이 프로젝트는 화학, 생물학, 방사능 및 핵 (CBRN) 연구 및 기술 이니셔티브 (CRTI) 캐나다 식품 검사 기관의, 그리고 알버타 프리온 연구소의 자금 지원과 함께 실시했다. 중국의 국립 자연 과학 재단은 W. 쑤하는 장학금 (번호 30620120430)를 제공했습니다. 저자는 기술 지원을 브란트 베이커와 프레드 반 허크뿐만 아니라, 루스 Barbieri, 누나 Kalischuk - Tymensen, 앤드류 올슨,로나 셀린저, 제프 월린스 및 Homayoun Zahiroddini 감사드립니다.

중복 퇴비 구조 레스 브리지, 앨버타, 캐나다 레스 브리지 연구 센터 (LRC) (그림 1)에 건설되었다. 대형 직사각형 보리 짚을 베일즈 (260 X 120 X 80cm, L X 폭 x H)가 벽 및 바닥에 대한 작은 베일즈 (100 X 40 X 45cm)에 사용되었습니다. 벽 두께가 120 cm, 최대 벽 안정성과 열 유지 너무나 큰 베일즈을 지향했다. 바닥을 형성 작은 ​​베일즈 트와인는 45cm 두께의 바닥을 항복, 누출의 경우 흡광도를 극대화하기 위해 가로 실행하는 방향으로했다. L X 폭 x H), 구조의 전체 크기는 25 MX 5 MX 2.4 m했다. 건설 현장은 약 1 경사면을했고, 구조 우리가 실험 평가 삽입된 샘플링 포트쪽으로 침출액의 흐름을 촉진하는 방향으로했다. 촉촉한 피드롯 배설물은 비료 살포기를 통해 처리를 사전 봉쇄 구조물의 건설 24 H를위한 말뚝에 의한 혼합 및 aerated되었습니다. 퇴비 벙커는 일반적으로 목초의 말뚝을 커버하는 데 사용되는 무거운 검정 / 흰색 플라스틱 판금 늘어서 있었다. 충분한 잉여가 사용하는 각 방향으로 맨 위에 남아 있던 최종 접이식 아래와 벙커 내에 퇴비 침대 씰링. 주위 바람에 대처하기 위해, 타이어는 빨대를 로드할 때까지 벙커에서 플라스틱을 무게하기 위해 사용되었습니다 있지만, 이러한 사전 배치되는 주검으로 제거되었습니다. 침출액 샘플링 포트 (단 실험 표본 추출에 필요한) 설치되면 느슨하게 보리 짚을는 약 40cm 두께의 기본 레이어를 형성하기 위해 바이오 봉쇄 구조로 추가되었습니다. 이 프런트 엔드 로더와 함께 하나의 원형 베일을 제공하고, 수동으로 벙커의 길이를 따라 빨대를 배포하여 수행되었다. 식스틴 피드롯 가축 mortalities는 짚으로 침대에 배치했다. 이들은 인근 상업 feedlots에서 이전 48 시간 이내에 죽었다고 가축했고 대부분은 소 호흡기 질병에 굴복하는 데. 주검이 주검 사이에 약 0.5 m의 공간, 퇴비 벙커 (그림 1) 이내 transversely 정렬되었습니다. 수동 폭기를 제공하기 위해 천공 유연한 플라스틱 배수 튜브 (15cm 직경)의 길이는 느슨한 밀짚 기지 내에 내장, 인접 시체 사이에 누워 있었다. 튜브의 끝을는 벙커의 맨 넘어 확장 측면 벽을 따라 수직으로 감독하고, 일시적으로 벽의 상단 표면 과거 확장 타이어를 사용하는 장소에서 개최되었습니다. 사전 냉방 피드롯 비료는 1.6 미터의 최종 깊이 시체를 커버하기 위해 벙커에로드​​했습니다 비료는 다른쪽으로 구조의 한쪽에서 이동, 벙커의 측면 벽을 통해로드되었습니다. 아래에 설명된 샘플 검색의 피라미드는이 단계에서 비료 층 이내에 소정의 깊이에 위치했다. 벙커가 가득 차 있었다되면, 플라스틱 판금이 쌓여 비료의 맨 위에 접힌이고 다공 튜브의 끝을들은이 포장 외관에 위치하고 있었다 그래서 그게 통과되었습니다. 플라스틱은 밀짚, 시체와 배설물 주변 봉쇄 장벽을 확립하기 위해 테이프로 봉인된 상태 였어요. 에이트 폭기 통풍구 (50 X 50 X 15cm)은 수동 폭기를 홍보하기 위해 각 구조의 상단에 배치되었고, T - 모양의 커넥터가 튜브에 공기 흐름을 촉진하기 다공 튜브의 길이의 각 끝에 붙어 있었다. 이 파일럿 연구에서 퇴비 구조로 실험 개정은 정적 퇴비 과정에서 병원체 불활 성화 및 조직 열화 조사를 활성화하기 위해 통합되었습니다. 조직 및 미생물 샘플 조직 중량이나 미생물 열거하여 미리 계량은 나일론 샘플 가방 (5 X 9cm, 50 μm의 구멍 크기)에 열 봉인되었고, 베이커 불러오기 피라미드 (BRP)로 지정, 전문 피라미드 스틸 케이지에 포장 1. 같은 비료에 포함된되었다 이러한 피라미드가 심각하게 BRP, 여덟 가방 (한 팔 샘플 타입의 각) 내에 억제를 손상하거나 퇴비 과정의 역학을 변경하지 않고 퇴비 과정 간격으로 퇴비 매트릭스에서 자신의 검색을 가능하도록 설계되었습니다 벙커를 채우기 위해 사용하는 것을 각 가방이 배설물에 의해 둘러싸여 있으며, 아무 가방 서로 직접 접촉 없었다고 있도록 준비. 비료 및 봉투 가득한 BRPs은 로그 체인의 길이에 첨부하여 퇴비 매트릭스 내에서 80cm와 160cm의 깊이에서 중단되었습니다. 체인은 1.5 m 간격 (그림 1)에서 벙커를 걸치는 나무 기둥에 정박했다. 각 BRP에 배치 T 타입 열전쌍은 또한 외부 퇴비 구조 위치 로거 데이터에 체인을 따라 실행했다. 지정한 간격으로, BRPs은 ratcheted를 사용하여 퇴비에서 수직으로 취소되었습니다 케이블 풀러 - 따라 오세요, 그리고 플라스틱 랩이 다시 봉인된 상태 였어요. 남부 앨버타의 자연 건조한 기후, 작은 강우량은 t 동안 받았다자신의 시대, 그러나 플라스틱 랩 및 퇴비 재료의 돔 모양의 짚 벙커 벽에서 흡수하는 측면 결선을 증진 효과했다.

