פרויקט זה נערך במימון כימית, ביולוגית, רדיולוגית ואת גרעיני (CBRN) המחקר והטכנולוגיה היוזמה (CRTI) של הסוכנות הקנדית לפיקוח מזון, ואת המחקר Prion אלברטה המכון. הקרן הלאומית למדע הטבע של סין סיפקו מלגה (מס &#39;30620120430) כדי וו שו. המחברים מודים ברנט בייקר פרד ואן Herk, כמו גם רות Barbieri, ליסה Kalischuk-Tymensen, אנדרו אולסון, לורנה זלינגר, ג&#39;ף Wallins ו Homayoun Zahiroddini לקבלת סיוע טכני שלהם.

שכפל מבנים קומפוסט נבנו במכון המחקר Lethbridge מרכז (LRC) ב Lethbridge, אלברטה, קנדה (איור 1). גדול מלבני קש שעורה חבילות (260 x 120 x 80 ס&quot;מ, אורך x רוחב X גובה) שימשו את הקירות, חבילות קטנות (100 x 40 x 45 ס&quot;מ) על הרצפה. חבילות גדולות היו כה מוכווני הקירות היו 120 ס&quot;מ עובי, אשר יציבות קיר מוגדל ושמירת חום. חבילות קטנות להרכיב את הרצפה היו אוריינטציה עם החוט ריצה אופקית על מנת למקסם את ספיגת במקרה של דליפה, מניב בקומה 45 ס&quot;מ עובי. מימדים הכולל של המבנים היו 25 mx 5 mx 2.4 מ &#39;אורך x רוחב X גובה). אתר הבנייה היה מדרון של כ 1, מבנים היו מכוונת לעודד זרימת leachate לקראת יציאת הדגימה שאנחנו מוכנס להערכת הניסוי. זבל אבוס לחים היה מעורב סודה ידי עיבוד באמצעות מפזר זבל להיערם עבור 24 שעות לפני הקמת המבנים הבלימה. הבונקרים קומפוסט היו מכוסים ביריעות פלסטיק כבד שחור / לבן נפוץ כדי לכסות את ערימות תחמיץ. עודף מספיק נותר מעל לכל כיוון כדי לאפשר בסופו של דבר מתקפל ואיטום המיטה קומפוסט בתוך הבונקר. כדי להילחם ברוח הסביבה, צמיגים שימשו משקל הפלסטיק בבונקר עד קש היה טעון, אך אלה הוסרו לפני פגרי שיוצבו. לאחר הדגימה leachate הנמל (הכרחי הדגימה ניסיוני בלבד) הותקן, קש שעורה רופף נוספה למבנה ביו הבלימה כדי ליצור שכבת הבסיס כ -40 ס&quot;מ עובי. דבר זה הושג על ידי אספקת חבילה אחת עגולה עם מטעין חזיתי, באופן ידני הפצת קש לאורכו של הבונקר. שישה עשר בקר אבוס mortalities הונחו על המיטה קש. אלה היו בהמות שמתו במהלך 48 השעות הקודמות feedlots מסחרי סמוך, הרוב שיש נכנעו מחלה נשימתית שור. פגרי היו מיושרים רוחבי בתוך הבונקר קומפוסט (איור 1), עם רווח של כ 0.5 מ &#39;בין הפגרים. כדי לספק אוורור פסיבי, באורכים של מחורר צינורות ניקוז גמישה מפלסטיק (בקוטר 15 ס&quot;מ) שהונחו בין פגרי הסמוך, מוטבע