Este projecto foi realizado com financiamento da química, biológica, radiológica e (CBRN) Nuclear Research Initiative e Tecnologia (CRTI) da Agência Canadense de Inspeção de Alimentos, eo Prion Alberta Research Institute. A Fundação Nacional de Ciência Natural da China forneceu uma bolsa de estudos (n º 30620120430) para W. Xu. Os autores agradecem Brant Baker e Fred Van Herk, assim como Ruth Barbieri, Lisa Kalischuk-Tymensen, Andrew Olson, Lorna Selinger, Geoff Wallins e Homayoun Zahiroddini por sua assistência técnica.

Estruturas duplicadas compostagem foram construídas no Centro de Pesquisa Lethbridge (LRC) em Lethbridge, Alberta, Canadá (Fig. 1). Grandes fardos de palha de cevada retangular (260 x 120 x 80 cm; L x W x H) foram utilizados para as paredes, e fardos pequenos (100 x 40 x 45 cm) para o chão. Fardos grandes foram orientados para paredes eram 120 centímetros de espessura, que a estabilidade da parede maximizada e retenção de calor. Os fardos pequenos formando o piso foram orientados com barbante correndo horizontalmente para maximizar a absorção em caso de um vazamento, resultando em um piso de 45 centímetros de espessura. Dimensões gerais das estruturas foram 25 mx 5 mx 2,4 m; L x W x H). O canteiro de obras tinha uma inclinação de cerca de 1, e as estruturas foram orientados para estimular o fluxo de lixiviados para o porto de amostragem que inserimos para a avaliação experimental. Esterco úmido confinamento foi misturado e aerado por processamento através de um espalhador de adubo e empilhando por 24 h antes da construção das estruturas de contenção. Os bunkers composto foram revestidas com folhas de plástico pesado preto / branco comumente utilizado para cobrir as pilhas de silagem. Excedente suficiente foi deixado por cima em cada sentido de permitir eventual fold-down e vedação da cama composto dentro do bunker. Para combater uma brisa ambiente, os pneus foram usados ​​para o peso do plástico no bunker até que a palha foi carregado, mas estes foram removidos antes de as carcaças serem colocados. Uma vez que a porta de amostragem de chorume (necessário para amostragem experimental apenas) foi instalado, palha de cevada foi adicionado solta na estrutura bio-contenção para formar uma camada de base de aproximadamente 40 cm de espessura. Isto foi conseguido através da apresentação de um fardo de ida e volta com um carregador da extremidade dianteira, e manualmente distribuir a palha ao longo do comprimento do bunker. Gado dezesseis mortalidade confinamento foram colocados sobre a cama de palha. Estes foram gado que havia morrido nas últimas 48 horas na próxima confinamentos comerciais, a maioria ter sucumbido à doença respiratória bovina. As carcaças foram alinhados transversalmente dentro do bunker de compostagem (Fig. 1), com um espaço de aproximadamente 0,5 m entre as carcaças. Para fornecer aeração passiva, comprimentos de tubulação de drenagem flexível plástico perfurado (15 cm de diâmetro) foram colocados entre as carcaças adjacentes, embutido dentro da base de palha solta. As extremidades do tubo foram dirigidas verticalmente ao longo das paredes laterais estendendo para além do topo do bunker, e mantido no lugar temporariamente com pneus estender além da superfície superior das paredes. Pré-condicionado esterco confinamento foi carregado no bunkers para cobrir as carcaças a uma profundidade final de 1,6 m. O adubo foi carregado por cima do muro lateral do bunker, que se deslocam de uma extremidade da estrutura em relação ao outro. As pirâmides de recuperação da amostra descrito a seguir foram posicionados em suas profundezas prescritos dentro da camada de esterco durante este estágio. Uma vez que o bunker estava cheio, o plástico foi dobrado por cima do estrume empilhado e as extremidades do tubo perfurado foram passadas por ele para que eles se situam exterior para o wrap. O plástico foi vedado com fita adesiva para estabelecer uma barreira de contenção ao redor da palha, carcaças e esterco. Oito aberturas de aeração (50 x 50 x 15 cm) foram colocados no topo de cada estrutura para promover a aeração passiva, e em forma de T conectores foram anexados a cada final dos comprimentos de tubos perfurados para promover o fluxo de ar para dentro dos tubos. Neste estudo piloto, experimental alterações às estruturas de compostagem foram incorporadas para habilitar investigação de inativação de patógenos e degradação dos tecidos durante o processo de compostagem estática. Tecidos e amostras microbianas pré-quantificados através do peso do tecido ou enumeração microbiana foram calor seladas em sacos de nylon amostra (5 x 9 cm; 50 mícrons tamanho dos poros), e acondicionados em gaiolas de aço especializada piramidal, designado como Pirâmides Baker Retrieval (BRP) 1. Estas pirâmides foram projetadas para permitir a sua recuperação a partir da matriz de compostagem em intervalos durante o processo de compostagem sem comprometer seriamente contenção ou alterando a dinâmica do processo de compostagem Dentro de um BRP, oito sacos (cada um dos oito tipos de amostra) foram incorporados no estrume mesmo que foi usado para encher o bunker, dispostas de modo que cada saco foi cercado por estrume e não malas estavam em contato direto um com o outro. BRPS estrume e saco-cheio foram anexados aos comprimentos de cadeia de registro e suspensas em profundidades de 80 cm e 160 cm dentro da matriz composto. As cadeias estavam ancorados em postes de madeira que medem o bunkers em 1,5 m intervalos (Fig. 1). T-tipo termopares colocados em cada BRP também foram executados ao longo das cadeias a um data logger posicionados externamente à estrutura do composto. Em intervalos específicos, BRPS foram retiradas verticalmente a partir do composto usando um ratcheted vêm ao longo do cabo puxador, eo plástico foi re-selado. No clima naturalmente áridas do sul de Alberta, pouca chuva foi recebido durante tseu período, mas o filme plástico e formato abobadado do material de compostagem foram eficazes para promover o escoamento lateral para ser absorvido pelas paredes do bunker de palha.

