Ce projet a été réalisé grâce au financement du chimique, biologique, radiologique et nucléaire (CBRN) Initiative de recherche et de technologie (IRTC) de l&#39;Agence canadienne d&#39;inspection des aliments, et l&#39;Alberta Prion Research Institute. La Fondation nationale des sciences naturelles de Chine a fourni une bourse d&#39;études (n ° 30620120430) à W. Xu. Les auteurs remercient Brant Baker et Fred Van Herk, ainsi que Ruth Barbieri, Lisa Kalischuk-Tymensen, Andrew Olson, Lorna Selinger, Geoff Wallins et Homayoun Zahiroddini pour leur assistance technique.

Structures de compost ont été construits en double au Centre de recherches de Lethbridge (CRL) à Lethbridge, en Alberta, au Canada (figure 1). Grandes balles rectangulaires de paille d&#39;orge (260 x 120 x 80 cm, L x P x H) ont été utilisés pour les murs, et de petites balles (100 x 40 x 45 cm) pour le plancher. Grosses balles ont été orientées de sorte murs étaient 120 cm d&#39;épaisseur, qui stabilité des parois optimisée et isolation thermique. Les petites balles formant le plancher ont été orientées avec de la ficelle horizontalement pour maximiser l&#39;absorbance dans l&#39;éventualité d&#39;une fuite, ce qui donne un plancher de 45 cm d&#39;épaisseur. Dimensions hors des structures ont été de 25 mx 5 mx 2,4 m; L x P x H). Le chantier avait une pente d&#39;environ 1, et les structures ont été orientés à favoriser l&#39;écoulement des lixiviats vers le port d&#39;échantillonnage qui nous avons inséré pour l&#39;évaluation expérimentale. Fumier de parc d&#39;engraissement humide a été mélangé et aéré par le traitement par un épandeur de fumier et d&#39;empilage de 24 h avant la construction des structures de confinement. Les bunkers de compost ont été alignés avec les bâches en plastique noir / blanc couramment utilisés pour couvrir les tas d&#39;ensilage. Excédent suffisant a été laissé sur le haut dans chaque direction afin de permettre une éventuelle rabattable et l&#39;étanchéité de la lit de compost au sein du bunker. Pour lutter contre une brise ambiante, les pneus ont été utilisés pour le poids du plastique dans le bunker jusqu&#39;à la paille a été chargé, mais ils ont été retirés avant les carcasses étant placé. Une fois le port d&#39;échantillonnage des lixiviats (nécessaire pour l&#39;échantillonnage expérimental seulement) a été installé, la paille d&#39;orge en vrac a été ajouté dans la structure de bio-confinement pour former une couche de base d&#39;environ 40 cm d&#39;épaisseur. Cela a été accompli en fournissant une seule balle ronde avec un chargeur frontal, et manuellement distribuer la paille le long de la longueur de la soute. Seize bovins d&#39;engraissement des mortalités ont été placés sur le lit de paille. Ce sont les bovins qui sont morts dans les 48 dernières heures à proximité des parcs d&#39;engraissement commerciaux, la majorité ayant succombé à la maladie respiratoire bovine. Les carcasses ont été alignés transversalement à l&#39;intérieur du bunker de compostage (Fig. 1), avec un espace d&#39;environ 0,5 m entre les carcasses. Pour fournir une aération passive, des longueurs de tuyaux de plastique perforé de drainage souple (15 cm de diamètre) ont été établies entre les carcasses adjacentes, intégrés dans la base de paille en vrac. Les extrémités des tubes ont été dirigés verticalement le long