Teil I. Vorbereitung für die Chirurgie <ol><li> Am Tag vor der Ratte Chirurgie, stellen Sie sicher, dass alle Lösungen hergestellt werden, aber fügen Sie keine Enzyme noch. Puffer A, B und der Waschpuffer sollten alle für die Sterilität gefiltert werden, bevor Lagerung. Die Puffer sollten alle bei 4 ° C gelagert werden </li><li> 6-well-Zellkulturplatten muss mit 10-20 pg / mL Laminin in 2 mL 1XSFM am Vortag sowie beschichtet werden, und sollte bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator gelagert werden. </li><li> Am Tag der Operation, bereiten die chirurgischen Instrumente durch Sterilisieren der Klemme, Schere, Pinzette und mit 70% Ethanol und lassen Sie sie auf Küchenpapier trocknen. </li><li> Einer 1 ml Spritze mit 0,5 ml Heparin-Lösung (90 U / ml) gefüllt ist fertig. </li><li> Nun ist es gute Praxis, die Perfusionsapparatur, indem Sie durch 70% Ethanol, mit der Schlauchpumpe in umgekehrter waschen. Sobald Sie fertig sind Spülen mit Ethanol, spülen Sie die Geräte mit doppelt destilliertem Wasser und schließlich mit Puffer A. spülen Der Durchfluss wird in einem Becherglas in einem 37 ° C Wasserbad gestellt gesammelt. </li><li> Zur Vorbereitung der Reinigung Perfusionsapparatur, füllen Sie die richtige Spritze Rohr mit 40 ml Puffer A und die linke Spritze Rohr mit 40 ml Puffer B </li><li> Prime der Infusionsschlauch an der Spitze des Katheters, indem Buffer A durch die Vorrichtung fließen. Refill, um den Puffer Eine Spritze, die 40 mL Ebene. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in den Schlauch nach diesem Schritt gefangen. </li><li> Jetzt, in der Nähe des Puffers A Spritze Absperrhahnventil und wiederholen Sie den Vorgang mit Puffer B, so dass die Infusionsschlauch ist jetzt mit Puffer B grundiert </li><li> Schließlich ist die Perfusionsapparatur mit dem Buffer B Absperrhahn offen gelassen, aber mit der Strömung gestoppt mit dem Regler auf der IV-Leitung. </li><li> Entsorgen Sie die Puffer fließen, wenn auch in der Sammlung Becher. </li><li> Das letzte, was vor der Operation besteht darin, die benötigten Enzyme zu Ihrem Stammlösung hinzufügen und dann filtern Sie die Enzymlösung ebenso wie die anderen Lösungen wurden filtriert am Vortag. Sobald gefiltert, kann diese Lösung bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. </li></ol> Part II. Der Rat Herzen Dissektion <ol><li> Nach Standardprotokoll euthanize der Ratte mit Isofluran in einer Gaskammer. </li><li> Sterilisieren der Schnitt-Bereich auf den Brustkorb mit 70% Ethanol. </li><li> Öffnen Brust mit einer Schere und setzen Herzen. </li><li> Inject linken Ventrikel mit 0,5 mL Heparin-Lösung (90 U / mL). </li><li> Nehmen Sie Herz mit großer Teil der Aorta intakt, in eiskaltem Puffer B </li></ol> Teil III. Myozyten Isolation <ol><li> Eine typische Ratte Herz sollte einen hohen Anteil an stäbchenförmigen Myozyten (im Gegensatz zu toten Zellen abgerundet Gegensatz), wenn die folgende Prozedur ist korrekt eingehalten werden. </li><li> Um zu beginnen, Klemme Aorta, um den Katheter. Die Spitze des Katheters sollte nicht zu weit in das Herz geschoben werden, um gute Durchblutung des Herzens durch die Herzkranzgefäße zu gewährleisten. </li><li> Einmal eingespannt, binden die Aorta, den Katheter mit einer Naht. </li><li> Dann öffnen Sie den IV-Leitung Regler, um eine schnelle Tropfgeschwindigkeit (~ 60 Tropfen / min) ermöglichen und damit Buffer B zum Auswaschen des Herzens. </li><li> Während Buffer B waschen, verwenden Sie die kleine Schere und Pinzette, um den Vorhöfen und keine Fett-oder Lungengewebe Festhalten an dem Herzen zu entfernen. </li><li> Nach Buffer B beendet ist, schalten Sie den Fluss, um Buffer A. </li><li> Während Buffer A darf für 5 Minuten fließen, sollten mehrere kleine Aufgaben schnell durchgeführt werden. </li><li> First, warm die Enzymlösung in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Schließlich, als Puffer A von der Spritze (aber immer noch im Schlauch) aufgebraucht ist, laden Sie 50 mL der Enzymlösung in Spritze A der Perfusionsapparatur </li><li> Es ist nun notwendig, alle Flow-Through aus der Sammlung Becherglas im Wasserbad (mit einer Pipette) zu