Bu proje, Kimyasal, Biyolojik, Radyolojik ve Nükleer (KBRN) Araştırma ve Teknoloji Girişimi (CRTI) Kanada Gıda Denetim Ajansı ve Alberta Prion Araştırma Enstitüsü finansman ile gerçekleştirildi. Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı W. Xu (No 30620120430) için burs sağladı. Yazarlar Brant Baker ve Fred Van Herk, Ruth Barbieri yanı sıra, Lisa Kalischuk-Tymensen Andrew Olson, Lorna Selinger Geoff Wallins ve Homayoun Zahiroddini kendi teknik destek için teşekkür ederiz.

Yinelenen kompost yapılar Lethbridge, Alberta, Kanada Lethbridge Araştırma Merkezi (LRC) (Şekil 1) inşa edildi. Geniş dikdörtgen bir arpa saman (260 x 120 x 80 cm; L x W x H), duvarlar ve zemin için küçük balyalar (100 x 40 x 45 cm) kullanılmıştır. Büyük balyalar duvarları 120 cm kalınlığındaki maksimize duvar istikrar ve ısı tutma ediliyordu odaklı. Zemin oluşturan küçük balyalar sicim, 45 cm kalınlığında bir kat verimli bir sızıntı durumunda absorbans en üst düzeye çıkarmak için yatay çalışan odaklı. L x G x Y); yapıları Genel boyutlar 25 mx 5 mx 2.4 m. İnşaat alanı yaklaşık 1 bir yamaç vardı ve yapıların deneysel değerlendirilmesi için eklenen örnekleme portu doğru sızıntı suyunun akışını teşvik etmek odaklı. Nemli besi gübresi, gübre serpme makinesi ile işleme ve muhafaza yapıları inşaatı öncesinde 24 saat için kazık ile karıştırılır ve gazlı oldu. Kompost sığınakları yaygın silaj kazık karşılamak için kullanılan ağır siyah / beyaz plastik kaplama ile kaplı. Nihai kat aşağı ve ihrakiye içinde kompost yatak sızdırmazlık sağlamak için yeterli artı her yönde en iyi üzerinde kaldı. Ortam bir esinti ile mücadele için, lastik, saman yüklü kadar sığınakta plastik ağırlığı kullanılır, ancak bu karkasların konuyor önce çıkarıldı. Sızıntı suyu örnekleme noktası (sadece deneysel örnekleme için gerekli) yüklendikten sonra, gevşek arpa saman tabanı yaklaşık 40 cm kalınlığında bir tabaka oluşturur biyo-çevreleme yapısı ilave edildi. Bu bir ön uç yükleyici ile tek bir yuvarlak balya sunan ve elle sığınağın uzunluğu boyunca saman dağıtımını gerçekleştirildi. Onaltı besi büyükbaş hayvan ölümlerinin saman yatağa yerleştirildi. Bunlar yakındaki ticari besi işletmelerinin önceki 48 saat içinde öldüğünü sığır, çoğunluğu sığır solunum yolu hastalıklarına yenik düştü. Karkaslar, karkaslar arasında yaklaşık 0,5 m bir boşluk içinde enine kompostlama bunker (Şekil 1) uyumlu hale getirilmiştir. Pasif havalandırma sağlamak için, delikli esnek plastik drenaj boru (15 cm çapında) uzunlukları gevşek saman baz içinde gömülü, komşu karkaslar arasında atıldı. Bunker