אנו מודים ד&quot;ר סטיבן Austad למתן אותנו עם הגרסה הראשונה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH ו הרפואי אליסון קרן אל VG ו AS

1. לפני שמתחילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מספריים מלקחיים עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום stirrer מגנטי קטן בתוך כוס 30 מ&quot;ל, מכסים עם שתי שכבות של נייר, ועל החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 28 יחידות וונש / mL מניות פתרון של Liberase Blendzyme 3 במים סטריליים. בצע 0.5 aliquots מ&quot;ל ולהקפיא ב -20 ° C. הפשרה aliquot חדש לפני כל שימוש. הפתרון עשוי להופיע מעונן לאחר ההפשרה. וורטקס הפתרון עד שיתברר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את תרבות התקשורת הסלולרי. </li></ol> 2. דוגמה חיה הכנה זהירות: חיות בר עלולים להכיל פתוגנים כגון וירוס הכלבת. תמיד להיות מודעים לפתוח החדים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו והמקום פגר ב 4 ° C. עדיף להשתמש פגר מיד, אולם אם הדבר אינו מעשי כגון אם בעלי החיים שנאספו בשטח, פגרי ניתן להשתמש תוך 24 שעות. לאחר 24 שעות התשואה יורדת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את החיה בסוויטה כירורגית או במנדף כימי (לא מכסה המנוע בתרבית רקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור בית השחי הוא אתר נוח לאסוף דגימות עור כמו עור בבית השחי הוא רזה, מכיל פחות שומן, פרווה הוא פחות צפוף. נקו את האתר החתך עם אתנול 70%. ודא פרווה ספוגה אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הפרווה סביב האתר חתך באזמל חד. לגלח שטח גדול יותר מאשר באתר החתך הרצוי. נסו לצמצם חתכים בעור. ריסוס באזור עם אתנול 70% ולתת לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף דגימת עור בלו שבר כ 1 2 ס&quot;מ. לצבוט את העור עם מלקחיים רקמות, לגזור במספריים. נסו לא לחתוך את שכבת השומן בעור, כמו שומן מפריעה לעיכול collagenase. כדי לאסוף את דגימות ריאה, לשטוף את אזור החזה עם 70% אתנול, ולפתוח את העור על החזה במספריים על ידי ביצוע חתך T-צורתו ומשך לגזרים את דשי של העור. לשטוף את האזור שריר פתחה עם אתנול 70% ולתת להתייבש. חותכים את החזה באמצעות מלקחיים סטריליות ומספריים (חותכי להשתמש עצם לבעלי חיים גדולים יותר). השתמש בטכניקות סטרילי כדי למנוע זיהום האיברים הפנימיים. אל תיגע באיברים פנימיים עם מכשירים נגע פרווה של בעלי חיים. גזור שברי הריאות של כ 1 ס&quot;מ 2 באמצעות מלקחיים סטריליות ומספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה שברי מקום 50 צינורות מ&quot;ל עם PBS סטרילי כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף החיצוני של 50 מ&quot;ל עם שברי צינורות רקמה עם אתנול, ולקחת אותם אל מכסה המנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כראוי תשליך הפגר החי. </li></ol> 3. מחלץ תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את שברי רקמה לתוך צלחת 10 ס&quot;מ תרבות רקמות באמצעות אזמל סטרילי. אין להעביר PBS יותר מדי עם המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרקמה אל ~ 1 מ&quot;מ חלקים באמצעות שני ניתוחים. שימוש שני להבים באמצעות פעולה מספריים החל ממרכז ומושך מזה. שמור את הרקמה כידר, לא לחתוך חתיכה אחר חתיכה. כאשר חותכים את העור די דומה מרק, זה לא יהיה להפריד לחתיכות אבל יהיה למתוח דק. רקמת הריאה קל לחתוך, וזה יהיה להפריד לחתיכות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, העברת רקמות וחותכים כוס 30 מ&quot;ל סטרילי עם בר ומערבבים סטרילית. לשטוף את הצלחת המשמש לחיתוך רקמות עם 10 מ&quot;ל של DMEM/F12 התקשורת עם 0.14 יחידות וונש / mL Liberase Blendzyme 3, 1X אנטיביוטי / antimycotic, ולהוסיף הפתרון כוס 30 מ&quot;ל עם שברי הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הכוס בנייר כסף סטרילי, דגירה על 37 מעלות צלזיוס, תוך בחישה לאט לאט, במשך 30 עד 90 דקות. משך הדגירה תלוי בסוג מינים הרקמה. הקפד לא מעל לעכל את הרקמה. Best התשואות מתקבלים כאשר שברי הרקמה עדיין קיימות בסוף העיכול. העור לוקח זמן רב יותר לעיכול מאשר הריאה. העור מפני בעלי חיים גדולים לוקח יותר זמן לעכל. בדוק את מערכת העיכול לאחר 30 דקות, ולאחר מכן כל 10 דקות. כאשר העור והעיכול יושלם, התקשורת הופכת להיות מעונן ושברי העור נפרדים זה מזה, ואת הקצוות של החלקים להיות &quot;מעורפל&quot;. עיכול ריאות יש להפסיק כאשר שברי ריאות לשנות צבע אדום לבן ולהתחיל להרכיב סיבים דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון Pipet המכיל שברי הרקמה הלוך ושוב כדי לשבור את הגושים. העברת