טרנספקציה של תאי 293FT עם מבני ביטוי pCMV5-NanoLuc-CRAF ו-pCMV5-14-3-3ζ-Halo

כדי להתחיל, לקחת 293FT תאים תרבית בצלחת 10 ס"מ, ולשאוף את התקשורת. לשטוף תאים עם חמישה מיליליטר של PBS. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין EDTA, ודגרים במשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק תאים מהמנה.

לאחר הדגירה, הוסף תשעה מיליליטר של DMEM מלא לתאים כדי לנטרל את הטריפסין. פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב כדי ליצור השעיה הומוגנית של תא בודד, ולהעביר את התאים לצינור 15 מיליליטר. מיד להעביר 20 מיקרוליטר של תאים צינור 1.7 מיליליטר, ומערבבים עם 20 מיקרוליטר של כתם כחול trypan.

ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר. מעבירים את נפח התאים המתאים לצינור 50 מיליליטר, ומדללים ב- DMEM מלא. הוסף שני מיליליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת שש בארות.

לדגור על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-10% פחמן דו-חמצני למשך הלילה. לפני הטרנספקציה, יש לדלל ננולוציפראז CRAF ופלסמידים 1433 הילה של זטה, יחד עם וקטור ריק pCDNA3 במאגר TE. תייגו סט של צינורות סטריליים של 1.7 מיליליטר.

הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה transfection לכל צינור, יחד עם מבני ביטוי. עכשיו להוסיף שני מיקרוליטרים של מגיב transfection, מערבול בעדינות לערבב. דופק לסובב את הצינורות לזמן קצר במיקרוצנטריפוגה, ולאחר מכן לדגור את הצינורות בסביבות 25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאפשר קומפלקסים transfection להיווצר.

לאחר מכן, הוסיפו קומפלקסים של טרנספקציה לתאים טיפתית, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות כדי לבטא את ההילה ואת החלבונים הננו-מתויגים.