Wir danken Dr. Steven Austad, die uns mit der ersten Version dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und der Ellison Medical Foundation zu VG und AS unterstützt

1. Vor dem Start <ol><li> Sterilisieren Schere und Pinzette mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie kleine Magnetrührer in einem 30 mL Becherglas mit zwei Lagen Folie, und Autoklaven zu decken. </li><li> Bereiten Sie eine 28 Wunsch-Einheiten / ml Stammlösung von Liberase Blendzyme 3 in sterilem Wasser. Machen Sie 0,5 ml und bei -20 ° C. Tauwetter ein neues Aliquot vor jedem Einsatz. Die Lösung kann trübe aussehen nach dem Auftauen. Vortex die Lösung, bis es klar wird. </li><li> Warm up den Zellkulturmedien. </li></ol> 2. Tierische Probenvorbereitung Achtung: wilde Tiere können Krankheitserreger enthalten wie eine Tollwut-Virus. Achten Sie immer auf offene spitze oder scharfe Gegenstände. <ol><li> Euthanize das Tier und Ort der Karkasse bei 4 ° C. Es ist am besten auf die Karkasse sofort zu verwenden, aber wenn dies nicht praktikabel ist, wie wenn die Tiere in dem Gebiet sind, können die die Kadaver innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. Nach 24 Stunden Zellausbeute abnimmt. </li><li> Präparieren Sie die Tiere in den OP oder in der chemischen Kapuze (nicht in der Gewebekultur Kapuze). </li><li> Unterarm-Bereich ist eine praktische Website, um Hautproben sammeln, wie Achsel-Haut ist dünner, enthält weniger Fett und das Fell ist weniger dicht. Reinigen Sie die Inzisionsstelle mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, das Fell mit Ethanol getränkt wird. </li><li> Shave das Fell rund um die Inzisionsstelle mit einem scharfen Skalpell. Shave eine größere Fläche als die gewünschte Inzisionsstelle. Versuchen Sie, Schnitte an der Haut zu minimieren. Spray Bereich mit 70% Ethanol und trocknen lassen. </li><li> Zum Sammeln einer Hautprobe Verbrauchsteuern ein Fragment von ca. 1 cm 2. Drücken Sie die Haut mit dem Gewebe einer Pinzette und schneiden mit der Schere. Versuchen Sie nicht, die Fettschicht der Haut abgeschnitten, als Fett stört Kollagenaseverdau. Zum Sammeln der Lunge Proben, waschen Sie die Brust mit 70% Ethanol, und öffnen Sie die Haut auf der Brust mit einer Schere, indem sie eine T-Form Schnitt-und Auseinanderziehen der Klappen der Haut. Waschen Sie die geöffneten Muskel-Bereich mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Schneiden Sie den Brustkorb mit einer sterilen Pinzette und Schere (Verwendung Knochenfräser für größere Tiere). Verwenden Sie sterile Techniken zur Vermeidung einer Kontamination der inneren Organe. Berühren Sie nicht die inneren Organe mit Instrumenten, die das Tier Fell berührt. Cut Lunge Fragmente von etwa 1 cm 2 mit einer sterilen Pinzette und Schere. </li><li> Legen Sie Gewebestücke in 50 ml-Röhrchen mit sterilem PBS Austrocknen zu verhindern. </li><li> Waschen Sie die außerhalb der 50-ml-Tuben mit Gewebestücke mit Ethanol, und nehmen sie auf die Gewebekultur Kapuze. </li><li> Richtig tierischen Kadaver zu entsorgen. </li></ol> 3. Extrahieren Cells <ol><li> Übertragen Sie die Gewebestücke in einen 10 cm Gewebe Kulturschale mit sterilen Skalpell. Übertragen Sie keine zu viel PBS mit der Probe. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe in ~ 1 mm Stücke mit zwei Skalpelle. Verwenden Sie zwei Blätter mit einer Schere Aktion ab der Mitte und Auseinanderziehen. Halten Sie das Gewebe ballte, schneiden nicht Stück für Stück. Wenn das Schneiden genügt die Haut ähnelt Kitt, wird es nicht in Stücke getrennt, aber dehnt dünn. Das Lungengewebe ist leichter zu schneiden, und es wird in kleine Stücke zu trennen. </li><li> Mit einem Skalpell, Übertragung der Schnitt Gewebe in sterilen 30 ml-Becher mit sterilen Rührstab. Waschen Sie die Platte zum Schneiden von Gewebe mit 10 ml DMEM/F12 Medien mit 0,14 Wunsch Einheiten / ml Liberase Blendzyme 3 und 1X Antibiotikum / Antimykotikum verwendet, und fügen Sie die Lösung für die 30 ml-Becher mit Gewebeteilen. </li><li> Becher mit sterilen Folie, und bei 37 ° C unter ständigem Rühren langsam, für 30 bis 90 Minuten. Die Länge der Inkubationszeit hängt von der Art und Gewebe. Achten Sie darauf, nicht zu stark zu verdauen das Gewebe. Besten Ausbeuten werden erzielt, wenn Gewebestücke noch am Ende der Verdauung zu präsentieren. Haut braucht mehr Zeit als die Lunge zu verdauen. Haut vor großen Tieren dauert länger zu verdauen. Überprüfen Sie die Verdauung nach 30 min und dann alle 10 min. Wenn die Haut Verdauung abgeschlossen ist, wird das Medium trüb und Haut-Fragmente voneinander getrennt, und die Ränder der Stücke werden &quot;fuzzy&quot;. Lung Verdauung sollte gestoppt, wenn Lungen-Fragmente verändern ihre Farbe von rot nach weiß und starten Sie bilden klebrige Fasern. </li><li> Pipettieren der Lösung, die Gewebestücke nach oben und unten, um die Klumpen zu brechen. Die Lösung wird in sterile 50-ml-Tube. Wenn