضت مرة واحدة ، التعادل الأورطى إلى القسطرة مع خياطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، فتح خط الرابع المنظم للسماح بمعدل سريع بالتنقيط (~ 60 قطرات / دقيقة) ، والسماح ب العازلة لتغسل القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء غسل B الاحتياطي ، استخدام مقص صغير وملقط لإزالة أي الأذينين والأنسجة الدهنية أو الرئة التشبث القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من الاحتياطي B ، والتحول إلى تدفق ألف العازلة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين يسمح للمخزن في التدفق لمدة 5 دقائق ، ينبغي تنفيذ المهام الصغيرة عدة بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، دافئة الحل أنزيم في حمام ماء C ° 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، عندما يتم استنفاد الاحتياطي A من الحقنة (ولكن لا تزال موجودة في الأنبوب) ، تحميل 50 مل من محلول أنزيم في حقنة ألف من جهاز نضح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقد بات من الضروري لتجاهل كل من التدفق من خلال جمع الدورق في حمام مائي (بواسطة pipetting) ، حتى في قلب الحل perfuses الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد حلول perfuses أنزيم في القلب ، تنشيط مضخة تمعجية التي تم إعدادها لنقل الحل الانزيم من الدورق جمع ألف حقنة لتجديد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انزيم يسمح الحل تتدفق في القلب لمدة 10 دقيقة. كما يساعد على هضم القلب ، فإنه يبدأ النظر المتضخمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 37.5 ميكرولتر من 0.1 م 2 CaCl في حل الانزيم في حقنة وإعطاء التركيز الفعال لكا 2 + 0.1 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة زيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.2 ملي بإضافة مبلغ إضافي 50 ميكرولتر من CaCl م 2 إلى 0،1 ألف حقنة ، والسماح للنضح المضي قدما لمدة 10 دقائق أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ونقل إلى البطينين دورق معقمة صغيرة تحتوي على 20 مل من محلول أنزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الدورق زيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.4 ملي وذلك بإضافة 40 ميكرولتر أكثر من 0.1 م CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم برفق القلب إلى 10 أو أكثر من قطعة مع زوج من مقص صغير العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الكأس لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 مل من CaCl م 2 إلى 0.1إعطاء التركيز الفعال لكا 2 + 0.6 مليمتر ومتمزج بلطف القطع القلب مع الماصة نقل البلاستيك 3-5 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة لمدة 5 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية ، إضافة 40 مل من 0.1 م 2 CaCl متمزج بلطف وكما حدث من قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> myocytes منفصلة واحدة من المنظمات غير مهضوم مهضوم النسيج الضام باستخدام الترشيح من خلال شبكة العقيمة ميكرومتر 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا ليستقر في أنبوب 50 مل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف مع تجاهل نقل الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف الخلايا في مخزن # 1 اغسل وتسمح للخلايا لتسوية لمدة 10-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخلايا هي تسوية ، واتخاذ قسامة الصغيرة ، واستخدام هذا الوقت فرصة لتقييم جودة وسلامة الخلايا في تعليق تحت مجهر مقلوب. وسوف التحضير الجيد لها نسبة عالية (&gt; 80 ٪) من قضيب مثل الخلايا مع التصدعات هش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الخلايا قد استقروا ، تجاهل الخلايا وطاف resuspend برفق في مخزن اغسل # 2. السماح للخلايا يستقر عند درجة حرارة الغرفة ، والتي ينبغي أن تأخذ مرة أخرى 10-20 دقيقة ، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية الغسيل ومرة ​​أخرى مع الاحتياطي اغسل # 3 ، وخلايا يكون جاهزا للثقافة. </li></ol> الجزء الرابع. الخلية العضلية الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف خلايا في وسائل الاعلام المصل 5 ٪. قبل نقل الخلايا لوحات زراعة الأنسجة ، وتغسل الصحون مع 1X SFM. نقل الخلايا في مناطق ذات كثافة المطلوبة واحتضان ثاني أكسيد الكربون في الأنسجة 2 ثقافة حاضنة لمدة 3-5 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل وسائل الإعلام لSFM 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن يكون مثقف الخلايا لمدة تصل إلى أربعة أيام ، واستخدمت على النحو المطلوب لإجراء التجارب. </li></ol> الجزء الخامس الممثل النتائج / نتائج يجب أن يكون هناك أكثر من 70 ٪ myocytes القلب يعيش تحت المجهر المقلوب عندما يتم البروتوكول بشكل صحيح. <img src="/files/ftp_upload/1308/fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الجدول رقم 1 : وصفة الحل : 1 L 10X كا 2 + خالية من الاحتياطي KH : <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> كتلة </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> ز 68.96 </td><td> 1180 ملي </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 3.58 ز </td><td> 48 ملم </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> ز 