des murs latéraux s&#39;étendant au-delà du haut de la soute, et maintenu en place temporairement l&#39;utilisation de pneus s&#39;étendant au-delà de la surface supérieure des murs. Fumier de parc d&#39;engraissement pré-conditionnée a été chargé dans les bunkers pour couvrir les carcasses à une profondeur finale de 1,6 m. Le fumier a été chargé au cours de la paroi latérale de la soute, passant d&#39;une extrémité de la structure vers l&#39;autre. Les pyramides de récupération de l&#39;échantillon décrit ci-dessous ont été placés à leur profondeur prescrite dans la couche de fumier pendant cette étape. Une fois le bunker était rempli, les bâches en plastique a été plié au-dessus du fumier entassés et les extrémités des tubes perforés ont été transmis à travers elle de sorte qu&#39;ils étaient situés à l&#39;extérieur de la pellicule. Le plastique a été scellé avec du ruban adhésif pour établir une barrière de confinement autour de la paille, des carcasses et du fumier. Huit bouches d&#39;aération (50 x 50 x 15 cm) ont été placés sur le dessus de chaque structure pour favoriser l&#39;aération passive, et en forme de T connecteurs étaient attachés à chaque extrémité de la longueur des tubes perforés pour favoriser le flux d&#39;air vers le bas dans les tubes. Dans cette étude pilote, des modifications expérimentales pour les structures de compost ont été incorporés pour permettre enquête sur l&#39;inactivation des pathogènes et la dégradation des tissus pendant le processus de compostage statique. Des échantillons de tissus et microbiennes pré-quantifiée par le poids de tissus ou d&#39;énumération microbienne ont été thermoscellés dans des sacs en nylon de l&#39;échantillon (5 x 9 cm, la taille des pores de 50 um), et emballés dans des cages en acier spécialisés pyramidale, désigné comme Pyramides Retrieval Baker (BRP) 1. Ces pyramides ont été conçues pour permettre leur récupération à partir de la matrice du compost à intervalles réguliers pendant le processus de compostage sans compromettre gravement le confinement ou l&#39;altération de la dynamique du processus de compostage intérieur d&#39;un BRP, huit sacs (un de chacun des huit types d&#39;échantillon) ont été intégrées dans le fumier mêmes qui a été utilisé pour remplir le bunker, disposés de sorte que chaque sac est entouré par le fumier et pas de sacs ont été en contact direct avec l&#39;autre. BRP-fumier et un sac rempli étaient attachés à des longueurs de chaîne de l&#39;exploitation forestière et suspendus à des profondeurs de 80 cm et 160 cm dans la matrice du compost. Les chaînes étaient ancrés à des poteaux en bois enjambant les bunkers à 1,5 m d&#39;intervalle (Fig. 1). T-type thermocouples placés dans chaque BRP ont également courir le long des chaînes jusqu&#39;à un enregistreur de données placée à l&#39;extérieur de la structure du compost. A intervalles spécifiés, BRP ont été retirées à la verticale à partir du compost en utilisant un cliquet arrivé le long du câble extracteur, et la pellicule de plastique a été re-scellé. Dans le climat naturellement aride du sud de l&#39;Alberta, peu de précipitations a été reçu pendant tsa période, mais la pellicule de plastique et de la forme bombée du matériel de compostage ont été efficaces pour la promotion de ruissellement latéral à être absorbées par les murs de soute paille.