בתוך בסיס קש רופף. קצוות של צינורות כוונו אנכית לאורך קירות הצד הארכת מעבר העליון של הבונקר, והחזיק במקום באופן זמני באמצעות צמיגים הארכת בעבר השטח העליון של הקירות. טרום מותנה זבל אבוס נטען לתוך הבונקרים כדי לכסות את פגרי לעומק הסופי של 1.6 מ &#39; זבל היה טעון על הקיר הצדדי של הבונקר, נע מקצה אחד של המבנה לכיוון השני. אחזור מדגם הפירמידות המתוארים להלן הוצבו בעומקים שנקבעו שלהם בתוך שכבת זבל בשלב זה. לאחר הבונקר היה מלא, יריעות הפלסטיק היה מקופל מעל זבל נערמו ואת הקצוות של הצינור מחורר הועברו דרך זה, כך שהם מוקמו החיצוני לעטוף את. ניילון היה חתום קלטת להקים מכשול הבלימה סביב, פגרי קש וזבל. שמונה פתחי אוורור (50 x 50 x 15 ס&quot;מ) שהונחו על החלק העליון של כל מבנה לקדם אוורור פסיבית, בצורת האות T מחברים צורפו בסוף כל אחד באורך של צינורות מחוררים כדי לקדם את זרימת האוויר לתוך הצינורות. במחקר זה טייס, תיקונים ניסיוניים למבנים קומפוסט שולבו כדי לאפשר חקירה של איון הפתוגן והשפלה רקמות במהלך תהליך קומפוסט סטטי. רקמות דגימות חיידקים מראש לכמת לפי משקל רקמה או ספירה של חיידקים היו חום אטום לתוך שקיות ניילון מדגם (5 x 9 ס&quot;מ, 50 מיקרומטר גודל הנקבוביות), ו ארוזים בתוך כלובים מיוחדים פלדה פירמידה, כאזור הפירמידות בייקר אחזור (BRP) 1. פירמידות אלה נועדו לאפשר שליפה שלהם המטריצה ​​קומפוסט במרווחים במהלך תהליך קומפוסטציה ללא ברצינות להתפשר על בלימה או לשנות את הדינמיקה של תהליך קומפוסט בתוך BRP, שמונה שקיות (כל אחד של שמונה סוגי המדגם) היו משובצים באותו זבל ששימש למלא את הבונקר, מסודרים כך שכל התיק היה מוקף בזבל ושקיות לא היו בקשר ישיר אחד עם השני. BRPs זבל ו שק מלא צורפו אורכי שרשרת בכניסה ו תלוי בעומק של 80 ס&quot;מ ו -160 ס&quot;מ בתוך המטריצה ​​קומפוסט. השרשראות היו מעוגנים עמודי עץ פורש הבונקרים ב 1.5-מ מרווחים (איור 1). T-סוג צמדים תרמיים להציב BRP כל נוהלו גם לאורך שרשראות נתונים לוגר בעמדה חיצונית למבנה קומפוסט. במרווחי זמן שצוין, BRPs נמשכו אנכית קומפוסט באמצעות הריצה לבוא לאורך כבל חולץ, ואת בניילון נצמד מחדש אטום. באקלים צחיח טבעי בדרום אלברטה, כמות המשקעים הקטנה שהתקבלו במהלך tהתקופה שלו, אבל בניילון צורת כיפה החומר קומפוסט היו יעילים לקידום נגר לרוחב להיספג על ידי קירות הבונקר קש.

