<p class="jove_title"> Bölüm I. Hazırlık cerrahi için </p><ol><li> Rat cerrahi bir gün önce, tüm çözümler yapılır emin olun, ancak henüz herhangi bir enzimler katmayan. Tamponlar A, B ve yıkama tamponu depolama önce sterilite için filtre olmalıdır. Tamponlar 4 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir </li><li> 6-iyi doku kültürü plakaları 10-20 mg / ml 2 ml 1XSFM laminin de önceki gün kaplanmış olmalıdır ve 37 ° C CO <sub>2</sub> kuvöz içinde saklanmalıdır. </li><li> Ameliyatın yapıldığı gün,% 70 etanol ile kelepçe, makas, forseps ve sterilizasyon cerrahi aletler hazırlamak ve onları kağıt havlu üzerinde kurumaya bırakın. </li><li> 0.5 mL Heparin Çözümü (90 U / ml) ile dolu bir şırınga 1 ml hazır hale getirilir. </li><li> Şimdi ters peristaltik pompa kullanarak,% 70 etanol ile çalışan perfüzyon aparatı yıkamak için iyi bir uygulamadır. Bir kez etanol ile durulama bitmiş cihazın, çift distile su ile temizleyin, durulayın ve akış sonunda, 37 ° C&#39;lik su banyosuna yerleştirilir bir beher toplanan Tampon A. ile durulayın. </li><li> Tampon A ve sol şırınga tüp 40 ml, 40 ml Tampon B. ile temizlenmelidir perfüzyon cihazı hazırlamak için doğru şırınga tüp doldurmak </li><li> Tampon bir aparat üzerinden akmasına izin vererek kateter ucu Başbakan perfüzyon tüp. Tampon, 40 ml seviyesine şırınga Dolum. Bu adımdan sonra tüp içinde sıkışıp hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> Şimdi, perfüzyon boru Tampon B. ile astarlanmalıdır olduğunu tampon şırınga stopcock vanasını kapatın ve örneğin Tampon B işlemi tekrarlayın </li><li> Son olarak, perfüzyon aparat Tampon B valfli kapak açık kalan, ancak akışı ile IV hattı regülatör kullanarak durdu. </li><li> Toplama beher akış olsa tampon atın. </li><li> Ameliyat öncesi yapılacak en son şey, diğer çözümlerin bir gün önce filtre gibi enzim çözeltisi stok solüsyonu gerekli enzimleri eklemek ve daha sonra filtre. Süzülür sonra, bu çözüm oda sıcaklığında bırakılabilir. </li></ol><p class="jove_title"> Bölüm II. Sıçan kalp diseksiyonu </p><ol><li> Takiben standart bir protokol, bir gaz odası İsofluranın ile sıçan euthanize. </li><li> % 70 etanol ile toraks kesi alanı sterilize edin. </li><li> Açık göğüs makas kullanarak ve kalp maruz. </li><li> 0.5 mL Heparin çözüm (90 U / ml) ile sol ventrikül enjekte edilir. </li><li> Buz Tampon B. aort sağlam, yerinde büyük bir kısmı kalp çıkarın </li></ol><p class="jove_title"> Bölüm III. Miyositler izolasyon </p><ol><li> Aşağıdaki yordam, düzgün yapıştırılır ise tipik bir sıçan kalp çubuk şeklinde miyositler yüksek bir fraksiyonu (ölü yuvarlak hücrelere <em>karşı)</em> boyun eğmek zorundadır . </li><li> Başlamak için, kateter aort kelepçe. Kateterin ucu çok uzakta, koroner arter yoluyla kalbin iyi perfüzyon sağlamak için kalbin içine itti olmamalıdır. </li><li> Kelepçeli, bir dikiş ile kateter aort bağlar. </li><li> Sonra, hızlı bir damla oranı (~ 60 damla / dk) ve kalp yıkamak için izin Tampon B izin IV hattı regülatör açın. </li><li> Tampon B yıkama sırasında, kulakçıklar ve kalp yapışan herhangi bir yağ ya da akciğer dokusunda kaldırmak için küçük makas ve forseps kullanabilir. </li><li> Tampon B tamamlandıktan sonra, Tampon A. akım anahtarı </li><li> Tampon 5 dakika boyunca akmasına izin olsa da, birkaç küçük görevleri hızlı bir şekilde yapılmalıdır. </li><li> İlk olarak, 37 ° C su banyosunda Enzim Çözüm sıcak. </li><li> Son olarak, Tampon şırınga (ama hala mevcut boru) boşaldığında, şırınga Enzim Çözüm 50 ml yük bir perfüzyon aparat </li><li> Enzim Çözüm perfuses kalp kadar, artık tüm su banyosu (pipetleme) toplama beherine flow-through atmak için gerekli. </li><li> Enzim Çözüm kalp perfuses, şırınga A. doldurmak için toplama beher enzim çözeltisi aktarmak için kurulur peristaltik pompa aktive </li><li> Enzim çözeltisi, 10 dakika süreyle kalp akmasına izin verin. Kalp sindirir gibi, bu şişirilmiş aramaya başlar. </li><li> Şırınga içinde enzim çözeltisi 0,1 M CaCl <sub>2</sub> 37.5 mcL ekleyin 0.1 mM Ca <sup>2</sup> etkili bir konsantrasyon elde <sup>etmek.