Мы благодарим д-р Стивен Austad за предоставление первой версии этого протокола. Эта работа была поддержана грантами NIH и Эллисон Медицинский фонд В. Г. и А. С.

1. Перед началом работы <ol><li> Стерилизовать ножницы и пинцет с 70% этанола. </li><li> Место малой магнитной мешалкой внутри 30 мл стакан, залить двумя слоями фольги, и автоклав. </li><li> Подготовка 28 Вунш ЕД / мл исходного раствора Liberase Blendzyme 3 в стерильной воде. Сделать 0,5 мл аликвоты и замораживают при температуре -20 ° C. Оттепель новых аликвоту перед каждым использованием. Решение может появиться облачно после размораживания. Vortex решение пока не станет ясно. </li><li> Разминка СМИ культуре клеток. </li></ol> 2. Подготовка животных Пример Внимание: дикие животные могут содержаться патогенные микроорганизмы, такие как вирус бешенства. Всегда быть в курсе открытых острых предметов. <ol><li> Усыпить животное и место каркаса при 4 ° C. Лучше всего использовать туши сразу же, однако, если это невозможно, таких как, если животные собираются в поле, туши может быть использован в течение 24 часов. После 24 часов снижается ячейки доходности. </li><li> Рассеките животное в хирургическом люкс или в капот химические (не в ткани капот культуры). </li><li> Подмышками область удобный сайт для сбора образцов кожи, как подмышки кожа тоньше, содержит меньше жира и меха менее плотной. Чистый разрез сайта с 70% этанола. Убедитесь, что мех пропитывается этанолом. </li><li> Бритье меха вокруг разреза с острым скальпелем. Бритье большую площадь, чем желаемый разреза. Постарайтесь свести к минимуму сокращения к коже. Спрей области с 70% этанола и дайте ему высохнуть. </li><li> Для сбора акцизного образец кожи фрагмент примерно на 1 см 2. Pinch кожи с тканью щипцы, и вырезать ножницами. Постарайтесь, чтобы не порезать жировой слой с кожи, а жир мешает коллагеназы пищеварения. Для сбора образцов легких, мыть области груди на 70% этанола, и открыть кожи на груди с помощью ножниц, сделав Т-образный разрез и потянув за исключением полы кожи. Вымойте открыл мышц области с 70% этанола и дайте высохнуть. Вырезать грудной клетки стерильные щипцы и ножницы (используйте кость фрезы для крупных животных). Используйте стерильные методы, чтобы избежать загрязнения внутренних органов. Не прикасайтесь к внутренним органам с инструментами, которые затрагивали шерсть животных. Вырезать легких фрагментов примерно 1 см 2, используя стерильные щипцы и ножницы. </li><li> Место фрагментов ткани в 50 мл стерильного труб с PBS, чтобы избежать высыхания. </li><li> Мойте за пределами 50 мл трубки с фрагментами тканей с этанолом, и взять их на капот культуры ткани. </li><li> Правильно распоряжаться туши животного. </li></ol> 3. Извлечение Клетки <ol><li> Передача фрагментов тканей в 10 см культуре ткани блюдо использованием стерильного скальпеля. Не передавайте слишком много PBS с образцом. </li><li> Вырезать ткани в ~ 1 мм части, используя два скальпеля. Используйте два лезвия использованием ножниц, начиная от центра и вытягивать друг от друга. Держите ткани сжатой вверх, не режут по частям. Когда резки достаточно кожи напоминает замазку, он не будет разделяться на куски, но будет растягиваться тонкий. Легочной ткани легче резать, и он будет разделиться на мелкие кусочки. </li><li> Использование скальпеля, передача вырезать ткань в стерильные 30 мл стакан с стерильных мешалкой. Промыть пластины используются для резки ткани с 10 мл DMEM/F12 СМИ с 0,14 единиц Вунш / мл Liberase Blendzyme 3 и 1X антибиотик / противогрибковым и добавить решение в стакан 30 мл с фрагментов тканей. </li><li> Обложка стакан с стерильную пленку, и инкубировать при 37 ° С, помешивая, в течение 30 до 90 минут. Длина инкубации зависит от типа и вида ткани. Будьте осторожны, не за-дайджест ткани. Лучшая урожайность достигается при фрагментов тканей по-прежнему присутствуют в конце пищеварения. Кожа занимает больше времени, чтобы переварить, чем легких. Кожа из крупных животных требуется больше времени, чтобы переварить. Проверьте пищеварения через 30 минут, а затем каждые 10 мин. Когда кожа пищеварения завершения СМИ мутнеет и кожицы отделены друг от друга, а по краям фигур становятся &quot;нечеткой&quot;. Легкое пищеварение должно быть прекращено, когда легкие фрагменты меняют цвет от красного до белого, и приступить к формированию липкие волокна. </li><li> Внесите раствор, содержащий фрагменты ткани вверх и вниз, разорвать сгустки. Перенесите раствор в стерильные 50 мл трубки. Если фрагменты легко перемещаться через 10 мл пипетки резки и пищеварение было сделано хорошо. Промыть