<ol>
	<li>Reuter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+temporal+collection+of+tissue+and+microbial+samples+from+static+composting+systems.">A simple method for temporal collection of tissue and microbial samples from static composting systems.</a> Canadian Biosystems Engineering. 50, 6.17-6.20 (2008).</li><li>Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biosecure+composting+system+for+disposal+of+cattle+carcasses+and+manure+following+infectious+disease+outbreak.">A biosecure composting system for disposal of cattle carcasses and manure following infectious disease outbreak.</a> J. Environ. Qual. 38, 437-450 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Após 147 dias de compostagem estática, as perdas de massa total, matéria seca (MS), matéria orgânica, carbono total e nitrogênio total foram 23,7, 35,6, 52,9, 49,6 e 41,4%, respectivamente 2. Dentro de cada estrutura, o volume de materiais de compostagem diminuiu 118-71 m 3. Decomposição dos tecidos bovinos monitorados classificado como o cérebro do osso&gt;&gt; casco. Depois de apenas 7 dias de compostagem,&gt; 90% de tecido cerebral DM tinha decomposto, e 80% de casco DM tinha decomposto dentro de 56 d de compostagem. Perda completa da viabilidade de Escherichia coli O157: H7 e Doença de Newcastle foi alcançado dentro de 14 dias. Sistemas de produção intensiva de gado são particularmente vulneráveis ​​ao natural ou intencional surtos de doenças infecciosas. Abrigando um grande número de animais dentro de uma área confinada dá origem à maioria dos agentes infecciosos disseminar rapidamente por toda a população. Contenção é a chave para controlar qualquer surto de doença infecciosa, assim o despovoamento é usado com freqüência como meio de prevenir a disseminação do agente infeccioso para a população maior de gado. O despovoamento cenário resulta em um grande número de carcaças de gado e esterco contaminado exigindo a eliminação rápida. Compostagem presta-se como um método de eliminação de resposta rápida para carcaças infectadas, bem como esterco e de solo que podem abrigar agentes infecciosos. Esboçamos um processo de compostagem que podem ser realizadas no local do surto da doença, utilizando materiais facilmente disponíveis on-fazenda ou fazenda desde o local de abastecimento de lojas. Em nosso estudo, os agentes infecciosos associados às carcaças de bovinos de corte e esterco foram inativadas no prazo de 14 dias de compostagem, um composto temperaturas excederam 55 º C por mais de um mês. Produção de lixiviados foi extremamente baixa, provavelmente devido à natureza do absorvente da camada de palha solta a nossa base e ter otimizado o teor de MS no início da compostagem. Rendimento total de lixiviados foram inferiores a 3 ppm de massa composto inicial (ie, &lt;300 g por estrutura). Coliformes foram detectados nos lixiviados em até 5,8 log10 UFC / mL em 14 dias, mas não eram detectáveis ​​após 101 dias de compostagem. Após 147 dias, carcaças de bovinos foram quase que completamente degradados, com apenas alguns ossos longos sendo reconhecíveis. Ossos foram degradadas ainda durante o ciclo de compostagem adicionais open-leira após a estruturas biocontained foram abertas, produzindo composto maduro final destinado a aplicação às terras. Em conclusão, a compostagem cria as condições que apresentam grande desafio para a sobrevivência de microrganismos mais patogênicos. Livre de bactérias, protozoários e vírus são rapidamente inactivado pela alta temperatura, alcalinidade e protease e as actividades de nuclease dentro de compostagem. Esta decomposição bem-sucedida de carcaças de gado de confinamento madura indica que este processo de eliminação de compostagem estática seria adequado para todo o gado comum. É preciso ter cuidado, no entanto, para garantir que o carbono ideal: relações de nitrogênio e níveis de umidade estão presentes, a fim de matá-microbial condições a serem alcançados. Patógenos inerentemente mais resistente ao calor, tais como bactérias que formam esporos (por exemplo, o antraz), ou aqueles que são extraordinariamente recalcitrantes, tais como prions, ainda pode permanecer infectantes após compostagem. Estudos para elucidar o destino desses tipos de microrganismos durante o processo de compostagem estão em andamento em nosso laboratório. <img src="/files/ftp_upload/1946/1946fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representação esquemática do sistema de biossegurança composto compreendendo paredes de palha e piso de fardos, gabinete plástico, base de palha solta, carcaças de bovinos, esterco, tubos de ventilação perfurado, plástico e saídas de ar, bem como alterações experimental (lixiviados porto, recuperação de amostra pirâmides e sensores de temperatura. (A) vista transversal (seção transversal). (B) vista longitudinal (parede lateral removido). Todas as dimensões estão em cm. De Xu et al (2009). 2

biocontained carcass composting for control of infectious disease outbreak in livestock