</sup> </li><li> 10 dakika için 0.1 M CaCl <sub>2</sub> ek bir 50 mcL şırınga A ekleyerek 0.2 mM kalsiyum konsantrasyonunu artırmak ve perfüzyon bir 10 dakika daha devam edelim sonra. </li><li> Ventriküller kesilmiş ve 20 mL Enzim Çözüm içeren küçük bir steril beher transfer. </li><li> Beher 0,1 M CaCl <sub>2</sub> 40 mcL daha ekleyerek 0.4 mM Kalsiyum konsantrasyonu artırır. </li><li> Yavaşça, küçük steril makas bir çift ile 10 veya daha fazla parçalar halinde kalp kıyma. </li><li> 37 5 dakika boyunca beher ° C&#39;de nazik sallanan. </li><li> 40 mL 0.1 M CaCl <sub>2</sub>0.6 mM Ca <sup>2 +</sup> etkin konsantrasyon vermek ve kalp adet plastik bir transfer pipetlemeyin 3-5 kez yavaşça çiğnemek. </li><li> 37 ek bir 5 dakika inkübe sonra ° C, 40 ml 0,1 M CaCl <sub>2</sub> ve yavaşça eskisi gibi çiğnemek. </li><li> Ayrı sindirilir tek miyositler olmayan sindirilir steril 500 mikron mesh yoluyla filtrasyon kullanarak bağ dokusu. </li><li> Hücrelerin oda sıcaklığında 10 dakika, 50 ml tüp yerleşmek için izin verin. </li><li> Bir transfer pipetlemeyin ile süpernatant atın. </li><li> Yıkama Tamponu # 1 yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon ve hücrelerin oda sıcaklığında 10-20 dk yerleşmek için izin. </li><li> Hücrelere yerleşen olsa da, bu kez ters bir mikroskop altında süspansiyon hücrelerinin kalite ve canlılığını değerlendirmek için bir fırsat olarak küçük bir kısım almak ve kullanmak. İyi bir hazırlık net desenli hücreleri gibi bir çubuk yüksek oranda (&gt;% 80) sahip olacak. </li><li> Hücreleri yerleştikten sonra, Yıkama Tamponu # 2 supernatant ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri atın. Hücrelerin oda sıcaklığında dinlendiriniz, yine 10-20 dakika sürebilir ve süpernatantı atmak gerekir. </li><li> Yıkama işlemi tekrarlayın bir kez Yıkama Tamponu # 3, ve hücrelerin daha fazla kültür için hazır olacak. </li></ol><p class="jove_title"> Bölüm IV. Miyosit hücre kültürü </p><ol><li> % 5 serum Medya yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Hücrelerin doku kültürü tabak aktarmadan önce, 1x SFM plakaları yıkayın. 3-5 saat boyunca CO <sub>2</sub> doku kültürü inkübatör istenen yoğunluk ve inkübe hücrelere aktarın. </li><li> 1x SFM medya geçin. </li><li> Hücreleri dört gün kadar kültürlü ve deneyler için gerekli olabilir. </li></ol><p class="jove_title"> Bölüm V. Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç </p><p class="jove_content"> Protokolü doğru yapılır inverted mikroskop altında% 70 den fazla canlı kalp miyositler olmamalıdır. </p><p><img src="/files/ftp_upload/1308/fig1.jpg" alt="Şekil 1" /></p><p class="jove_content"> <strong>Tablo 1:</strong> 1 L Çözüm tarifi <strong>10X Ca <sup>2 +-KH</sup> Tampon:</strong> </p><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> kitle </td><td> Final Konsantrasyon </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 68,96 g </td><td> 1180 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 3.58 g </td><td> 48 mm </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 59.58 g </td><td> 250 mm </td></tr><tr><td> K <sub>2</sub> HPO <sub>4</sub> </td><td> 2.85 g </td><td> 12,5 mm </td></tr><tr><td> MgSO <sub>4</sub> </td><td> 3.08 g </td><td> 12,5 mm </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Tablo 2:</strong> 1 L <strong>Tampon A</strong> Çözüm <strong>tarifi:</strong> <br /><br /> 100 ml 10X KH tampon 1.98 g glukoz ve glukoz ile yakın fizyolojisi durumu (~ 300) ozmolarite ayarlayın son hacmi 1 L. getirmek. NaOH ile pH 7.4 &#39;e getirin. </p><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> - </td><td> Kitle </td><td> Final Konsantrasyon </td></tr><tr><td> 10X KH Tampon </td><td> 100 mL </td><td> 100 ml. </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 1.98 g </td><td> 11 mm </td></tr><tr><td> 1 L Getir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH ile pH 7.4 Getir </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Glukoz ile yakın fizyolojik durumu (~ 300) ozmolarite ayarlayın. </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Tablo 3: Enzim Tamponlar</strong> Çözüm tarifi </p><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> kitle </td><td> Final Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip II </td><td> 25 mg </td><td> 0.05% (w / v) </td></tr><tr><td> Proteaz XIV. </td><td> 10 mg. </td><td> % 0,02 (w / v) </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 0.025 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Karnitin </td><td> 0.020 g </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Boğa </td><td> 0.031 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Glutamik asit </td><td> 0.020 g </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> 0.1 M CaCl <sub>2</sub> </td><td> 12.5 uL </td><td> 25 UM </td></tr><tr><td> Bir tampon </td><td></td><td> 50 ml doldurun </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Tablo 4:</strong> 25X BDM / Taurin / BSA (B / T / B) Çözüm tarifi </p><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> kitle </td><td> Final Konsantrasyon </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 0.076 g </td><td> 125 mm </td></tr><tr><td> Boğa </td><td> 0.094 g </td><td> 125 mm </td></tr><tr><td> BSA </td><td></td><td> % 0,1 (w / v) </td></tr><tr><td> Bir tampon </td><td></td><td> 6 ml doldurun </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Tablo 5: Tampon B</strong> ve <strong>Yıkama Tamponlar</strong> Çözüm tarifi </p><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> <strong>Tampon:</strong> </td><td> <strong>B</strong> </td><td> <strong># 1</strong> </td><td> <strong># 2</strong> </td><td> <strong># 3</strong> </td></tr><tr><td> <strong>Ekle:</strong> </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.5 M CaCl <sub>2</sub> </td><td> 0,4 mL </td><td> 0.1 mL </td><td> 0.125 ml </td><td> 0.15 mL </td></tr><tr><td> <strong>CaCl <sub>2</sub> Final konsantrasyonu</strong> </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1.25 mM </td><td> 1.5 mM </td></tr><tr><td> 25X B / T / B </td><td> --- </td><td> 2 mL </td><td> 2 mL </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Nihai hacmi Tampon </td><td> 200 mL </td><td> 50 ml </td><td> 50 ml </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Tablo 6:</strong> Kültürleme Medya İçin Çözüm Tarif </p><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> <strong>2X Serum Medya (SFM)</strong> </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"><strong> </strong></td><td rowspan="2"></td><td> <strong>Final Konsantrasyon</strong> </td></tr><tr><td> <strong>(Seyreltme sonra)</strong> </td></tr><tr><td> Karnitin </td><td> 0.099 g </td><td> 10 mM (5 mM) </td></tr><tr><td> Boğa </td><td> 0.063 g </td><td> 10 mM (5 mM) </td></tr><tr><td> Kreatin </td><td> 0.075 g </td><td> 10 mM (5 mM) </td></tr><tr><td> Antimikotik / antibiyotik </td><td> 0.5 ml </td><td> % 1 (% 0.5) (v / v) </td></tr><tr><td> Medya 199 </td><td> 45 ml </td><td> 50 ml doldurun </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> <strong>1X SFM</strong> </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> <strong>Final Konsantrasyon</strong> </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 ml </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Medya 199 </td><td></td><td> 50 ml doldurun </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> <strong>1X% 5 serum Medya</strong> </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> <strong>Final Konsantrasyon</strong> </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 ml </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 2.5 mL </td><td> % 5 (v / v) </td></tr><tr><td> Medya 199 </td><td></td><td> 50 ml doldurun </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CaVbeta+subunits,+and+lack+of+functional+reserve,+in+protein+kinase+A+modulation+of+cardiac+CaV1.2+channels.">Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels.</a> <em style='font-style: italic'>Circ Res</em>. <b>102</b> (7), e54-e64 (2008).</li><li>SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+modulatory+effects+of+five+human+auxiliary+beta2+subunit+splice+variants+on+L-type+calcium+channel+gating.">Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys</em>. , 84-845 (2003).</li></ol>