стакан 3 раза по 10 мл теплой DMEM/F12 средств массовой информации с 15% FBS, 1X антибиотик / противогрибковым и добавить информации к 50 мл трубки с фрагментами тканей. Закрыть 50 мл трубки и смешать обращением несколько раз. FBS в СМИ остановится Liberase пищеварения. </li><li> Спиновые на 524 г в размахивая ведром культуре ткани центрифуги в течение 5 мин. Удалить супернатант. Ресуспендируют гранул в 10 мл теплой DMEM/F12 средств массовой информации с 15% FBS, 1X антибиотик / противогрибковым. Внесите подвеска смаксимальное усилие на разрыв ткани штук. </li><li> Добавьте еще 30 мл DMEM/F12 средств массовой информации с 15% FBS, 1X антибиотик / противогрибковым, перемешать и центрифуге при 524 г в размахивая ведром культуре ткани центрифуги в течение 5 мин. Повторите еще раз, чтобы удалить следы Liberase. </li><li> Ресуспендируют гранул в 10 мл DMEM/F12 средств массовой информации с 15% FBS, 1X антибиотик / противогрибковым и трансфер в 10 см ткани блюдо культуры и место в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2, 3% O 2 . </li><li> Проверьте пластины каждый день в течение фибробластов и СМИ цвета. Если изоляция была успешной, фибробласты выползать из фрагментов тканей и приложить к пластинке (рис. 1). Фибробласты начинают выхода фрагментов тканей в течение 2-5 дней. </li><li> Если цвет средства массовой информации изменения в желтый, это указывает на возможное загрязнение или переполненных клетках. Изучить плит под микроскопом при большом увеличении. Если бактерии, грибки, глисты или присутствуют отклонения пластин (это редко проблема с лабораторными животными, однако может возникнуть, когда образцы собираются от диких). Если нет загрязнение присутствует, но СМИ изменили цвет, это вызвано либо слишком много клеток, или слишком много фрагментов тканей, расположенных в одной тарелки. Если более 60% пластина покрыта прилагается фибробластов, изменение средств массовой информации на пластине и передачи фрагментов тканей с новой пластинки с новыми медиа. Если это не так много фибробластов прикреплены к пластине, изменение средств массовой информации и разделить ткани куски 2-4 пластины. </li><li> Через 7 дней, если средства массовой информации не были изменены ранее, изменение средств массовой информации и передачи фрагментов тканей с новой пластинкой с новыми средствами массовой информации. </li><li> Инкубируйте клетки и ткани фрагментов для дополнительных 7 дней. К 14-й день всех жизнеспособных фибробластов вышли из фрагментов тканей. </li><li> Через 14 дней от начала изолятор, отбросить старые средства массовой информации и фрагментов тканей, урожай клеток и пластины их на новую пластинку в 5х10 5 клеток / пластину EMEM с 15% FBS, 1X Пенициллин / стрептомицин, без незаменимых аминокислот и пирувата натрия. EMEM СМИ будут поддерживать рост фибробластов только и другие типы клеток умрет или остановки пролиферации. </li><li> После клетки достигает 80-90% слияния, заморозить аликвоту клеток для использования в будущем. </li><li> Продолжить культивирования клетки путем разделения их на 5х10 5 клеток / пластину, когда клетки достигают 80-90% слияния. </li></ol> 4. Представитель Результаты Нормальные фибробласты крупные клетки с крупными выступами (lamellipodia) (рис. 2). Фибробласты растут в монослой. Здоровый растущий культура содержит 1-10% в клетках этапе М, признан окружены клетками возвышается над поверхностью пластины, но не отделена от пластины (рис. 3). Как правило, 10 см блюдо с присадками 5х10 5 клеток становится вырожденной в течение 3-4 дней. Время удвоения сильно зависит от вида и может быть больше, для некоторых долгоживущих видов грызунов 1. Когда клетки заполняют пластину они арестовывают распространения в стадии G1. Типичные сливной пластины фибробластов содержит плотно слой клеток (рис. 4). Когда клетки достигают 90% слияния они готовы к расщеплению. При желании, клетки могут быть сохранены на арестованы сливной пластине в течение длительного периода времени с регулярными изменениями среды (один или два раза в неделю). <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Фибробластов мыши изоляции от кожи () и легких (B). СМИ была изменена, чтобы удалить одиноких клеток и мусора до принятия картины на 7 день. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Фибробластов мыши легких. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Области мышиных фибробластов, содержащих клетки в М-сцены, снятых в 10-кратным увеличением. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Сливной пластины фибробластов мыши, сфотографировали на 10-кратным увеличением.

