Dieses Projekt wurde mit Mitteln aus dem chemischen, biologischen, radiologischen und nuklearen (CBRN) Forschung und Technologie Initiative (CRTI) der Canadian Food Inspection Agency und der Alberta Prion Research Institute durchgeführt. Die National Natural Science Foundation of China vorgesehen ein Stipendium (No. 30620120430) zu W. Xu. Die Autoren bedanken sich Brant Baker und Fred Van Herk, sowie Ruth Barbieri, Lisa Kalischuk-Tymensen, Andrew Olson, Lorna Selinger, Geoff Wallins und Homayoun Zahiroddini für ihre technische Unterstützung.

Doppelte Kompost Strukturen wurden auf dem Lethbridge Research Centre (LRC) in Lethbridge, Alberta, Kanada (Abb. 1) konstruiert. Große rechteckige Gerste Strohballen (260 x 120 x 80 cm; L x W x H) wurden für die Wände, und kleine Ballen (100 x 40 x 45 cm) für den Boden verwendet. Große Ballen wurden so ausgerichtet, Wände waren 120 cm dick, die maximale Stabilität Wand und Wärmeschutz. Die kleinen Ballen bildet den Boden ausgerichtet waren mit einer Schnur horizontal verlaufenden, um Absorption im Falle eines Lecks zu maximieren, was zu einem Boden 45 cm dick. Abmessungen der Strukturen wurden 25 mx 5 mx 2,4 m; L x W x H). Die Baustelle hatte eine Neigung von etwa 1, und die Strukturen wurden orientiert flow von Sickerwasser in Richtung der Probenahme-Port, dass wir für die experimentelle Prüfung eingesetzt zu fördern. Moist feedlot Gülle vermischt und durch die Verarbeitung durch einen Miststreuer und Poltern für 24 h vor dem Bau des Sicherheitsbehälters Strukturen belüftet. Der Kompost Bunker waren mit schweren, schwarzen / weißen Plastikplanen häufig verwendet, um Silage Pfähle Abdeckung ausgekleidet. Ausreichende Überschuss over the top in jeder Richtung nach links, damit eventuelle Fold-down-und Abdichtung der Kompost Bett in den Bunker. Zur Bekämpfung einer Umgebungstemperatur Brise, wurden Reifen verwendet werden, um den Kunststoff in den Bunker Gewicht bis das Stroh beladen war, aber diese waren vor dem Kadaver versendet entfernt. Sobald das Sickerwasser Probenahme-Port (notwendig für experimentelle Probenahme nur) installiert wurde, war locker Gerstenstroh in die Bioabdichtung Struktur hinzugefügt, um eine Basisschicht etwa 40 cm Dicke zu bilden. Dies wurde durch die Bereitstellung einer einzigen Runde Ballen mit einem Frontlader und manuell verteilt das Stroh entlang der Länge des Bunkers durchgeführt. Sechzehn feedlot Vieh verendete, wurden auf dem Strohlager gelegt. Diese wurden Rinder, die innerhalb der letzten 48 Stunden im nahe gelegenen gewerblichen Weiden gestorben war, nachdem die Mehrheit an Atemwegserkrankungen beim Rind erlegen. Die Kadaver wurden quer in der Kompostierung Bunker (Abb. 1) ausgerichtet ist, mit einer Fläche von ca. 0,5 m zwischen Schlachtkörpern. Um passive Belüftung, wurden Längen von perforierten flexiblen Kunststoff-Drainage-Schlauch (15 cm Durchmesser) zwischen benachbarten Kadaver gelegt, eingebettet in die lockere Stroh Basis. Die