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	<li>Reuter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+temporal+collection+of+tissue+and+microbial+samples+from+static+composting+systems.">A simple method for temporal collection of tissue and microbial samples from static composting systems.</a> Canadian Biosystems Engineering. 50, 6.17-6.20 (2008).</li><li>Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biosecure+composting+system+for+disposal+of+cattle+carcasses+and+manure+following+infectious+disease+outbreak.">A biosecure composting system for disposal of cattle carcasses and manure following infectious disease outbreak.</a> J. Environ. Qual. 38, 437-450 (2009).</li></ol>

Après 147 jours de compostage statique, les pertes de la masse totale, matière sèche (MS), matière organique, le carbone total et azote total étaient de 23,7, 35,6, 52,9, 49,6 et 41,4%, respectivement 2. Dans chaque structure, le volume de matières compostées diminué de 118 à 71 m 3. Décomposition des tissus bovins surveillés classé comme le cerveau&gt; sabots osseux&gt;. Après seulement 7 jours de compostage,&gt; 90% de tissu cérébral DM avait décomposé, et 80% des sabots DM avait décomposée dans les 56 jours du compostage. Perte complète de la viabilité d&#39;Escherichia coli O157: H7 et la maladie de Newcastle a été réalisée dans les 14 jours. Systèmes d&#39;élevage intensifs sont particulièrement vulnérables aux catastrophes naturelles ou intentionnelles épidémies de maladies infectieuses. Logement d&#39;un grand nombre d&#39;animaux dans un espace confiné donne naissance à la plupart des agents infectieux diffuser rapidement dans toute la population. Le confinement est essentielle pour contrôler toute éclosion de maladie infectieuse, ce dépeuplement est fréquemment utilisée comme un moyen de prévenir la propagation de l&#39;agent infectieux de la plus grande population du bétail. Les résultats du scénario dépeuplement dans un grand nombre de carcasses de bétail et de fumier contaminé nécessitant une élimination rapide. Le compostage se prête comme une méthode d&#39;élimination de réponse rapide pour les carcasses infectées ainsi que du fumier et du sol qui peuvent contenir des agents infectieux. Nous décrivons une procédure de compostage qui peuvent être menées sur le site de l&#39;éclosion de la maladie, en utilisant des matériaux facilement disponibles à la ferme ou de locaux agricoles d&#39;approvisionnement des magasins. Dans notre étude, les agents infectieux associés aux carcasses de bovins et de fumier ont été inactivés dans les 14 jours de compostage, une température du compost dépassé 55 ° C pendant plus d&#39;un mois. La production de lixiviat a été extrêmement faible, probablement en raison de la nature absorbante de la couche de base et notre paille en vrac avoir optimisé le contenu de DM au début du compostage. Les rendements totaux de lixiviat ont été de moins de 3 ppm de la masse de compost initiale (ie, &lt;300 g par structure). Les coliformes ont été détectés dans le lixiviat jusqu&#39;à 5,8 log10 CFU / mL à 14 jours, mais ne sont pas détectables après 101 jours de compostage. Après 147 jours, carcasses de bovins ont été presque complètement dégradé avec seulement quelques os longs étant reconnaissable. Bones ont été dégradées durant le cycle de compostage en andains ouvert supplémentaires après les structures bioconfinement ont été ouverts, ce qui donne finale compost mûr approprié pour une application terrestre. En conclusion, le compostage crée des conditions qui présentent défi important pour la survie des microorganismes pathogènes plupart. Bactéries libres, protozoaires et virus sont rapidement inactivés par la température, l&#39;alcalinité élevée et élevée de protéase et des activités au sein de la nucléase de compost. Cette décomposition réussie des bovins d&#39;engraissement des carcasses matures indique que cette procédure de compostage statique disposition serait approprié pour tout le bétail commun. Des précautions doivent être prises, cependant, de s&#39;assurer que le carbone optimale: les ratios d&#39;azote et les niveaux d&#39;humidité sont présents pour tuer les microbes conditions à réaliser. Pathogènes intrinsèquement plus résistants à la chaleur, tels que les bactéries qui forment des spores (par exemple, l&#39;anthrax), ou ceux qui sont exceptionnellement récalcitrants, tels que les prions, peut rester infectieux après compostage. Etudes visant à élucider le sort de ces types de microorganismes durant le processus de compostage sont actuellement en cours dans notre laboratoire. <img src="/files/ftp_upload/1946/1946fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentation schématique du système de compostage biosécuritaires comprenant murs en ballots de paille et le plancher, enceinte bâches en plastique, base de paille en vrac, les carcasses de bovins, fumier, tubes perforés de ventilation en plastique, et bouches d&#39;aération, ainsi que des modifications expérimentales (lixiviat du port, la récupération de l&#39;échantillon les pyramides et les capteurs de température. (A) Vue transversale (section transversale). (B) Vue longitudinale (paroi latérale enlevée). Toutes les dimensions sont en cm. Du Xu et al. (2009) 2

biocontained carcass composting for control of infectious disease outbreak in livestock