verwerfen, bis die Enzymlösung perfundiert Herzen. </li><li> Sobald der Enzymlösung Herzen durchblutet, aktivieren Sie die Schlauchpumpe, die bis zum Enzymlösung aus dem Sammelbehälter Becher Transfer Spritze A. aufzufüllen eingestellt </li><li> Lassen Sie die Enzymlösung durch das Herz für 10 min fließen. Als Herzstück verdaut, beginnt es zu sehen aufgedunsen. </li><li> Add 37,5 &amp;mgr; l 0,1 M CaCl 2 der Enzymlösung in Spritze A, um eine wirksame Konzentration von 0,1 mM Ca 2 + geben. </li><li> Nach 10 Minuten erhöhen die Konzentration von Calcium bis 0,2 mM, indem eine zusätzliche 50 &amp;mgr; l 0,1 M CaCl 2 bis Spritze A und lassen Sie die Perfusion für weitere 10 Minuten gehen. </li><li> Schneiden Sie die Herzkammern und den Transfer zu einem kleinen sterilen Becherglas mit 20 mL Enzymlösung. </li><li> In das Becherglas Erhöhung der Calcium-Konzentration auf 0,4 mM durch Zugabe von 40 mehr &amp;mgr; l 0,1 M CaCl 2. </li><li> Gently mince das Herz in 10 oder mehr Stücke mit ein Paar kleinen sterilen Schere. </li><li> Inkubieren Sie die Becher für 5 Minuten bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> 40 ml von 0,1 M CaCl 2 zugeben wirksame Konzentration von 0,6 mM Ca 2 + und sanft verreiben Herzen Stücke mit einer Kunststoff-Transfer-Pipette 3-5 mal. </li><li> Nach Inkubation für weitere 5 Minuten bei 37 ° C, 40 ml von 0,1 M CaCl 2 und sanft wie zuvor verreiben. </li><li> Separate verdaut einzelnen Myozyten aus nicht verdaut Bindegewebe mit Filtration durch einen sterilen 500 um Maschenweite. </li><li> Lassen Sie die Zellen in einer 50 ml Tube für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu regeln. </li><li> Überstand mit einer Pipette übertragen. </li><li> Vorsichtig die Zellen in Waschpuffer # 1 und damit die Zellen für 10-20 min bei Raumtemperatur zu regeln. </li><li> Während die Zellen Abrechnung sind, nehmen Sie eine kleine Teilmenge, und diese Zeit nutzen, als Chance, die Qualität und die Lebensfähigkeit der Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu beurteilen. Eine gute Vorbereitung haben einen hohen Anteil (&gt; 80%) der Stange, wie Zellen mit knusprigen Streifen. </li><li> Sobald die Zellen angesiedelt haben, den Überstand verwerfen und sanft die Zellen in Waschpuffer # 2. Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur zu regeln, sollte die wiederum zu 10-20 Minuten, und den Überstand verwerfen. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal mit Waschpuffer # 3, und die Zellen werden bereit sein für die Kultur. </li></ol> Teil IV. Myozyten Zellkultur <ol><li> Vorsichtig die Zellen in 5% Serum Media. Vor der Übertragung der Zellen auf Zellkulturplatten, waschen Sie die Platten mit 1x SFM. Übertragen Sie die Zellen in eine gewünschte Dichte und inkubieren in einer CO 2-Gewebekultur-Inkubator für 3-5 Stunden. </li><li> Schalten Sie die Medien auf 1x SFM. </li><li> Die Zellen können kultiviert werden für bis zu vier Tage und wird als für Experimente benötigt. </li></ol> Teil V. repräsentative Ergebnisse / Outcome Es sollten mehr als 70% leben Herzen Myozyten unter inversen Mikroskop, wenn das Protokoll korrekt durchgeführt werden. <img src="/files/ftp_upload/1308/fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Tabelle 1: Lösung Rezept für 1 L 10x Ca 2 +-freien KH Buffer: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Masse </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 68,96 g </td><td> 1180 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 3,58 g </td><td> 48 mm </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 59,58 g </td><td> 250 mM </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> 2,85 g </td><td> 12,5 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 3,08 g </td><td> 12,5 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Lösung Rezept für 1 L Puffer A: Add 1,98 g Glucose in 100 ml 10x KH Buffer und bringen bis zu einem Endvolumen von 1 L. Adjust Osmolarität in der Nähe Physiologie Bedingung (~ 300) mit Glucose. Bringen Sie auf pH 7,4 mit NaOH. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> - </td><td> Masse </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 10X KH Buffer </td><td> 100 mL </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 1,98 g </td><td> 11 mM </td></tr><tr><td> Bring to 1 L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bringen Sie auf pH 7,4 mit NaOH </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Passen Osmolarität in der Nähe physiologischen Zustand (~ 300) mit Glucose. </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Lösung Rezept für Enzyme Buffers <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Masse </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Collagenase Typ II </td><td> 25 mg </td><td> 0,05% (w / v) </td></tr><tr><td> Protease XIV </td><td> 10 mg </td><td> 0,02% (w / v) </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 0,025 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Carnitine </td><td> 0,020 g </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Taurin </td><td> 0,031 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Glutaminsäure </td><td> 0,020 g </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M CaCl 2 </td><td> 12,5 uL </td><td> 25 um </td></tr><tr><td> Puffer A </td><td></td><td> Füllen Sie zu 50 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Lösung Rezept für 25X BDM / Taurin / BSA (B / T / B) <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Masse </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 0,076 g </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> Taurin </td><td> 0,094 g </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> BSA </td><td></td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Puffer A </td><td></td><td> Füllen Sie bis 6 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 5: Lösung Rezept für Buffer B und Waschpuffer <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Buffer: </td><td> B </td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td></tr><tr><td> Add: </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M CaCl 2 </td><td> 0,4 ml </td><td> 0,1 mL </td><td> 0,125 ml </td><td> 0,15 ml </td></tr><tr><td> Endkonzentration von CaCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1,25 mM </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> 25X B / T / B </td><td> --- </td><td> 2 mL </td><td> 2 mL </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Buffer A auf Endvolumen </td><td> 200 mL </td><td> 50 mL </td><td> 50 mL </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table> Tabelle 6: Lösung Rezept für Kulturmedien <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 2X Serum-freien Medien (SFM) </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> </td><td rowspan="2"></td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> (Nach Verdünnung) </td></tr><tr><td> Carnitine </td><td> 0,099 g </td><td> 10 mM (5 mM) </td></tr><tr><td> Taurin </td><td> 0,063 g </td><td> 10 mM (5 mM) </td></tr><tr><td> Creatine </td><td> 0,075 g </td><td> 10 mM (5 mM) </td></tr><tr><td> Antibiotikum / Antimykotikum </td><td> 0,5 ml </td><td> 1% (0,5%) (v / v) </td></tr><tr><td> Medien 199 </td><td> 45 mL </td><td> Fill zu 50 mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X SFM </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 mL </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Medien 199 </td><td></td><td> Fill zu 50 mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1x 5% Serum Medien </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 mL </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 2,5 ml </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Medien 199 </td><td></td><td> Fill zu 50 mL </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CaVbeta+subunits,+and+lack+of+functional+reserve,+in+protein+kinase+A+modulation+of+cardiac+CaV1.2+channels.">Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels.</a> Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).</li><li>SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+modulatory+effects+of+five+human+auxiliary+beta2+subunit+splice+variants+on+L-type+calcium+channel+gating.">Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating.</a> Biophys. , 84-845 (2003).</li></ol>