Enden der Rohre wurden vertikal entlang der Seitenwände, die über den oberen Rand des Bunkers gerichtet, und an der Stelle vorübergehend mit Reifen Erweiterung an der oberen Oberfläche der Wände. Pre-bedingten feedlot Gülle wurde in den Bunker geladen, um die Kadaver zu einer endgültigen Tiefe von 1,6 m. Deckel Der Mist wurde über die Seitenwand des Bunkers geladen, sich von einem Ende der Struktur nach der anderen. Die Probe Abruf Pyramiden unten beschrieben wurden mit dem vorgeschriebenen Tiefen innerhalb des Gülle-Schicht in dieser Phase positioniert. Nachdem der Bunker gefüllt war, wurde die Plastikplanen über die Oberseite der gestapelten Mist gefaltet und die Enden der perforierten Schläuchen wurden durchgeleitet, so dass sie außen waren die wrap entfernt. Der Kunststoff wurde mit Klebeband abgedichtet, um eine Eindämmung Barriere um das Stroh, Kadaver und Mist zu etablieren. Acht Belüftung Öffnungen (50 x 50 x 15 cm) wurden auf der Oberseite jeder Struktur gelegt, um passive Belüftung zu fördern, und T-förmigen Stecker wurden an jedem Ende der Längen der perforierten Schlauch befestigt, um den Luftstrom zu fördern hinunter in die Rohre. In dieser Pilotstudie wurden experimentelle Änderungen an der Kompost-Strukturen integriert, um Untersuchung der Pathogeninaktivierung und Abbau von Gewebe während der statischen Kompostierung zu ermöglichen. Tissue und mikrobielle Proben von Gewebe Gewicht oder mikrobielle Aufzählung vor quantifiziert wurden heißgesiegelten in Nylon Probenbeutel (5 x 9 cm; 50-um Porengröße), und verpackt in spezialisierten pyramidal Stahl Käfige, bezeichnet als Baker Retrieval Pyramiden (BRP) 1. Diese Pyramiden wurden entwickelt, um ihre Rückholung aus dem Kompost-Matrix in Abständen ermöglichen während der Kompostierung ohne ernsthaft beeinträchtigen Eindämmen oder Veränderung der Dynamik der Kompostierung Innerhalb eines BRP, acht Taschen (jeweils acht Sample-Typen) wurden in der gleichen Mist embedded , die verwendet wurde, um den Bunker zu füllen, so angeordnet, dass jede Tasche von Dünger umgeben war und keine Beutel wurden in direkten Kontakt miteinander. Gülle-und Beutel gefüllt BRPs wurden zu Längen von Logging-Kette befestigt und aufgehängt in einer Tiefe von 80 cm und 160 cm in der Kompost-Matrix. Die Ketten wurden Holzstangen überspannt den Bunkern am 1,5-Meter-Intervallen (Abb. 1) verankert. T-Typ-Thermoelemente in jeder BRP platziert waren auch entlang der Ketten an einen Datenlogger extern an den Kompost Struktur positioniert laufen. In festgelegten Intervallen wurden BRPs vertikal von den Kompost mit einem ratcheted zurückgezogen come-sowie Kabel-Abzieher und die Plastikfolie wurde wieder verschlossen. In den natürlich ariden Klima des südlichen Alberta, wenig Niederschläge während t erhaltenseiner Zeit, aber die Plastikfolie und gewölbte Form der Kompostierung Material wirksam waren für die Förderung der seitlichen Abfluss durch das Stroh Bunkerwänden absorbiert werden.