Systèmes d&#39;élevage intensifs sont particulièrement vulnérables aux catastrophes naturelles ou intentionnelles (bioterroriste) flambées de maladies infectieuses. Un grand nombre d&#39;animaux logés dans une zone restreinte permet une diffusion rapide de la plupart des agents infectieux à travers un troupeau. Confinement rapide est essentielle pour contrôler toute éclosion de maladie infectieuse, ce dépeuplement est souvent entrepris pour prévenir la propagation d&#39;un agent pathogène à la population plus large de l&#39;élevage. Dans cette circonstance, un grand nombre de carcasses de bétail et de fumier contaminé sont générés qui doivent être éliminés rapidement. Le compostage se prête comme une méthode d&#39;élimination de réponse rapide pour les carcasses infectées ainsi que du fumier et du sol qui peuvent contenir des agents infectieux. Nous avons conçu une procédure de bio-compostage et de mortalité contenues testé son efficacité pour la dégradation des tissus de bovins et la désactivation microbienne. Nous avons utilisé des matériaux disponibles sur la ferme ou achetables à partir locales magasins de fournitures agricoles, afin que le système peut être mis en œuvre sur le site d&#39;une flambée de maladie. Dans cette étude, les températures ont dépassé 55 ° C pendant plus d&#39;un mois et les agents infectieux implantés dans les carcasses de bovins de boucherie et du fumier ont été inactivés dans les 14 jours de compostage. Après 147 jours, les carcasses ont été presque complètement dégradé. Les os longs quelques autres étaient encore dégradé avec un cycle de compostage en andains supplémentaires ouverts et le compost final mature a été adaptée pour l&#39;épandage. Dupliquer des structures de compost (dimensions finales de 25 mx 5 mx 2,4 m; L x P x H) ont été construits en utilisant des balles de paille d&#39;orge et bordée de lourdes bâches d&#39;ensilage en plastique noir. Chacun a été chargé avec de la paille en vrac, les carcasses et du fumier totalisant ~ 95,000 kg. Une couche de base de 40 cm de paille d&#39;orge en vrac a été placé dans chaque bunker, sur lequel ont été placés 16 bovins d&#39;engraissement des mortalités (poids moyen 343 kg) aligné transversalement avec un espacement d&#39;environ 0,5 m. Pour l&#39;aération passive, des longueurs de flexibles, tuyaux de plastique perforé de drainage (15 cm de diamètre) ont été placés entre les carcasses adjacentes, s&#39;étendant verticalement le long des deux murs à l&#39;intérieur, et avec les extrémités passé si le plastique à l&#39;extérieur. Les carcasses ont été superposées avec le fumier des parcs d&#39;engraissement humides aérés (~ 1,6 m de profondeur) au sommet du bunker. Plastique a été replié sur le dessus et scellées avec du ruban adhésif pour établir une barrière de confinement et de huit bouches d&#39;aération (50 x 50 x 15 cm) ont été placés sur le dessus de chaque structure pour favoriser l&#39;aération passive. Après 147 jours, des pertes de volume et la masse des matières compostées en moyenne 39,8% et 23,7%, respectivement, dans chaque structure.

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Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

En utilisant des matériaux facilement disponibles, ce système de compostage permet bioconfinement efficaces sur site d&#39;élimination des carcasses de gros animaux se posent dans le cas d&#39;éclosion de maladie infectieuse. Cette procédure tue la plupart des agents infectieux dans les carcasses et du fumier contaminé. Une fois l&#39;agent infectieux est confirmée non viables, le compost mûr peut se répandre comme engrais.

Le compostage des carcasses de bioconfinement pour le contrôle de l&#39;épidémie de maladies infectieuses dans le bétail

Intensive livestock production systems are particularly vulnerable to natural or intentional (bioterrorist) infectious disease outbreaks. Large numbers of ...

biocontained-carcass-composting-for-control-infectious-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.7K vues.  Lethbridge Research Centre. En utilisant des matériaux facilement disponibles, ce système de compostage permet bioconfinement efficaces sur site d'élimination des carcasses de gros animaux se posent dans le cas d'éclosion de maladie infectieuse. Cette procédure tue la plupart des agents infectieux dans les carcasses et du fumier contaminé. Une fois l'agent infectieux est confirmée non viables, le compost mûr peut se répandre comme engrais.

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Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

La salive, les glandes salivaires, et Collection hémolymphe de tiques Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Recherche

Immunologie et infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Méthode d&#39;échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Évaluation des réponses de cellules T spécifiques du Virus Zika dans les organes Immunoprivileged des Ifnar1 infecté les souris- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identification des souris et des répertoires d’anticorps humain par séquençage de prochaine génération

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Quantification des anticorps neutralisants induits par le vaccin dans les variants du SRAS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

Pleins feux sur l’auteur : Un système de pseudotype de virus pour évaluer les sous-variants d’Omicron et les anticorps neutralisants dans la recherche sur le SRAS-CoV-2

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Application du pseudovirus Ha-CoV-2 pour la quantification rapide des variants du SRAS-CoV-2 et des anticorps neutralisants

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...