üst ötesine uzanan yan duvarları boyunca dikey boru uçları yönettiği ve geçici duvarların üst yüzeyi geçmiş uzanan lastikler kullanılarak yerinde düzenlenen edildi. Ön şartlı besi gübre nihai 1.6 m. derinliğe kadar karkaslar kapsayacak şekilde sığınakları yüklenir Yapının bir ucundan diğer ucuna doğru gübre taşıma, ihrakiye yan duvarın üzerinden yüklendi. Aşağıda açıklanan numune alma piramitler, gübre tabakası içinde bu aşamada, reçete derinliklerde yerleştirilmiştir. Bunker doluydu sonra plastik kaplama, kazıklı gübre üstünden katlanmış ve delikli boru uçlarının sarmak için dış yer, böylece geçerek. Plastik, saman, karkaslar ve gübre etrafında bir çevreleme bariyer kurmak için bant ile imzalandı. Sekiz havalandırma delikleri (50 x 50 x 15 cm), pasif havalandırma teşvik etmek için her bir yapının üstüne yerleştirilmiştir ve T-biçimli konektörler tüpler içine hava akışını teşvik etmek için her iki ucunda delikli boru uzunlukları bağlıydık. Bu pilot çalışmada, kompost yapıların deneysel değişikliklerin statik kompostlama işlemi sırasında patojen inaktivasyonu ve doku bozulması soruşturma etkinleştirmek için dahil edilmiştir. Doku ve mikrobiyal örnekleri doku ağırlık veya mikrobiyal numaralandırma tarafından önceden sayısal ısı sızdırmaz, naylon örnek torbalar içine (5 x 9 cm, 50 mikron gözenek boyutu) ve Baker Alma Piramitleri (BRP) olarak belirlenmiş, uzman piramidal çelik kafesler içine paketlenmiş 1. Aynı gübre gömüldü Bu piramitler ciddi bir BRP, sekiz çanta (her sekiz numune türleri) içinde çevreleme ödün veya kompost sürecin dinamiklerini değiştiren kompostlama işlemi sırasında aralıklarla kompost matris alma sağlamak için dizayn edilmiştir bunker doldurmak için kullanılan, her torba gübre ile çevrilidir ve hiçbir çanta birbirleri ile doğrudan temas halinde olduğu şekilde düzenlenmiştir. Gübre ve çanta dolu BRPs giriş zincir uzunlukları ve 80 cm ve 160 cm derinliklerde kompost matriks içinde askıya alındı. Zincirleri 1.5 m aralıklarla (Şekil 1) sığınakları kapsayan ahşap direkler demirlemiş. Her BRP yerleştirilen T-tipi termokupl da kompost yapısı dışarıdan konumlandırılmış logger bir veri zincirleri boyunca çalıştırıldı. Belirtilen aralıklarla, BRPs bir kışkırtmalar kullanarak kompost dikey çekildi kablo çektirmenin yanı sıra gelir ve plastik ambalaj malzemesi ile yeniden imzalandı. Güney Alberta doğal kurak iklim, az yağış t sırasında alınanyaptığı dönemde, ancak plastik sarın ve kompostlama malzeme kubbeli şekli saman bunker duvarları tarafından emilir, yanal akış teşvik etmek için etkili olmuştur.