<ol>
	<li>Reuter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+temporal+collection+of+tissue+and+microbial+samples+from+static+composting+systems.">A simple method for temporal collection of tissue and microbial samples from static composting systems.</a> Canadian Biosystems Engineering. 50, 6.17-6.20 (2008).</li><li>Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biosecure+composting+system+for+disposal+of+cattle+carcasses+and+manure+following+infectious+disease+outbreak.">A biosecure composting system for disposal of cattle carcasses and manure following infectious disease outbreak.</a> J. Environ. Qual. 38, 437-450 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לאחר 147 ימים של קומפוסט סטטי, הפסדים של המסה הכוללת, חומר יבש (DM), חומר אורגני, פחמן וחנקן סך הכל היו 23.7, 35.6, 52.9, 49.6 ו 41.4%, בהתאמה 2. בתוך כל מבנה, נפח של חומרים קומפוסטציה ירד 118-71 מ &#39;3. פירוק של רקמות שור פיקוח מדורגת כמו מוח עצם&gt;&gt; פרסה. רק לאחר 7 ימים של קומפוסט,&gt; 90% של רקמת המוח DM כבר מפורקת, ו -80% פרסה DM נרקבו בתוך ד 56 של קומפוסט. אובדן מוחלט של יכולת הקיום של Escherichia coli O157: H7 ו ניוקסל הושג תוך 14 ימים. נמרץ מערכות ייצור בעלי חיים פגיעים במיוחד טבעי או מכוון להתפרצות מחלות זיהומיות. והשיכון מספר רב של בעלי חיים בתוך שטח מוגבל מעורר גורמים מדבקים ביותר להפצת במהירות ברחבי האוכלוסייה. בלימה הוא המפתח לשליטה כל התפרצות מחלה מידבקת, ובכך צמצום אוכלוסיה משמש לעתים קרובות כאמצעי למניעת התפשטות של הסוכן זיהומיות לאוכלוסיית בעלי חיים גדולים יותר. התרחיש צמצום אוכלוסיה תוצאות במספרים גדולים של פגרי בעלי חיים נגועים וזבל הדורשים סילוק מהיר. קומפוסט משאיל את עצמו כשיטה מהירה תגובה עבור סילוק פגרים נגועים, כמו גם דשן ואדמה שעשויים הנמל חומרים מזהמים. אנו מתווה הליך קומפוסט כי ניתן לבצע באתר של פרוץ המחלה, תוך שימוש בחומרים זמינים בחווה או מהחווה אספקת חנויות מקומיות. במחקר שלנו, גורמים מדבקים הקשורים בקר פגרי בקר וזבל היו מומת בתוך 14 ימים מיום קומפוסט, קומפוסט הטמפרטורות עלו 55 ° C במשך חודש אחד או יותר. הפקה של leachate היה נמוך ביותר, כנראה בשל האופי ספיגה של שכבת קש רופף הבסיס. נתקל אופטימיזציה תוכן DM ב חניכה של קומפוסט שלנו התשואות סך של leachate היו פחות מ -3 עמודים לדקה של המסה קומפוסט ראשוני (כלומר, &lt;300 גרם לכל המבנה). קוליפורמים התגלו leachate במהירות של עד 5.8 LOG10 CFU / מ&quot;ל ​​ב 14 ימים, אך לא היו לגילוי לאחר 101 ימים של קומפוסט. אחרי 147 ימים, פגרי הבקר היו כמעט מושפל לחלוטין עם רק כמה עצמות ארוכות להיות מוכרת. העצמות היו מושפל עוד יותר במהלך מחזור פתוח סוללה פתלתלה נוספים קומפוסט לאחר מבנים biocontained נפתחו, מניב קומפוסט בוגר הסופי מתאים ליישום בארץ. לסיכום, קומפוסט יוצרת תנאים נוכח אתגר מהותי לקיומה של מיקרואורגניזמים פתוגניים ביותר. חיידקים חינם, פרוטוזואה ונגיפים, מובטל במהירות על ידי בסיסיות גבוהה טמפרטורה, פרוטאז גבוהה ופעילויות nuclease בתוך קומפוסט. זה הפירוק המוצלח של פגרי בקר אבוס בוגרת עולה כי הליך זה סטטי לרשות קומפוסט יהיה מתאים כל בעלי החיים הנפוצים. יש להקפיד, עם זאת, על מנת להבטיח כי פחמן אופטימלית: יחסי חנקן ורמות לחות נוכחים על מנת להרוג חיידקים בתנאי שיושג. פתוגנים מטבעם יותר ועמיד בפני חום, כגון חיידקים נבגים צורה (למשל, אנתרקס), או אלה סרבן במיוחד, כגון פריונים, עדיין עשויים להישאר זיהומיות לאחר קומפוסט. מחקרים על מנת להבהיר את גורלם של אלו סוגים של מיקרואורגניזמים במהלך תהליך קומפוסט כרגע בעיצומו במעבדה שלנו. <img src="/files/ftp_upload/1946/1946fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ייצוג בתרשים של מערכת קומפוסט biosecure הכולל צרור קש הקירות והרצפה, המתחם יריעות פלסטיק, קש בסיס רופף, פגרי בקר, זבל, צינורות אוורור מחורר פלסטיק, פתחי האוורור, כמו גם תיקונים ניסיוני (leachate הנמל, אחזור מדגם הפירמידות חיישני טמפרטורה. (א) להציג רוחבי (חתך). (ב) להציג אורך (קיר בצד הסיר). כל המימדים נמצאים ס&quot;מ. מ שו et al. (2009) 2

