Bu protokolün ilk sürümü ile bize sağlamak için Dr. Steven Austad teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve Ellison Tıp Vakfı VG hibe tarafından desteklenen ve AS

1. Başlamadan Önce <ol><li> % 70 etanol ile makas ve forseps sterilize edin. </li><li> 30 ml beher içindeki küçük manyetik karıştırıcı yerleştirin, iki folyo katmanlar ve otoklav ile kaplayın. </li><li> Steril su içinde 28 Wunsch Liberase Blendzyme 3 ünite / mL stok çözelti hazırlayın. -20 ° C&#39;de 0.5 mL alikotları ve donma yapın Her kullanımdan önce yeni bir kısım çözülme. Çözüm çözme sonrası bulanık görünebilir. Vorteksleyin çözüm açık hale gelinceye kadar. </li><li> Isınma hücre kültür ortamı. </li></ol> 2. Hayvan Numune Hazırlama Dikkat: vahşi hayvanların kuduz virüsü gibi böyle bir patojenler içerebilir. Her zaman açık kavuz farkında olun. <ol><li> Hayvan Euthanize ve 4 karkas ° C Ancak, hayvanların alanında toplanan sanki bu tür pratik değilse, hemen karkas kullanmak en iyisidir, karkaslar 24 saat içinde kullanılmalıdır. 24 saat sonra hücre verimi azalır. </li><li> (Doku kültürü kaputu), cerrahi süit ya da kimyasal kaputun içindeki hayvan teşrih. </li><li> Koltukaltı alan koltuk altı cilt daha ince olduğu gibi, daha az yağ içeren cilt örnekleri toplamak için uygun bir site ve kürk daha az yoğundur. % 70 etanol ile kesi yeri temizleyin. Kürk etanol ile ıslatılmış olduğundan emin olun. </li><li> Keskin bir bistüri ile kesi sitesi etrafında kürk Tıraş. Istenen kesi yeri daha büyük bir alan Tıraş. Cilt için kesintileri en aza indirmek için deneyin. % 70 etanol ile bölgede Sprey ve kurumaya bırakın. </li><li> Bir deri örneği tüketim yaklaşık 1 cm 2 bir parçasını toplamak için. Doku forseps ile cilt çimdik, ve makasla kesmek. Yağ kollajenaz sindirim müdahale gibi, deri ile yağ tabakası kesmek için deneyin. Akciğer örnekleri toplamak için, göğüs bölgesinde% 70 etanol ile yıkayın ve T şeklinde bir kesi yapmak ve cilt kapakları dışında çekerek makas ile göğüs cilt açmak. Açılan kas alanı% 70 etanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Steril forseps ve makas (büyük hayvanlar için kemik kesiciler kullanmak) kullanılarak göğüs kafesi kesin. Iç organları kirlenmesini önlemek için steril teknikler kullanın. Hayvan kürk dokundu araçların iç organları dokunmayın. Steril forseps ve makas kullanılarak yaklaşık 1 cm 2 akciğer parçaları kesin. </li><li> Yeri doku parçaları steril PBS ile 50 ml tüpler kurumasını önlemek için. </li><li> 50 ml tüpler dışında etanol ile doku parçaları ile yıkayın ve doku kültürü kaputu götürün. </li><li> Düzgün hayvan karkas atmayın. </li></ol> 3. Ayıklanıyor Hücreler <ol><li> Doku parçaları steril neşter kullanılarak 10 cm doku kültürü çanak içine aktarın. Örneği ile çok PBS transferi yapmayın. </li><li> Iki neşter kullanılarak ~ 1 mm adet doku kesin. Merkezinde başlayan ve çekme dışında bir makas eylemini kullanarak iki ucu kullanın. Parça parça kesmeyin, doku tıkıştırılmış tutun. Kesme cilt macun benzer yeterli olduğunda, parçalar halinde ayrı ama ince germek olacaktır. Akciğer doku kesmek için kolay ve küçük parçalar halinde ayrı olacaktır. </li><li> Bir neşter kullanarak, steril heyecan çubuğu ile kesilmiş doku steril 30 ml beher içine aktarın. Ile DMEM/F12 medya 10 ml / 0.14 Wunsch birimleri mL Liberase Blendzyme 3 ve 1X antimikotik / antibiyotik doku kesmek için kullanılan plaka yıkayın ve doku parçaları ile 30 ml beher çözüm ekleyin. </li><li> Steril folyo ile beher Kapak ve 37 ° inkübe ° C, yavaş yavaş karıştırarak, 30 ila 90 dakika. Inkübasyon süresini tür ve doku tipine bağlıdır. Doku üzerinde sindirmek için özen gösterin. Doku parçaları, sindirim sonunda hala mevcut zaman en iyi verimi elde edilir. Cilt, akciğer sindirimi daha uzun sürer. Büyük hayvanların Cilt sindirimi uzun sürer. 30 dakika sonra sindirim, ve sonra her 10 dakikada bir kontrol edin. Cilt sindirim işlemi tamamlandığında, medya bulutlu ve deri parçaları birbirinden ayrı olur ve parçaların kenarlarında &quot;bulanık&quot; hale gelir. Akciğer sindirim kırmızı beyaz ve yapışkan lifleri oluşmaya başlar ve akciğer parçaları renk değiştiren kesilmelidir. </li><li> Yığınları kırmak için ve doku parçaları aşağı yukarı içeren pipetleyin çözüm. Steril 50 ml tüp çözüm aktarın. Parçaları 10 ml pipet kesme ve sindirim yoluyla kolayca hareket yapıldı. 