<ol>
	<li>Reuter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+temporal+collection+of+tissue+and+microbial+samples+from+static+composting+systems.">A simple method for temporal collection of tissue and microbial samples from static composting systems.</a> Canadian Biosystems Engineering. 50, 6.17-6.20 (2008).</li><li>Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biosecure+composting+system+for+disposal+of+cattle+carcasses+and+manure+following+infectious+disease+outbreak.">A biosecure composting system for disposal of cattle carcasses and manure following infectious disease outbreak.</a> J. Environ. Qual. 38, 437-450 (2009).</li></ol>

147 gün sonra statik kompostlama, toplam kütlesi, kuru madde (DM), organik madde, toplam karbon ve toplam azot kayıpları, sırasıyla 2 35.6, 52.9, 49.6 ve% 41.4, 23.7. Her yapı içinde, malzeme hacmi 71 118 m 3 &#39;e düşmüştür kompost. Sığır dokuların Ayrışma beyin&gt; toynak&gt; kemik olarak sıralanır izlenmektedir. Kompostlama sadece 7 gün sonra, beyin dokusu DM&gt;% 90 çürümüş ve toynak% 80 DM kompostlama 56 gün içinde çürümüş. Escherichia coli O157 canlılığı tam kaybı: H7 ve Newcastle Hastalığı 14 gün içinde elde edilmiştir. Yoğun hayvansal üretim sistemleri, doğal ya da kasıtlı bulaşıcı hastalık salgınları özellikle savunmasız. Sınırlı bir alan içinde hayvanların çok sayıda Konut, nüfusu içinde hızla yayılması en enfeksiyöz ajanlar yol açmaktadır. Sınırlama herhangi bir bulaşıcı hastalık salgını kontrol etmek son derece önemlidir, dolayısıyla kente göç büyük çiftlik hayvanları popülasyonu enfeksiyöz ajan yayılmasını önlemek için bir araç olarak sık sık kullanılır. Kente göç senaryo çok sayıda hayvan karkasları ile hızlı bir şekilde bertaraf gerektiren kirlenmiş gübre ile sonuçlanır. Kompost enfekte Gövdeler için hızlı yanıt veren bertaraf yöntemi yanı sıra gübre ve toprak enfeksiyöz ajanlar limanı olabilir olarak kendini katıyor. Biz, çiftlikte veya yerel çiftlik besleme mağazalardan hazır malzemeler kullanılarak, hastalık salgınını yerinde yapılabilir bir kompostlama prosedürü anahat. Bizim çalışmamızda, sığır karkas ve gübre ile ilişkili enfeksiyöz ajanlar kompostlama 14 gün içinde inaktive bir kompost sıcaklıkları 55 aştı ° C fazla bir ay. Sızıntı suyu üretimi gevşek saman temel tabakası nedeniyle emici doğa ve kompostlama başlangıcında DM içeriğin optimize. Olasılıkla, son derece düşük Toplam sızıntı suyu verimi ilk kompost kütle (yani, yapısına göre &lt;300 gr) en az 3 ppm. Koliformlar sızıntı suyu 14 gün 5.8 log10 CFU / ml kadar tespit, ancak 101 gün sonra kompostlama algılanamaz. 147 gün sonra, sığır karkaslarının sadece birkaç uzun kemiklerin tanınabilir olan neredeyse tamamen bozulmuş. Kemikler, arazi uygulaması için uygun final olgun kompost verimli biocontained yapılar açıldıktan sonra ek açık windrow kompost döngüsü sırasında daha da bozulmuş. Sonuç olarak, kompostlama, pek çok patojenik mikroorganizmaların yaşaması için önemli bir sorun mevcut koşullar oluşturur. Kompost içinde yüksek sıcaklık, alkalinite ve yüksek proteaz ve nükleaz faaliyetleri Ücretsiz bakteriler, protozoa ve virüsler hızla inaktive edilir. Olgun besi sığır karkaslarının Bu başarılı bir ayrışma bu statik kompostlama bertaraf prosedürü tüm yaygın hayvancılık için uygun olacağını gösterir. Azot oranları ve nem seviyesini elde edilecek mikrobiyal koşulları öldürmek için mevcut: Bakım, bu en iyi karbon sağlamak için, ancak, alınması gerekir. Form sporları (örneğin, şarbon), ya da böyle prionlar gibi alışılmadık inatçı olanlardır, hala kompostlama sonra enfektif kalabilir bakterilerin gibi doğal olarak daha fazla ısıya dayanıklı patojenler,. Laboratuvarımızda, kompostlama işlemi sırasında mikroorganizmaların bu tür kaderi aydınlatmak için çalışmalar halen devam etmektedir. <img src="/files/ftp_upload/1946/1946fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 saman balya duvarlar ve zemin, plastik kaplama muhafaza, gevşek saman tabanı, sığır karkaslar, gübre, delikli plastik havalandırma boru ve hava delikleri içeren biosecure bir kompost sisteminin şematik gösterimi yanı sıra deneysel değişiklikler (sızıntı suyu bağlantı noktası, numune alma , piramitler ve sıcaklık sensörleri (A) Enine görünümü (kesit) (B) Boyuna görünümü (yan duvar kaldırıldı) Tüm boyutlar cm Xu ve ark. (2009) 2

biocontained carcass composting for control of infectious disease outbreak in livestock