59.58 </td><td> 250 ملم </td></tr><tr><td> K 2 4 هبو </td><td> 2.85 ز </td><td> 12.5 ملم </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 3.08 ز </td><td> 12.5 ملم </td></tr></tbody></table> الجدول 2 : وصفة لحلول الاحتياطي L 1 ج : إضافة 1،98 ز الجلوكوز إلى 100 مل العازلة KH 10X وتقديمهم إلى الحجم النهائي من 1 L. ضبط الأسمولية إلى حالة فسيولوجية قرب (~ 300) مع الجلوكوز. يرتفع الى 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> -- </td><td> كتلة </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> 10X KH العازلة </td><td> 100 مل </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 1.98 ز </td><td> 11 ملم </td></tr><tr><td> جلب إلى 1 L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> يرتفع الى 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> الأسمولية لضبط حالة فسيولوجية قرب (~ 300) مع الجلوكوز. </td></tr></tbody></table> الجدول 3 : وصفة الحل لأنزيم المخازن <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> كتلة </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> كولاجيناز النوع الثاني </td><td> 25 ملغ </td><td> 0.05 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> البروتيني الرابع عشر </td><td> 10 ملغ </td><td> 0.02 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 0،025 ز </td><td> 5 ملم </td></tr><tr><td> كارنيتيني </td><td> 0،020 ز </td><td> 2 ملم </td></tr><tr><td> توراين </td><td> 0،031 ز </td><td> 5 ملم </td></tr><tr><td> حمض الجلوتاميك </td><td> 0،020 ز </td><td> 2 ملم </td></tr><tr><td> 0.1 م 2 CaCl </td><td> 12.5 UL </td><td> 25 UM </td></tr><tr><td> والعازلة </td><td></td><td> لملء 50 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 4 : وصفة الحل لBDM 25X / توراين / جيش صرب البوسنة (B / T / B) <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> كتلة </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 0،076 ز </td><td> 125 ملم </td></tr><tr><td> توراين </td><td> 0،094 ز </td><td> 125 ملم </td></tr><tr><td> BSA </td><td></td><td> 0.1 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> والعازلة </td><td></td><td> ملء إلى 6 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 5 : وصفة لحلول B العازلة والمخازن اغسل <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> العازلة : </td><td> B </td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td></tr><tr><td> إضافة : </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.5 م 2 CaCl </td><td> 0.4 مل </td><td> 0.1 مل </td><td> 0.125 مل </td><td> 0.15 مل </td></tr><tr><td> نهائي تركيز CaCl 2 </td><td> 1 ملم </td><td> 1 ملم </td><td> 1.25 مم </td><td> 1.5 ملم </td></tr><tr><td> 25X B / T / B </td><td> --- </td><td> 2 مل </td><td> 2 مل </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td> العازلة وحدة تخزين إلى النهائي </td><td> 200 مل </td><td> 50 مل </td><td> 50 مل </td><td> 50 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 6 : وصفة الحل للاعلام التثقيف <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2X المصل خالية من وسائل الإعلام (SFM) </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> </td><td rowspan="2"></td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> (بعد التخفيف) </td></tr><tr><td> كارنيتيني </td><td> 0،099 ز </td><td> 10 ملم (5 ملم) </td></tr><tr><td> توراين </td><td> 0،063 ز </td><td> 10 ملم (5 ملم) </td></tr><tr><td> الكرياتين </td><td> 0،075 ز </td><td> 10 ملم (5 ملم) </td></tr><tr><td> مضاد حيوي / مضاد فطري </td><td> 0.5 مل </td><td> 1 ٪ (0.5 ٪) (V / V) </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام 199 </td><td> 45 مل </td><td> لملء 50 مل </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X SFM </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 مل </td><td> 1X </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام 199 </td><td></td><td> لملء 50 مل </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X الإعلام المصل 5 ٪ </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 مل </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 2.5 مل </td><td> 5 ٪ (V / V) </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام 199 </td><td></td><td> لملء 50 مل </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CaVbeta+subunits,+and+lack+of+functional+reserve,+in+protein+kinase+A+modulation+of+cardiac+CaV1.2+channels.">Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels.</a> Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).</li><li>SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+modulatory+effects+of+five+human+auxiliary+beta2+subunit+splice+variants+on+L-type+calcium+channel+gating.">Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating.</a> Biophys. , 84-845 (2003).</li></ol>