<p class="jove_content"> Kritik bir adım, izole kalp perfüzyon sistemi üzerinde asılı olduğu hızı. Enzimatik sindirim sürenin uzunluğu, her bir sıçan için biraz farklı olabilir. Ayarı, kalp, sindirim düzenli bir süre sonra ne kadar yumuşak olur bağlıdır. Enzim sindirimi yavaş Ca <sup>2 +-hoşgörülü</sup> sağlıklı hücreleri elde etmek için gerekli Ca <sup>2 +</sup> sonra kurtarma. </p><p class="jove_content"> Hiyalüronidaz Proteaz XIV yerine kullanılır hariç kobay için, protokol ile aynıdır. Tipik olarak, onl...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6191</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9541</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9666</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO<sub>4</sub></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl<sub>2</sub></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical</td>
<td>LS004176</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease XIV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carnitine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C9500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3294</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Creatine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-009-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media 199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>variable flow chemical pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-077-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

primary culture of adult rat heart myocytes

<p class="jove_content">Kültüre birincil yetişkin kemirgen kalp hücrelerinin Kardiyovasküler araştırmalar için önemli bir model sistem. Bununla birlikte, sağlam, işlevsel kültür yetişkin miyositler kurulması birçok araştırmacı için, hız sınırlayıcı teknik açıdan zor bir adım olabilir. Burada, birkaç gün süreyle kültür canlı kalır yetişkin sıçan kalp miyositler yüksek verim elde etmek için bir protokol nitelendirdi. Kalp düşük Ca altında izole ve kollajenaz ve proteaz ile perfüze<sup&gt; 2 +</sup&gt; Koşulları tek miyositler kurtarmak için. Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dayanıklı hücrelerin ekstrasellüler Ca kademeli artışlar elde edilir<sup&gt; 2 +</sup&gt; Takip eden üç yıkama adımları konsantrasyon. Hücreler, süzülmüş, kültür ortamı yeniden süspanse ve laminin kaplı bordroları kaplama vardır. Bu protokol kullanılarak elde Kültüre miyositler dört gün için geçerli değildir ve elektrofizyoloji, biyokimya, görüntüleme ve moleküler biyoloji de dahil olmak üzere pek çok deneyler için uygundur.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes at JoVE.com

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

<p class="jove_content">Bu çalışmada, yetişkin sıçan kalp miyositler izole ve kültürü tipik bir şekilde tanımladı. Kollajenaz ve proteaz tek miyositler sindirimi ve izole etmek için kullanılır. Miyositler Çoğu deney gereksinimlerini karşılamak bu protokolü takip kültürü.</p>

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

primary-culture-of-adult-rat-heart-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Görüntüleme.  Columbia University. Bu çalışmada, yetişkin sıçan kalp miyositler izole ve kültürü tipik bir şekilde tanımladı. Kollajenaz ve proteaz tek miyositler sindirimi ve izole etmek için kullanılır. Miyositler Çoğu deney gereksinimlerini karşılamak bu protokolü takip kültürü.