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	<li>Reuter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+temporal+collection+of+tissue+and+microbial+samples+from+static+composting+systems.">A simple method for temporal collection of tissue and microbial samples from static composting systems.</a> Canadian Biosystems Engineering. 50, 6.17-6.20 (2008).</li><li>Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biosecure+composting+system+for+disposal+of+cattle+carcasses+and+manure+following+infectious+disease+outbreak.">A biosecure composting system for disposal of cattle carcasses and manure following infectious disease outbreak.</a> J. Environ. Qual. 38, 437-450 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

정적 퇴비의 1백47일 후, 총 질량, 건조 물질 (DM), 유기물, 총 탄소와 총 질소의 손실은 각각이 35.6, 52.9, 49.6 및 41.4 %, 23.7했다. 각 구조, 재료의 부피는 118에서 71m 3 감소 composted. 보빈 조직의 분해는 두뇌&gt; 발굽&gt; 뼈로 선정 모니터링. 퇴비 단 7 일 후, 뇌 조직 DM의&gt; 90 % 분해 있었는데, 발굽의 80 %는 DM 퇴비 56 D 내에서 분해했다. 에스 대장균 O157의 생존 능력의 완전한 상실 : H7과 뉴캐슬 질병은 14 일 이내에 달성되었습니다. 집중 가축 생산 시스템은 자연적 또는 고의적 전염성 질병 발생에 특히 취약합니다. 제한된 지역 동물의 많은 주택 것은 인구에 걸쳐 급속도로 전파 대부분의 전염성 요원 상승을 제공합니다. 봉쇄 어떤 전염성 질병 확산을 제어하는​​ 핵심이며, 따라서 과소가 큰 가축 인구 전염성 에이전트 확산을 방지하는 수단으로 자주 사용됩니다. 과소의 시나리오 가축의 주검과 빠른 처리를 요구하는 오염 비료 다수의 결과. 퇴비는 빠른 응답 처리 감염된 시체에 대한 방법뿐만 아니라 비료 및 전염성 에이전트를 항구 수로 토양라는 것으로. 우리는 농장이나 지역 농장 공급 상점에서 즉시 사용할 재료를 사용하여 질병 발생의 사이트에서 실시 수있는 퇴비 절차를 설명합니다. 우리의 연구에서 육우의 시체와 배설물과 관련된 전염성 요원이 퇴비 14 일 이내에 inactivated 있었다 퇴비 온도 55 ° C를 초과 하나 이상 개월 동안. 침출액 생산은 느슨한 밀짚베이스 레이어로 인해 흡수 자연 및 퇴비의 개시에 DM 컨텐츠를 최적화하는 데. 가능성, 매우 낮은되었습니다 침출액 총 수확량은 초기 퇴비 질량 (즉, 구조 당 &lt;300g)의 3보다 PPM했다. Coliforms은 최대 14 일 동안 5.8 log10 CFU / ML로에서 침출액에서 검색된지만, 퇴비의 101일 이후에 감지되지 않았습니다했다. 147일 후, 소 시체는 몇 긴 뼈가 인식되는 거의 저하되었습니다. 본즈는 토지 응용 프로그램에 적합한 최종 성숙 퇴비를 항복, biocontained 구조 연 후 추가 오픈 윈드의 퇴비주기 동안 추가로 저하되었다. 결론적으로, 퇴비는 대부분의 병원성 미생물의 생존에 상당한 도전을 제시 조건을 만듭니다. 무료 박테리아, 원생 동물문 및 바이러스가 급속하게 퇴비 내의 고온, 알칼리성 높은 프로 테아제와 nuclease 활동에 의해 inactivated입니다. 