die Fragmente leicht durch die 10 mL Pipette Schneiden und Verdauung war gut gemacht. Spülen Sie das Becherglas 3 mal mit 10 ml warmes DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum und fügen Sie die Medien an die 50 ml Tube mit Gewebeteilen. Schließen Sie die 50 ml Tube und mischen durch Umdrehen ein paar mal. Die FBS in den Medien hört Liberase Verdauung. </li><li> Spin bei 524 g in einem Ausschwingrotor Gewebekultur Zentrifuge für 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in 10 ml warmes DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum. Pipettieren der Suspension mitmaximale Kraft auf das Gewebe Stücke brechen. </li><li> Fügen Sie ein weiteres 30 mL DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum, mischen und zentrifugieren bei 524 g in einem Ausschwingrotor Gewebekultur Zentrifuge für 5 min. Wiederholen Sie noch einmal auf die Spuren von Liberase entfernen. </li><li> Das Pellet in 10 ml DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum und in ein 10 cm Gewebe Kulturschale und in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2, 3% O 2 . </li><li> Prüfen Sie die Platten jeden Tag für Fibroblasten und Medien Farbe. Wenn die Isolierung erfolgreich war, kriechen Fibroblasten aus dem Gewebe Fragmente und heften sich an die Platte (Abbildung 1). Die Fibroblasten beginnen Gewebestücke innerhalb von 2-5 Tagen zu verlassen. </li><li> Wenn die Medien ändert sich die Farbe zu gelb, deutet dies auf eine mögliche Kontamination oder Überbelegung der Zellen. Untersuchen Sie die Platten unter dem Mikroskop bei starker Vergrößerung. Wenn Bakterien, Pilze oder Würmer vorhanden sind entsorgen Sie die Platten (das ist selten ein Problem mit Labortieren, aber kann auftreten, wenn die Proben aus der Natur gesammelt werden). Wenn keine Kontamination vorhanden ist, aber die Medien die Farbe gewechselt, ist dies entweder zu viele Zellen oder zu viele Gewebestücke in der gleichen Schale gelegt verursacht. Wenn mehr als 60% der Platte durch befestigt Fibroblasten bedeckt ist, ändern Sie die Medien auf der Platte und übertragen Sie die Gewebestücke auf eine neue Platte mit den neuen Medien. Wenn nicht viele Fibroblasten an der Platte befestigt, ändern Sie die Medien und spaltete die Gewebestücke zu einem 2-4 Platten. </li><li> Nach 7 Tagen, wenn Medien nicht schon früher geändert wurde, ändern Sie die Medien und den Transfer der Gewebestücke auf eine neue Platte mit neuen Medien. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen und Gewebe-Fragmente für weitere 7 Tage. Bis zum Tag 14 alle lebensfähigen Fibroblasten haben die Gewebestücke verlassen. </li><li> Nach 14 Tagen ab dem Beginn der Zell-Isolierung, entsorgen Sie die alten Medien und Gewebeteile, die Ernte der Zellen und die Platte sie auf eine neue Platte auf 5x10 5 Zellen / Platte EMEM mit 15% FBS, 1X Penicillin / Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren und Natriumpyruvat. EMEM Medien unterstützen das Wachstum von Fibroblasten nur und anderen Zelltypen sterben oder aufhören proliferierenden. </li><li> Nachdem die Zellen 80-90% Konfluenz erreicht, frieren ein Aliquot von Zellen für die zukünftige Verwendung. </li><li> Weiter Kultivierung der Zellen durch Teilung ihnen bei 5x10 5 Zellen / Platte, wenn die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Normalen Fibroblasten sind große Zellen mit prominenten Vorsprünge (Lamellipodien) (Abbildung 2). Fibroblasten wachsen in einer Monoschicht. Eine gesunde wachsenden Kultur bei 1-10% der Zellen in M-Stadium erkannt, da sich Zellen auf der Oberfläche der Platte erhöhten abgerundet, aber nicht von der Platte (Abbildung 3) abgelöst. Typischerweise wird eine 10 cm Schüssel mit 5x10 5 Zellen ausgesät konfluent in 3-4 Tagen. Die Verdoppelung der Zeit variiert stark zwischen den Arten und größer sein kann für einige der langlebigen Nagetierarten 1. Wenn die Zellen einen Teller sie verhaften Verbreitung in G1-Phase zu füllen. Typische konfluenten Platte von Fibroblasten enthält einen dicht gepackten Schicht von Zellen (Abbildung 4). Wenn die Zellen 90% Konfluenz erreichen sie bereit sind, für die Spaltung. Falls gewünscht, können die Zellen auf einem verhaftet konfluenten Platte für längere Zeit mit regelmäßigem Medienwechsel (ein-oder zweimal pro Woche) gehalten werden. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Fibroblast isoliert von der Haut von Mäusen (A) und der Lunge (B). Die Medien wurde geändert, um ungebundene Zellen und Trümmer zu entfernen, bevor unter den Bildern am Tag 7. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Maus Lungenfibroblasten. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ein Feld von Maus-Fibroblasten mit Zellen in M-Phase, bei 10-facher Vergrößerung fotografiert. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Eine konfluente Platte von Maus-Fibroblasten, bei 10-facher Vergrößerung fotografiert.