<ol>
	<li>Reuter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+temporal+collection+of+tissue+and+microbial+samples+from+static+composting+systems.">A simple method for temporal collection of tissue and microbial samples from static composting systems.</a> Canadian Biosystems Engineering. 50, 6.17-6.20 (2008).</li><li>Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biosecure+composting+system+for+disposal+of+cattle+carcasses+and+manure+following+infectious+disease+outbreak.">A biosecure composting system for disposal of cattle carcasses and manure following infectious disease outbreak.</a> J. Environ. Qual. 38, 437-450 (2009).</li></ol>

Nach 147 Tage von statischen Kompostierung, konnten die Verluste der Gesamtmasse, Trockensubstanz (TS), organische Substanz, Gesamt-C und Gesamt-Stickstoff 23,7, 35,6, 52,9, 49,6 und 41,4% bzw. 2. Innerhalb der einzelnen Struktur, kompostiert das Volumen der Materialien von 118 bis 71 m 3 verringert. Die Zersetzung des Rindergewebe überwacht als brain&gt; Huf&gt; Knochen eingestuft. Nach nur 7 Tagen der Kompostierung, hatten&gt; 90% des Hirngewebes DM zerlegt, und 80% der Huf DM hatte innerhalb von 56 d der Kompostierung zerlegt. Vollständiger Verlust der Lebensfähigkeit von Escherichia coli O157: H7 und Newcastle Disease wurde innerhalb von 14 Tagen erreicht. Intensive Tierproduktion Systeme sind besonders anfällig für natürliche oder vorsätzliche Ausbrüche von Infektionskrankheiten. Gehäuse eine große Zahl von Tieren in einem begrenzten Bereich entstehen die meisten Krankheitserreger verbreiten sich schnell in der gesamten Bevölkerung. Containment ist der Schlüssel zur Steuerung einer Infektionskrankheit Ausbruch ist somit Entvölkerung häufig als Mittel zur Verhinderung von Ausbreitung des Erregers zu den größeren Viehbestand verwendet. Die Entvölkerung Szenario ergibt sich eine große Zahl von Nutztieren Kadavern und kontaminierten Dünger erfordert rasche Entsorgung. Kompostierung eignet sich als Rapid-Response-Entsorgungsmethode für infizierte Kadaver sowie Gülle und Boden, der Infektionserreger Hafen kann. Wir skizzieren eine Kompostierungsanlage Verfahren, das auf dem Gelände der Krankheitsausbruch geführt werden kann, die Verwendung von Materialien leicht zugänglich auf dem Bauernhof oder aus dem lokalen Farm-Versorgung-Läden. In unserer Studie Infektionserreger mit Rinder Kadaver und Mist verbundenen innerhalb von 14 Tagen der Kompostierung wurden inaktiviert, erreichte über Kompost Temperaturen von 55 ° C für mehr als einen Monat. Die Produktion von Sickerwasser war äußerst gering, wahrscheinlich aufgrund der absorbierenden Art der losen Stroh Basisschicht und unsere mit optimierter der TS-Gehalt zu Beginn der Kompostierung. Insgesamt ergibt sich von Sickerwasser wurden weniger als 3 ppm des ursprünglichen Kompost Masse (dh &lt;300 g pro Struktur). Coliforme Keime wurden im Sickerwasser auf bis zu 5,8 log10 CFU / ml nach 14 Tagen entdeckt, aber waren nicht nachweisbar nach 101 Tagen der Kompostierung. Nach 147 Tage waren Rinderschlachtkörper fast vollständig abgebaut mit nur wenigen langen Knochen erkennbar ist. Bones wurden weiter abgebaut während die zusätzlichen Open-Feldrandkompostierung Zyklus nach der biocontained Strukturen geöffnet wurden, wodurch abschließende reifem Kompost geeignet für die Ausbringung. Im Ergebnis schafft die Kompostierung Bedingungen, die wesentliche Herausforderung für das Überleben der meisten pathogenen Mikroorganismen. Kostenlose Bakterien, Protozoen und Viren werden schnell durch die hohe Temperatur, Alkalinität und hohe Protease und Nuklease-Aktivitäten innerhalb von Kompost inaktiviert. Diese erfolgreiche Abbau der reifen feedlot Rinder Kadaver zeigt an, dass diese statische Kompostierung Entsorgung Verfahren wäre passend für alle gängigen Vieh. Es muss darauf geachtet, jedoch werden in diesem optimalen Kohlenstoff zu gewährleisten: Stickstoff-Verhältnisse und Feuchtigkeit vorhanden sind, um für Mikrobenabtötung Bedingungen erreicht werden. Erreger von Natur aus hitzebeständigem, wie Bakterien, Sporen bilden (zB Anthrax), oder solche, die ungewöhnlich hartnäckigen sind, wie Prionen, noch infektiös bleiben kann nach der Kompostierung. Studien über das Schicksal dieser Arten von Mikroorganismen während der Kompostierung erläutern sind derzeit in unserem Labor im Gange. <img src="/files/ftp_upload/1946/1946fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des biologisch sicher Kompost, bestehend aus Strohballen Wände und Boden, Plastikplanen Gehäuse, lose Stroh Basis-, Rinder-Tierkörpern, Mist und perforiertem Kunststoff Lüftungs-Schlauch, und Lufteinlässe sowie experimentelle Änderungen (Sickerwasser-Port, Probe Abruf Pyramiden-und Temperatursensoren. (A) Queransicht (Querschnitt). (B) Längsschnitt (Seitenwand entfernt). Alle Maße sind in cm. Von Xu et al. (2009) 2

biocontained carcass composting for control of infectious disease outbreak in livestock