성숙한 피드롯 가축 주검이 성공적으로 분해는 정적 퇴비 처리 절차는 모든 일반적인 가축에 적합 될 것을 나타냅니다. 질소 비율 및 습기 수준 달성하는 미생물 죽이는 조건 위해서 현재 위치 : 병원은 그 최적의 탄소를 위해, 그러나, 이동해야합니다. 이러한 양식 포자 (예 : 탄저균), 또는 prions와 같은 비정상적으로 완강히 저항하는하는 사람은 아직 퇴비 후 infective 남아 수 있습니다 박테리아와 같은 본질적으로보다 내열성 병원균. 퇴비 과정에서 미생물의 이러한 유형의 운명을 명료하게하다하는 연구는 우리 실험실에서 현재 진행되고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1946/1946fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 짚으로 베일 벽, 바닥, 플라스틱 판금 인클로저, 느슨하게 짚을 기지, 가축 시체, 배설물, 천공 플라스틱 환기 튜브 및 환기구로 구성된 biosecure 퇴비 시스템의 도표 표현뿐만 아니라, 실험적 개정 (침출액 포트, 샘플 검색 피라미드 및 온도 센서. (A) 가로보기 (단면). (B) 세로보기 (측면 벽 제거). 모든 치수는 cm에 있습니다. 쑤 외. (2009) 2

biocontained carcass composting for control of infectious disease outbreak in livestock

집중 가축 생산 시스템은 자연이나 의도 (bioterrorist) 감염증의 발생에 특히 취약합니다. 제한된 지역 보관되어 동물의 큰 숫자는 무리에 걸쳐 가장 전염성 대리인의 빠른 보급이 가능합니다. 신속한 봉쇄 어떤 전염성 질병 확산을 제어하는​​ 핵심이며, 따라서 과소은 종종 큰 가축 인구 병원균의 확산 방지하기 위해 실시합니다. 그런 환경에서는 가축의 주검의 큰 번호와 오염 비료는 빠른 처리를 필요로 생성됩니다. 퇴비는 빠른 응답 처리 감염된 시체에 대한 방법뿐만 아니라 비료 및 전염성 에이전트를 항구 수로 토양라는 것으로. 우리는 바이오 포함된 사망률의 퇴비 절차를 설계 및 소 조직 저하 및 미생물 비활성화에 대한 효능을 테스트했습니다. 우리는 시스템이 질병 발생의 사이트에서 구현 수 있도록 현지 농장 공급 상점에서 온 농장 가능한 자료나 살 수를 사용합니다. 본 연구에서는, 온도는 55 ° C를 초과 하나 이상의 달 육우의 시체와 배설물 퇴비 14 일 이내에 inactivated되었습니다 이식 전염성 에이전트. 147일 후, 시체는 거의 완벽하게 저하되었다. 남은 몇 긴 뼈가 오픈 windrows에 추가 퇴비주기와 함께 더욱 저하되었고 최종 성숙 퇴비 토지 응용 프로그램에 적합했다. (최종 치수 25 MX 5 MX 2.4 m, L X 폭 x H) 퇴비 구조를 중복은 보리 짚을 베일즈를 사용하여 건설하고 무거운 검은 목초 플라스틱 판금 늘어서 있었다. 각 ~ 9만5천킬로그램 총 느슨한 밀짚, 시체와 배설물이 장전되어 있었어. 느슨한 보리 짚을의 40 cm베이스 레이어는 약 0.5 미터의 간격에 transversely 정렬 16 피드롯 가축 mortalities을 (평균 체중 343kg) 배치되었던에 각각 벙커에 배치되었다 수동 폭기 들면, 유연하고, 천공 플라스틱 배수 튜브 (15cm 직경)의 길이는 모두 내벽을 따라 수직으로 확장하고, 외관에 플라스틱하지만 전달 종료와 인접 시체 사이에 위치했다. 주검은 벙커의 상단에 습한 aerated 피드롯 비료 (~ 1.6 m 깊이)와 겹쳐 있었다. 플라스틱이 위에 접혀 있던 상단과 봉쇄 장벽 및 8 폭기 통풍구 (50 X 50 X 15cm) 수동 폭기를 홍보하기 위해 각 구조의 상단에 배치되었습니다을 확립하기 위해 테이프로 밀봉. 147일 후, composted 물질의 부피와 질량 손실은 각 구조에서 각각 39.8 %와 23.7 %를 평균.