Sistemas de produção intensiva de gado são particularmente vulneráveis ​​ao natural ou intencional (bioterrorista) surtos de doenças infecciosas. Um grande número de animais alojados dentro de uma área confinada permite rápida disseminação da maioria dos agentes infecciosos ao longo de um rebanho. Contenção rápida é a chave para controlar qualquer surto de doença infecciosa, assim, o despovoamento é freqüentemente realizado para evitar a disseminação de um patógeno para a população maior de gado. Nessa circunstância, um grande número de carcaças de gado e esterco contaminado são geradas que exigem a eliminação rápida. Compostagem presta-se como um método de eliminação de resposta rápida para carcaças infectadas, bem como esterco e de solo que podem abrigar agentes infecciosos. Nós projetamos um bio-contained processo de compostagem de mortalidade e testou sua eficácia para a degradação do tecido bovino e desativação microbiana. Usamos materiais disponíveis na fazenda ou adquiridas de lojas de suprimentos locais fazenda a fim de que o sistema pode ser implementado no local de um surto da doença. Neste estudo, as temperaturas excederam 55 º C por mais de um mês e agentes infecciosos implantado em carcaças de bovinos de corte e esterco foram inativadas no prazo de 14 dias de compostagem. Após 147 dias, as carcaças foram quase completamente degradada. Os ossos longos poucos restantes foram ainda mais degradada, com um ciclo de compostagem em leiras adicionais abertos eo composto final madura era adequado para aplicação no solo. Duplicar estruturas de compostagem (dimensões finais 25 mx 5 mx 2,4 m; L x W x H) foram construídos utilizando fardos de palha de cevada e forrado com plástico preto silagem pesado. Cada um estava carregado com palha solta, carcaças e esterco totalizando ~ 95,000 kg. A camada de base de 40 cm de palha de cevada soltos foi colocado em cada um bunker, no qual foram colocados 16 bovinos em confinamento mortalidade (peso médio 343 kg) alinhados transversalmente em um espaçamento de aproximadamente 0,5 m. Para aeração passiva, comprimentos de tubulação flexível de drenagem, perfuradas de plástico (15 cm de diâmetro) foram colocados entre as carcaças adjacentes, estendendo-se verticalmente ao longo de ambas as paredes internas, e com as pontas do plástico que passou para o exterior. As carcaças foram sobrepostos com esterco úmido confinamento aerado (~ 1,6 m de profundidade) até o topo do bunker. Plástico era dobrado por cima e seladas com fita adesiva para estabelecer uma barreira de contenção e oito aberturas de aeração (50 x 50 x 15 cm) foram colocados no topo de cada estrutura para promover a aeração passiva. Após 147 dias, as perdas de volume e massa de materiais de compostagem em média 39,8% e 23,7%, respectivamente, em cada estrutura.

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Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

Utilizando materiais facilmente disponíveis, este sistema de compostagem biocontained permite efetiva no local de descarte de carcaças de animais de grande porte decorrentes em caso de surto de doença infecciosa. Este procedimento mata a maioria dos agentes infecciosos em carcaças e esterco contaminado. Uma vez que agente infeccioso é confirmado não viáveis ​​composto, maturidade pode ser espalhado como adubo.

Compostagem Carcass Biocontained de Controle de Epidemias de Doenças Infecciosas na Pecuária

Intensive livestock production systems are particularly vulnerable to natural or intentional (bioterrorist) infectious disease outbreaks. Large numbers of ...

biocontained-carcass-composting-for-control-infectious-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K visualizações.  Lethbridge Research Centre. Utilizando materiais facilmente disponíveis, este sistema de compostagem biocontained permite efetiva no local de descarte de carcaças de animais de grande porte decorrentes em caso de surto de doença infecciosa. Este procedimento mata a maioria dos agentes infecciosos em carcaças e esterco contaminado. Uma vez que agente infeccioso é confirmado não viáveis ​​composto, maturidade pode ser espalhado como adubo.

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Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

A saliva, glândula salivar, e Coleta de hemolinfa de carrapatos Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Imunologia e Infecção

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identificação de Mouse e repertórios de anticorpo humano por sequenciamento de próxima geração

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Quantificando anticorpos neutralizantes induzidos por vacina em variantes do SARS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

Autor em destaque: Um sistema de vírus de pseudotipo para avaliar subvariantes Omicron e anticorpos neutralizantes na pesquisa de SARS-CoV-2

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Aplicação do pseudovírus Ha-CoV-2 para quantificação rápida de variantes do SARS-CoV-2 e anticorpos neutralizantes

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...