<ol>
	<li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+.">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li><li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li></ol>

Normale primären Fibroblasten bieten eine hervorragende Alternative zu den etablierten Zelllinien in der biologischen Forschung. Ein wichtiger Vorteil von Fibroblasten ist, dass sie nicht tragen Mutationen in Onkogenen und Tumor-Unterdrücker und pflegen intakten Zellzyklus-Kontrollpunkte. Dies macht normalen Fibroblasten eine bevorzugte System für das Studium der Regulation des Zellzyklus, DNA-Reparatur und Apoptose. Die hier beschriebene Protokoll bietet ein einfaches Rezept für die Isolierung und Wartung von prim?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM/F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>01437-036</td>
<td>The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15420-096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TM Research Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05401127001</td>
<td>Replacement enzyme.</td>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.</td>
<tr>
<td>EMEM media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-203</td>
<td>The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.</td>
</tr>
<tr>
<td>Feathered #21 disposable, sterile scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Multiple suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Three Gas Control incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Forma or Heraeus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

establishing primary adult fibroblast cultures from rodents

Die Bedeutung der Verwendung von primären Zellen, anstatt Krebszelllinien, für biologische Studien wird immer weithin anerkannt. Primäre Zellen sind in Studien der Kontrolle des Zellzyklus, Apoptose bevorzugt, und die DNA-Reparatur, wie Krebszellen Mutationen in Genen, die an diesen Prozessen beteiligt sind. Primäre Zellen kann nicht unbegrenzt durch das Einsetzen der replikativen Seneszenz oder aneuploidization kultiviert werden. Daher müssen neue Kulturen regelmäßig ermittelt werden. Das Verfahren zur Isolierung von Nagetier embryonalen Fibroblasten ist gut etabliert, aber isoliert Erwachsenen Fibroblastenkulturen oft eine Herausforderung. Adult Nagetier Fibroblasten aus Mausmodellen menschlicher Erkrankungen isoliert kann eine bevorzugte gesteuert werden, wenn man sie zu Fibroblasten aus menschlichen Patienten. Darüber hinaus sind erwachsene Fibroblasten die einzige verfügbare Material bei der Arbeit mit wilden Nagetieren, wo schwangere Frauen nicht leicht erhalten werden kann. Hier bieten wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von adulten Fibroblasten von Nagern Haut und Lunge. Wir haben dieses Verfahren erfolgreich an Fibroblasten aus über zwanzig Nagetieren isoliert vom Labor Mäusen und Ratten zu wilden Nagetieren wie Biber, Stachelschwein und Eichhörnchen.

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Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.

Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

49.1K Aufrufe.  University of Rochester. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.

Serie: Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Forschung

Biologie

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...