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Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

쉽게 사용 가능한 재료를 사용하여이 biocontained 퇴비 시스템은 전염성 질병 발생의 경우에 발생하는 대형 동물 주검의 현장 처리를 효과적으로 수 있습니다. 이 절차는 시체와 배설물 오염에서 가장 전염성이 에이전트를 죽이기. 일단 감염 에이전트가 확인되지 않은 가능한, 성숙한 퇴비는 비료로 전염 수 있습니다.

가축의 전염성 질병 발발의 제어를위한 Biocontained 카캐스 퇴비

Intensive livestock production systems are particularly vulnerable to natural or intentional (bioterrorist) infectious disease outbreaks. Large numbers of ...

biocontained-carcass-composting-for-control-infectious-disease

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K 조회수.  Lethbridge Research Centre. 쉽게 사용 가능한 재료를 사용하여이 biocontained 퇴비 시스템은 전염성 질병 발생의 경우에 발생하는 대형 동물 주검의 현장 처리를 효과적으로 수 있습니다. 이 절차는 시체와 배설물 오염에서 가장 전염성이 에이전트를 죽이기. 일단 감염 에이전트가 확인되지 않은 가능한, 성숙한 퇴비는 비료로 전염 수 있습니다.

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Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

연구

면역학 및 감염병학

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Ixodes Scapularis 진드기의 타액, 침샘 및 Hemolymph 컬렉션

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major manifestation of S. suis infections. A suitable infection model is an essential tool to understand the mechanisms of diseases caused by pathogens. Several routes of infection in mice have been developed to study the pathogenesis of S. suis infection. However, the intraperitoneal, intranasal, and intravenous routes of infection are not suitable for studying the roles of S. suis surface components in meningitis directly in the brain, such as the extracellular matrix from biofilms. Although intracisternal inoculation has been used for S. suis infection, the precise injection site has not been described. Here, the intracranial subarachnoidal route of infection was described in a mouse model to investigate the roles of biofilms in S. suis meningitis. S. suis planktonic cells or biofilm state cells were directly injected into the subarachnoid space of mice through the injection site located 3.5 mm rostral from the bregma. Histopathological analysis and increased mRNA expression of TLR2 and cytokines of the brain tissue from mice injected with biofilm state cells clearly indicated that S. suis biofilm plays definitive roles in S. suis meningitis. This route of infection has obvious advantages over other routes of infection, allowing the study of the host-bacterium interaction. Furthermore, it permits the effect of bacterial components on host immune responses directly in the brain to be assessed, and mimics bacterial entrance into the central nervous system. This route of infection can be extended for investigating the mechanisms of meningitis caused by other bacteria. In addition, it can also be used to test the efficacy of drugs against bacterial meningitis.

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Here, we describe the intracranial subarachnoidal route of infection in mice to study roles of biofilms in Streptococcus suis meningitis. This infection model is also suitable for studying the pathogenesis of other bacterial meningitis and the efficacy of new drugs against bacterial meningitis.

마우스 감염 모델에서 뇌 막 염에 구 이렇게 뵙 Biofilms의 조사 역할에 대 한 감염 intracranial Subarachnoidal 경로

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...