<ol>
	<li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+.">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li><li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Нормальная первичных фибробластов обеспечивают прекрасную альтернативу установленном раковых клеток линий в биологических исследованиях. Важным преимуществом является то, что фибробласты, они не несут мутации онкогенов и опухолевых супрессоров и сохранить нетронутым контрольно-п?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM/F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>01437-036</td>
<td>The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15420-096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TM Research Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05401127001</td>
<td>Replacement enzyme.</td>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.</td>
<tr>
<td>EMEM media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-203</td>
<td>The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.</td>
</tr>
<tr>
<td>Feathered #21 disposable, sterile scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Multiple suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Three Gas Control incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Forma or Heraeus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

establishing primary adult fibroblast cultures from rodents

Важность использования первичных элементов, а не линии раковых клеток, для биологических исследований становится широкое признание. Первичные элементы являются предпочтительными при исследовании клеточного цикла управления, апоптоза и репарации ДНК, как раковые клетки нести мутации в генах, участвующих в этих процессах. Первичные элементы не могут быть культурными бесконечно из-за наступления старения репликативной или aneuploidization. Таким образом, новые культуры должны быть созданы на регулярной основе. Процедура выделения грызунов эмбриональных фибробластов хорошо известна, но изоляция взрослых культур фибробластов часто представляет проблему. Взрослых фибробластов грызунов изолированы от мышиных моделях болезни человека может быть предпочтительным контроль при сравнении их от человеческих фибробластов пациентов. Кроме того, взрослые фибробласты только материал при работе с дикими грызунами, где беременные самки не могут быть легко получены. Здесь мы предлагаем протокол для изоляции и культуры взрослых фибробластов из кожи грызунов и легких. Мы использовали эту процедуру успешно изолировать фибробластов из более чем двадцати видов грызунов от лабораторных мышей и крыс диких грызунов, таких как бобр, дикобраз, и белки.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents at JoVE.com

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

В этой статье описывается протокол для изоляции и обслуживание первичных культурах фибробластов из кожи и ткани легких диких грызунов.

Создание первичных культурах фибробластов взрослых от грызунов

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

49.0K Views.  University of Rochester. В этой статье описывается протокол для изоляции и обслуживание первичных культурах фибробластов из кожи и ткани легких диких грызунов.

Video: Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Первичные культуры нейронов из мозга дрозофилы поздней стадии куколки

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Первичная диссоциированных мозга Допамин клеточных культур от грызунов Новорожденные

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Первичные культуры взрослых Миоциты сердца крысы

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Первичных клеточных культур из Drosophila Гаструла Эмбрионы

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

Быстрое удаление фибробластов с высокой плотностью эмбриональных стволовых клеток культур

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Подготовка первичной Миогенный предшественников Cell / миобластов культур от базальной позвоночных линий

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

Применение ретиноевой кислотой получить остеоцитов культур из первичных мыши остеобластов

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Изоляция и культура кератиноцитов первичной мыши от кожи новорожденных и взрослых мышей

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...