הפתרון שפופרת 50 מ&quot;ל סטרילי. אם השברים לעבור בקלות דרך קיצוץ 10 מ&quot;ל פיפטה והעיכול נעשה היטב. שוטפים את כוס 3 פעמים עם 10 מ&quot;ל של DMEM/F12 מדיה חם עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic ולהוסיף את התקשורת הצינור 50 מ&quot;ל עם שברי הרקמה. סגור את שפופרת 50 מ&quot;ל ומערבבים על ידי היפוך כמה פעמים. FBS בתקשורת יפסיק Liberase העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב 524 גרם של צנטריפוגה מתנדנד רקמה תרבות דלי דקות 5. הסר את supernatant. Resuspend את הכדור ב 10 מ&quot;ל של DMEM/F12 מדיה חם עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic. Pipet ההשעיה עםכוח מרבי לשבור את פיסות רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד 30 מ&quot;ל של DMEM/F12 התקשורת עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic, מערבבים צנטריפוגות ב 524 גרם של צנטריפוגה מתנדנד רקמה תרבות דלי דקות 5. חזור פעם נוספת כדי להסיר את עקבות Liberase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב 10 מ&quot;ל של DMEM/F12 התקשורת עם FBS 15%, 1X אנטיביוטי / antimycotic והעברה צלחת 10 ס&quot;מ רקמה תרבות ומניחים תרבות רקמות החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 3% O 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את צלחות כל יום במשך fibroblasts וצבע התקשורת. אם הבידוד היה מוצלח, fibroblasts לזחול מתוך שברי רקמות לצרף צלחת (איור 1). פיברובלסטים מתחילים לצאת שברי הרקמה תוך 2-5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צבע השינויים התקשורת צהובה, זה מצביע על אפשרות של זיהום או הצפיפות של תאים. בדוק את הצלחות מתחת למיקרוסקופ בהגדלה גבוהה. אם חיידקים, פטריות, או תולעים נמצאים להשליך את הלוחות (זה רק לעתים נדירות בעיה עם חיות מעבדה, אך עלולה להתרחש כאשר הדגימות שנאספו בטבע). אם הזיהום לא קיים, אבל התקשורת שינה את צבעו, זו נגרמת על ידי או יותר מדי תאים או רקמות שברים רבים מדי להציב צלחת זהה. אם יותר מ 60% של צלחת מכוסה על ידי fibroblasts המצורף, לשנות את התקשורת על הצלחת ולהעביר את שברי רקמות צלחת חדשה עם המדיה החדשה. אם לא fibroblasts רבים מחוברים לצלחת, לשנות את התקשורת לפצל את פיסות הרקמה ל 2-4 צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים, אם התקשורת לא שונו קודם לכן, לשנות את התקשורת ולהעביר את שברי רקמות צלחת חדשה עם המדיה החדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ושברי תאים ורקמות עבור 7 ימים נוספים. ביום 14 כל fibroblasts קיימא יש יצאו שברי הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 14 ימים מתחילת בידוד התא, להשליך את התקשורת הישנה ושברי רקמות, לקצור את התאים צלחת אותם על צלחת חדשה 5x10 5 תאים / EMEM צלחת עם FBS 15%, 1X פניצילין / סטרפטומיצין, ללא חומצות האמינו החיוניות , נתרן pyruvate. התקשורת EMEM יתמכו בצמיחה של fibroblasts סוגי תאים בלבד ושאר ימות או להפסיק מתרבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהתאים מגיעים מפגש 80-90%, להקפיא aliquot של תאים לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך culturing התאים על ידי פיצול אותם 5x10 5 תאים / צלחת כאשר התאים מגיעים מפגש 80-90%. </li></ol> 4. נציג תוצאות Fibroblasts רגיל הם תאים גדולים עם בליטות בולט (lamellipodia) (איור 2). Fibroblasts לגדול בשכבה. תרבות גדל בריא מכיל תאים 1-10% בשלב M, מוכר מעוגל למעלה כמו תאים מוגבה מעל פני השטח של הצלחת, אך לא מנותקת מן הצלחת (איור 3). בדרך כלל, צלחת 10 ס&quot;מ seeded עם 5 תאים 5x10 הופך ומחוברות בימים 3-4. זמן ההכפלה משתנה מאוד בין המינים, והיא עלולה להיות גדולה יותר עבור כמה מינים חיים ארוכים מכרסם 1. כאשר תאים למלא צלחת עוצרים התפשטות בשלב G1. צלחת ומחוברות אופיינית של fibroblasts מכיל שכבה של תאים צפופים (איור 4). כאשר התאים מגיעים מפגש 90% הם מוכנים פיצול. אם תרצה, התאים יכול להישמר על צלחת ומחוברות נעצר לפרקי זמן קבוע עם שינויים המדיה (פעם או פעמיים בשבוע). <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בידוד פיברובלסטים מהעור העכבר (א) ו - ריאה (B). התקשורת שונתה כדי להסיר תאים פנויים ופסולת לפני לקיחת תמונות ביום 7. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ריאה עכבר fibroblasts. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. שדה של fibroblasts העכבר המכיל תאים בשלב-M, צילם בהגדלה של 10X. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. צלחת ומחוברות של fibroblasts העכבר, צילם בהגדלה של 10X.