Yoğun hayvansal üretim sistemleri, doğal ya da kasıtlı olarak (biyoterörist) bulaşıcı hastalık salgınları özellikle savunmasız. Büyük sayıda dar bir alan içinde yer hayvanların bir sürü boyunca en enfeksiyöz ajanlar hızla yayılmasına olanak sağlar. Hızlı herhangi bir bulaşıcı hastalık salgınını kontrol altına anahtar, böylece kente göç genellikle büyük çiftlik hayvanları popülasyonu bir patojenin yayılmasını önlemek için yapılmaktadır. Bu durumda, hayvancılık karkasların çok sayıda ve dışkılarıyla, hızlı bir şekilde bertaraf gerektiren üretilir. Kompost enfekte Gövdeler için hızlı yanıt veren bertaraf yöntemi yanı sıra gübre ve toprak enfeksiyöz ajanlar limanı olabilir olarak kendini katıyor. Biz bir biyo-içerdiği ölüm kompostlama prosedürü tasarlanmış ve sığır doku bozulması ve mikrobiyal deaktivasyon etkinliğini test. Biz sistemi bir hastalık salgını yerinde uygulanan edilebilmesi için, yerel çiftlik kaynağı mağazalardan, çiftlik malzeme veya satın alınabilir bir kullanılır. Bu çalışmada, sıcaklık 55 aştı ° C bir aydan fazla ve sığır karkas ve gübre kompostlama 14 gün içinde inaktive implante enfeksiyöz ajanlar için. 147 gün sonra, karkaslar, neredeyse tamamen bozulmuştur. Kalan birkaç uzun kemiklerin açık Rüzgar dizileri ek bir kompost döngüsü ile daha da bozulmuş ve son olgun kompost arazi uygulaması için uygun. Arpa saman balyaları kompost yapıları çoğaltın (son boyutlar 25 mx 5 mx 2.4 m, L x G x Y) kullanılarak inşa edilmiş ve ağır siyah silaj plastik kaplama ile kaplı. Her gevşek saman, toplam ~ 95.000 kg karkas ve gübre yüklü oldu. Gevşek arpa saman 40 cm temel tabakası her sığınakta yaklaşık 0,5 m aralık enine hizalanmış 16 besi büyükbaş hayvan ölümlerinin (ortalama ağırlığı 343 kg) yerleştirildi üzerine yerleştirildi Pasif havalandırma için, esnek, delikli plastik drenaj boru (15 cm çapında) uzunlukları, komşu karkaslar arasındaki dikey hem iç duvarları boyunca uzanan ve dış plastik rağmen geçen biter yerleştirildi. Karkaslar sığınağın üstüne nemli gazlı besi gübre (~ 1.6 m derinliğinde) ile üst üste. Plastik üzerine katlanmış ve üst bant çevreleme bariyer ve sekiz havalandırma delikleri (50 x 50 x 15 cm), pasif havalandırma teşvik etmek için her yapı üst yerleştirildi kurmak ile mühürlenir. 147 gün sonra, kompost malzemelerin hacim ve kütle kayıpları, her yapı, sırasıyla% 39.8 ve% 23.7 ortalama.

Watch this Scientific Journal Video about Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock at JoVE.com

Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

Hazır malzemeler kullanarak, bu biocontained kompostlama sistemi, bulaşıcı hastalık salgını durumunda ortaya çıkan büyük hayvan leşleri yerinde imha etkili sağlar. Bu prosedür, karkas ve dışkılarıyla en enfeksiyöz ajanlar öldürür. Enfeksiyöz ajan teyit cansız, olgun kompost gübre olarak yayılır.

Hayvancılık Bulaşıcı Hastalık Salgın Kontrol Biocontained Karkas Kompostlama

Intensive livestock production systems are particularly vulnerable to natural or intentional (bioterrorist) infectious disease outbreaks. Large numbers of ...

biocontained-carcass-composting-for-control-infectious-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K Görüntüleme.  Lethbridge Research Centre. Hazır malzemeler kullanarak, bu biocontained kompostlama sistemi, bulaşıcı hastalık salgını durumunda ortaya çıkan büyük hayvan leşleri yerinde imha etkili sağlar. Bu prosedür, karkas ve dışkılarıyla en enfeksiyöz ajanlar öldürür. Enfeksiyöz ajan teyit cansız, olgun kompost gübre olarak yayılır.

Video: Biocontained Carcass Composting for Control of Infectious Disease Outbreak in Livestock

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

SARS-CoV-2 Varyantlarında Aşı Kaynaklı Nötralize Edici Antikorların Miktarının Belirlenmesi

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

Yazar Spotlight: SARS-CoV-2 Araştırmalarında Omicron Alt Varyantlarını Değerlendirmek ve Antikorları Nötralize Etmek için Sahte Tip Bir Virüs Sistemi

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

SARS-CoV-2 Varyantlarının Hızlı Miktar Tayini ve Nötralize Edici Antikorlar için Ha-CoV-2 Psödovirüsünün Uygulanması

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...