biocontained carcass composting for control of infectious disease outbreak in livestock

נמרץ מערכות ייצור בעלי חיים פגיעים במיוחד (bioterrorist) התפרצויות טבעי או מכוון למחלות זיהומיות. מספר רב של בעלי חיים שוכן בתוך שטח מוגבל מאפשר הפצה מהירה של גורמים מדבקים ביותר בכל עדר. בלימה מהירה היא המפתח לשליטה כל התפרצות מחלה מידבקת, ובכך צמצום אוכלוסיה נעשית לעתים קרובות כדי למנוע את התפשטות הפתוגן לאוכלוסיית בעלי חיים גדולים יותר. בנסיבות, כי מספר גדול של פגרי בעלי חיים נגועים וזבל נוצרות הדורשים סילוק מהיר. קומפוסט משאיל את עצמו כשיטה מהירה תגובה עבור סילוק פגרים נגועים, כמו גם דשן ואדמה שעשויים הנמל חומרים מזהמים. עיצבנו ביו הכילו קומפוסט הליך התמותה נבדק יעילותו לפירוק רקמות שור ואת שחרור משרות מיקרוביאלי. השתמשנו בחומרים הזמינים על החווה או לרכישה בחנויות אספקה ​​מקומי בחווה כדי שמערכת יכול להיות מיושם באתר של התפרצות המחלה. במחקר זה, הטמפרטורות עלו 55 ° C במשך חודש אחד או יותר של סוכנים מושתלים זיהומיות בקר פגרי בקר וזבל היו מומת בתוך 14 ימים מיום קומפוסט. אחרי 147 ימים, פגרים היו כמעט מושפל לחלוטין. העצמות הארוכות שנותרו היו מושפל נוסף עם מחזור קומפוסט נוספים ומצבורי פתוח הקומפוסט בוגרת הסופי היה מתאים ליישום בארץ. שכפל מבנים קומפוסט (מידות 25 סופי 5 mx mx 2.4 מ &#39;אורך x רוחב X גובה) נבנו באמצעות חבילות קש שעורה מצופה כבד תחמיץ יריעות פלסטיק שחור. כל אחד מהם היה טעון עם קש, פגרי רופף זבל בהיקף של ~ 95,000 ק&quot;ג. שכבת 40 ס&quot;מ בסיס של קש שעורה רופף הוצב בבונקר כל, שעליו הונחו 16 בקר אבוס mortalities (משקל ממוצע 343 ק&quot;ג) בציר רוחבי על המרווח של כ 0.5 מ &#39; עבור אוורור פסיבי, באורכים של צינורות גמישים, מחורר מפלסטיק הניקוז (קוטר 15 ס&quot;מ) שהונחו בין פגרי הסמוך, המשתרעים בניצב לאורך שני קירות בפנים, עם סיום עבר למרות הפלסטיק החיצוני. פגרי היו מצופים בזבל לח אבוס סודה (~ 1.6 מ &#39;עומק) לחלק העליון של הבונקר. פלסטיק היה מקופל על העליונה וחתם עם הקלטת להקים מכשול הבלימה ושמונה פתחי אוורור (50 x 50 x 15 ס&quot;מ) שהונחו על החלק העליון של כל מבנה לקדם אוורור פסיבי. אחרי 147 ימים, על הפסדים של נפח מסה של חומרים קומפוסטציה בממוצע 39.8% ו 23.7%, בהתאמה, במבנה אחד.

Watch this Scientific Journal Video about Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock at JoVE.com

Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

שימוש בחומרים זמינים, זו מערכת קומפוסט biocontained מאפשר יעיל באתר סילוק פגרי בעלי חיים גדולים הנובעים במקרה של התפרצות מחלות זיהומיות. הליך זה הורג גורמים מדבקים ביותר פגרים וזבל מזוהמים. פעם סוכן זיהומיות הוא אישר שאינו בר קיימא, קומפוסט בוגר ניתן להפיץ כדשן.

פגר קומפוסט Biocontained לבקרת להתפרצות מחלות מדבקות של בעלי חיים

Intensive livestock production systems are particularly vulnerable to natural or intentional (bioterrorist) infectious disease outbreaks. Large numbers of ...

biocontained-carcass-composting-for-control-infectious-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.7K Views.  Lethbridge Research Centre. שימוש בחומרים זמינים, זו מערכת קומפוסט biocontained מאפשר יעיל באתר סילוק פגרי בעלי חיים גדולים הנובעים במקרה של התפרצות מחלות זיהומיות. הליך זה הורג גורמים מדבקים ביותר פגרים וזבל מזוהמים. פעם סוכן זיהומיות הוא אישר שאינו בר קיימא, קומפוסט בוגר ניתן להפיץ כדשן.

Video: Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן ליסוירוס מרקמות קבועות פורמלין

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

כימות נוגדנים מנטרלים הנגרמים על ידי חיסון בגרסאות SARS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

זרקור המחבר: מערכת וירוס פסאודוטיפ להערכת תת-וריאנטים של אומיקרון ונטרול נוגדנים במחקר SARS-CoV-2

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

יישום של Ha-CoV-2 Pseudovirus לכימות מהיר של גרסאות SARS-CoV-2 ונוגדנים מנטרלים

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...