Intensive Tierproduktion Systeme sind besonders anfällig für natürliche oder vorsätzliche (bioterroristischen) Ausbrüche von Infektionskrankheiten. Eine große Zahl von Tieren in einem begrenzten Bereich untergebracht ermöglicht die schnelle Verbreitung der meisten Infektionserreger in einer Herde. Schnelle Eingrenzung ist der Schlüssel zur Steuerung einer Infektionskrankheit Ausbruch, so Entvölkerung wird oft durchgeführt, um zu verhindern eines Erregers zu den größeren Viehbestand zu verbreiten. In diesem Umstand sind eine große Anzahl von Tieren Kadavern und kontaminierten Dünger erzeugt, erfordern eine schnelle Entsorgung. Kompostierung eignet sich als Rapid-Response-Entsorgungsmethode für infizierte Kadaver sowie Gülle und Boden, der Infektionserreger Hafen kann. Wir haben eine Bio-enthaltenen Sterblichkeit Kompostierung Verfahren und testete seine Wirksamkeit für Rindergewebe Abbau und mikrobielle Deaktivierung. Wir verwendeten Materialien auf dem Bauernhof oder käuflich von lokalen Farm-Versorgung-Läden in Ordnung, dass das System an der Stelle der Ausbruch einer Krankheit umgesetzt werden können. In dieser Studie überschritten Temperaturen von 55 ° C für mehr als einen Monat und Infektionserregern in Rinder Kadaver und Mist wurden innerhalb von 14 Tagen Kompostierung inaktiviert implantiert. Nach 147 Tage wurden Kadaver fast vollständig abgebaut. Die wenigen langen Knochen übrigen wurden weiter abgebaut mit einem zusätzlichen Kompostierung Zyklus in offenen Mieten und die endgültige reifem Kompost geeignet war für die Ausbringung. Doppelte Kompost Strukturen (final Abmessungen 25 mx 5 mx 2,4 m; L x W x H) wurden unter Verwendung Gerste Strohballen und ausgekleidet mit schweren schwarzen Silage Plastikplanen. Jeder war mit losem Stroh, Kadaver und Mist in Höhe von ~ 95.000 kg belastet. Ein 40-cm Tragschicht lose Gerstenstroh wurde in jedem Bunker gelegt, auf die es 16 feedlot Vieh verendete (durchschnittliches Gewicht 343 kg) quer im Abstand von ca. 0,5 m. ausgerichtet ist Für passive Belüftung, wurden Längen flexible, perforierte Kunststoff-Drainage-Schlauch (15 cm Durchmesser) zwischen benachbarten Tierkörpern angebracht, der sich vertikal entlang der beiden Innenwände und mit den Enden obwohl der Kunststoff nach außen geleitet. Die Kadaver wurden mit feuchten belüftet feedlot Gülle (~ 1,6 m tief) an die Spitze des Bunkers überlagert. Plastic wurde gefaltet oben und versiegelt mit Klebeband zu einer Eindämmung Barriere und acht Belüftung Öffnungen (50 x 50 x 15 cm) wurden auf der Oberseite jeder Struktur auf passive Belüftung fördern platziert zu etablieren. Nach 147 Tage, im Durchschnitt Verluste von Volumen und Masse kompostiert Materialien 39,8% und 23,7% bzw. in jeder Struktur.

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Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

Mit leicht verfügbaren Materialien, ermöglicht diese biocontained Kompostieranlage effektiven Vor-Ort-Entsorgung großer Tierkadaver die sich im Falle von Infektionskrankheiten Ausbruch. Dieses Verfahren tötet die meisten Erreger in Kadavern und kontaminierten Dünger. Sobald Erreger bestätigt nicht lebensfähig, reifem Kompost kann als Dünger verteilt werden.

Biocontained Carcass Kompostierung für Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

Intensive livestock production systems are particularly vulnerable to natural or intentional (bioterrorist) infectious disease outbreaks. Large numbers of ...

biocontained-carcass-composting-for-control-infectious-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K Aufrufe.  Lethbridge Research Centre. Mit leicht verfügbaren Materialien, ermöglicht diese biocontained Kompostieranlage effektiven Vor-Ort-Entsorgung großer Tierkadaver die sich im Falle von Infektionskrankheiten Ausbruch. Dieses Verfahren tötet die meisten Erreger in Kadavern und kontaminierten Dünger. Sobald Erreger bestätigt nicht lebensfähig, reifem Kompost kann als Dünger verteilt werden.

Serie: Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identifizierung von Maus und humanen Antikörpers Repertoires durch Sequenzierung der nächsten Generation

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Quantifizierung von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern in SARS-CoV-2-Varianten

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

Autor im Rampenlicht: Ein Pseudotyp-Virussystem zur Bewertung von Omikron-Subvarianten und zur Neutralisierung von Antikörpern in der SARS-CoV-2-Forschung

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus zur schnellen Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und neutralisierenden Antikörpern

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...