والخطوة الحاسمة هي السرعة التي معلوق قلب معزولة حتى على نظام الارواء. ربما لطول فترة الهضم الأنزيمي تكون مختلفة قليلا عن كل فأر. التعديل يتوقف على مدى اللين قلب يصبح بعد فترة العادية الهضم. الانتعاش ببطء من كا 2 + بعد الهضم انزيم ضروري للحصول على الكالسيوم 2 +</su...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6191</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9541</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9666</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical</td>
<td>LS004176</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease XIV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carnitine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C9500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3294</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Creatine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-009-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media 199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>variable flow chemical pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-077-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primary culture of adult rat heart myocytes

مثقف القوارض خلايا البالغين قلب نظام الأساسي ونموذجا هاما للبحوث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، يمكن إنشاء وقابلة للحياة قوية myocytes الكبار مثقف أن يكون تحديا تقنيا ، ومعدل منظم الخطوة لكثير من الباحثين. وصف نحن هنا بروتوكولا للحصول على غلة عالية من البالغين myocytes قلب الفئران التي لا تزال قابلة للحياة في الثقافة لعدة أيام. معزول القلب وperfused مع كولاجيناز والبروتيني منخفض تحت كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; الظروف لاستعادة myocytes واحد. كاليفورنيا<sup&gt; 2 +</supويتم الحصول على&gt; الخلايا التي تتحمل زيادات تدريجية في الكالسيوم خارج الخلية<sup&gt; 2 +</sup&gt; التركيز في ثلاث خطوات غسل اللاحقة. يتم تصفية الخلايا ، معلق في وسط الثقافة ، ومطلي عن زلات laminin المغلفة. myocytes مثقف تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول قابلة للبقاء لمدة تصل إلى أربعة أيام ، وتكون مناسبة لمعظم التجارب بما في ذلك الكهربية ، والكيمياء الحيوية ، والتصوير والبيولوجيا الجزيئية.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes at JoVE.com

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

في هذه الورقة ، ووصف لنا طريقة نموذجية لعزل والثقافة myocytes الكبار قلب الفئران. وتستخدم كولاجيناز البروتيني لهضم وعزل myocytes واحد. Myocytes مثقف اتبع هذا البروتوكول تلبية الاحتياجات الأكثر تجربة.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

primary-culture-of-adult-rat-heart-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Views.  Columbia University. في هذه الورقة ، ووصف لنا طريقة نموذجية لعزل والثقافة myocytes الكبار قلب الفئران. وتستخدم كولاجيناز البروتيني لهضم وعزل myocytes واحد. Myocytes مثقف اتبع هذا البروتوكول تلبية الاحتياجات الأكثر تجربة.

Video: Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

عضوي النمط من الثقافة الشبكية أرنب الكبار

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

زرع الأنسجة المهندسة في قلب فأر

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

إعداد قلب فأر اقترن الارتحال الميتوكوندريا

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

العزلة في وقت واحد من كارديوميوسيتس عالية الجودة، الخلايا البطانية، والألياف الليفية من القلب الجرذ الكبار

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

الثقافة الأولية من خلايا الفئران البطاني وفحوصات لوظائف ستيرويدوجينيك

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...