<ol>
	<li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+.">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li><li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Fibroblasts העיקרי רגיל לספק חלופה מצוינת הוקמה שורות תאים סרטניים מחקר ביולוגי. יתרון חשוב של fibroblasts היא שהם אינם נושאים מוטציות אונקוגנים ו מדכאי הגידול במחזור לשמור על שלמות התא מחסומים. זה עושה fibroblasts נורמלי מערכת המועדפת עבור המחקרים של ויסות מחזור התא, תיקון DNA, אפופט...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM/F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>01437-036</td>
<td>The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15420-096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TM Research Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05401127001</td>
<td>Replacement enzyme.</td>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.</td>
<tr>
<td>EMEM media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-203</td>
<td>The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.</td>
</tr>
<tr>
<td>Feathered #21 disposable, sterile scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Multiple suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Three Gas Control incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Forma or Heraeus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

establishing primary adult fibroblast cultures from rodents

החשיבות של שימוש תאים ראשוניים, במקום שורות תאים סרטניים, ללימודים ביולוגיים הופך להכרה רחבה. תאים ראשוניים הם העדיפו במחקרים אפופטוזיס של מחזור התא, שליטה, תיקון דנ&quot;א, כמו תאים סרטניים לשאת מוטציות בגנים המעורבים בתהליכים אלה. תאים ראשוניים לא יכול להיות מתורבת ללא הגבלת זמן, בשל תחילת ההזדקנות replicative או aneuploidization. לפיכך, תרבויות חדשות צריכים להיות הוקמה על בסיס קבוע. ההליך עבור בידוד של fibroblasts מכרסם עובריים היא מבוססת היטב, אבל בידוד תרבויות פיברובלסטים מבוגרים לעתים קרובות אתגר. Fibroblasts מכרסם למבוגרים מבודדים מודלים העכבר של מחלות אנושיות יכולה להיות מלאה המועדפת כאשר משווים אותם fibroblasts מחולים האדם. יתר על כן, fibroblasts מבוגר הם חומר זמין רק כאשר עובדים עם מכרסמים בר שבו נשים בהריון לא ניתן להשיג בקלות. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד והתרבות של fibroblasts מבוגר מהעור מכרסם והריאות. השתמשנו בהצלחה הליך זה לבודד fibroblasts מתוך למעלה מעשרים מינים מכרסם מעכברים וחולדות מעבדה כדי מכרסמים בר כגון בונה, קיפוד, והסנאי.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents at JoVE.com

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד ותחזוקה של תרבויות פיברובלסטים העיקרי של העור, רקמת הריאות של מכרסמים בר.

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

49.1K Views.  University of Rochester. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד ותחזוקה של תרבויות פיברובלסטים העיקרי של העור, רקמת הריאות של מכרסמים בר.

Video: Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...