Ein entscheidender Schritt ist die Geschwindigkeit, mit der das isolierte Herz auf der Perfusion System eingehängt ist. Die Länge der enzymatische Verdauung Zeitraum kann ein wenig anders für jede Ratte. Die Einstellung hängt davon ab, wie weich das Herz wird nach der regulären Zeit der Verdauung. Die langsam Erholung der Ca 2 + nach Enzymverdau unerlässlich für den Erhalt von Ca 2 +-tolerant gesunden Zellen ist. Für Meerschweinchen, ist das Protokoll, das gleic...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6191</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9541</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9666</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical</td>
<td>LS004176</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease XIV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carnitine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C9500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3294</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Creatine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-009-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media 199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>variable flow chemical pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-077-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primary culture of adult rat heart myocytes

Cultured primäre erwachsenen Nagetieren Herzzellen sind ein wichtiges Modellsystem für Herz-Kreislauf-Forschung. Dennoch können Etablierung von robusten, tragfähigen kultivierten adulten Myozyten eine technisch anspruchsvolle, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt für viele Forscher. Hier haben wir beschrieben, ein Protokoll zu einer hohen Ausbeute an erwachsenen Ratte Herz Myozyten, die lebensfähig bleiben in der Kultur für mehrere Tage zu erhalten. Das Herz ist isoliert und perfundiert mit Kollagenase und Protease unter niedrigen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Bedingungen zu erholen einzelnen Myozyten. Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Tolerante Zellen sind durch schrittweise Erhöhung der extrazellulären Ca erhalten<sup&gt; 2 +</sup&gt; Konzentration in drei aufeinander folgenden Waschschritten. Die Zellen werden gefiltert, in Kulturmedium resuspendiert und plattiert auf Laminin beschichteten rutscht. Cultured Myozyten erhalten mit diesem Protokoll sind lebensfähig für bis zu vier Tage und sind für die meisten Experimente einschließlich Elektrophysiologie, Biochemie, Imaging-und Molekularbiologie geeignet.

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Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

In diesem Papier haben wir beschrieben, eine typische Art und Weise zu isolieren und Kultur erwachsenen Ratte Herz Myozyten. Collagenase und Protease werden verwendet, um zu verdauen und zu isolieren einzelnen Myozyten. Myozyten kultivierten folgen Sie diesem Protokoll erfüllen die meisten Anforderungen Experiment.

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

primary-culture-of-adult-rat-heart-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Aufrufe.  Columbia University. In diesem Papier haben wir beschrieben, eine typische Art und Weise zu isolieren und Kultur erwachsenen Ratte Herz Myozyten. Collagenase und Protease werden verwendet, um zu verdauen und zu isolieren einzelnen Myozyten. Myozyten kultivierten folgen Sie diesem Protokoll erfüllen die meisten Anforderungen Experiment.

Serie: Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Organotypischen Kultur der Adult Kaninchen Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Forschung

Biologie

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Die Implantation von Engineered Tissue in der Ratte Herz

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Primärkultur von Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen und Assays Steroidogenic Funktionen

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...