10 ml% 15 FBS, antimikotik / antibiyotik 1X sıcak DMEM/F12 medya beher 3 kez doku parçaları ile durulayın ve 50 ml tüp medya ekleyebilirsiniz. 50 mL tüp ve inversiyon bir kaç kez karıştırın kapatın. Medya FBS Liberase sindirim duracaktır. </li><li> 5 dakika için bir sallanan kova doku kültürü santrifüj 524 g dönerler. Süpernatantı. % 15 FBS, 1X antimikotik / antibiyotik ile 10 ml sıcak DMEM/F12 medya pelletini tekrar. Pipetleyin süspansiyon iledoku parçaları kırmak için maksimum kuvvet. </li><li> % 15 FBS, 1X, 5 dakika için bir sallanan kova doku kültürü santrifüj 524 g / antibiyotik antimikotik, mix ve santrifüj ile DMEM/F12 medya başka bir 30 ml ekleyin. Liberase izlerini kaldırmak için bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Ile DMEM/F12 medya 10 ml% 15 FBS pelletini tekrar 1X antimikotik / antibiyotik ve 37 doku kültürü inkübatör 10 cm doku kültürü çanak ve yeri ° C,% 5 CO 2 transfer% 3 O 2 . </li><li> Plakalar, fibroblastlar ve medya renk için her gün kontrol edin. Izolasyon başarılı olursa, fibroblastlar doku parçaları tarama ve plaka takmak (Şekil 1). Fibroblast, 2-5 gün içinde doku parçaları çıkmak için başlar. </li><li> Eğer medya sarı renk değiştirir, bu potansiyel kirlenme veya hücrelerin aşırı kalabalık gösterir. Mikroskop altında yüksek büyütmede plakaları inceleyin. , Bakteri, mantar veya solucan mevcut levhalar (Bu laboratuar hayvanları ile nadiren bir konudur, ancak doğadan toplanan numunelerin oluşabilir) iptal edilir. Hiçbir kirlenme mevcut, ancak medya renk değiştirdiyseniz, bu çok fazla hücre veya aynı tabak içinde yerleştirilen çok sayıda doku parçaları ya da neden olmaktadır. % 60 daha fazla plaka takılı fibroblastlar kapsadığı ise, plaka üzerinde ortamı değiştirmek ve yeni medya ile yeni bir plaka doku parçaları aktarmak. Pek çok fibroblastlar plaka bağlı, medya değiştirmek ve 2-4 tabak doku parçaları bölmek. </li><li> 7 gün sonra, medyada daha önce değiştirilmiş olsaydı, medya değiştirmek ve yeni medya ile yeni bir plaka doku parçaları aktarmak. </li><li> Hücre ve doku parçaları, ek bir 7 gün süreyle inkübe edin. 14 gün yaşayabilir fibroblastlar doku parçaları çıkmış durumdayız. </li><li> Hücre izolasyonu başından itibaren 14 gün sonra, eski ortam ve doku parçaları atmak% 15 FBS, 1X Penisilin / Streptomisin, non-esansiyel amino asitleri ile yeni bir plaka üzerinde 5x10 5 hücre / plaka EMEM hücreleri ve plaka onları hasat ve sodyum piruvat. EMEM medya tek ve diğer hücre türleri ölmeye veya prolifere duracaktır fibroblastların büyümeyi desteklemek. </li><li> Hücreleri% 80-90 izdiham ulaştıktan sonra, bir kısım hücreler gelecekte kullanmak üzere dondurun. </li><li> 5x10 5 hücre / plaka bölme onları kültür hücreleri hücrelerinin% 80-90 izdiham ulaştığınızda devam edin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Normal fibroblastlar belirgin çıkıntılar (lamellipodia) (Şekil 2) ile büyük hücrelerdir. Fibroblastlar bir tek tabaka büyür. Sağlıklı büyüyen kültür, plaka yüzey üzerinde yüksek hücreleri yuvarlak, ama plaka (Şekil 3) müstakil tanınan M aşamasında% 1-10 hücreleri, içerir. Tipik olarak, 5x10 5 hücre numaralı seribaşı 10 cm çanak, 3-4 gün içinde konfluent olur . Iki katına zaman türler arasında büyük ölçüde değişir ve bazı uzun ömürlü kemirgen türleri 1 için daha büyük olabilir. Hücrelerin çoğalması G1 aşamasında tutuklama bir tabak doldurduğunuzda. Fibroblastlar Tipik konfluent plaka hücreleri (Şekil 4) sıkışık bir tabaka içerir. Hücrelerin% 90 izdiham ulaştığınızda yarma için hazır. İsterseniz, hücrelerin düzenli medya değişiklikleri (bir veya iki kez bir hafta) ile uzun süre için tutuklandı konfluent bir plaka üzerinde muhafaza edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Günlük 7 fotoğraf çekmek için önce unattached hücreleri ve enkaz kaldırmak için fare deri (A) ve akciğer (B) Fibroblast izolasyon medya değiştirildi. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Fare akciğer fibroblastlar. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. 10X büyütme fotoğrafı fare fibroblastların M-aşamada hücre içeren bir alan. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. 10X büyütmede fotoğraflandı fare fibroblastlar konfluent plaka.

<ol>
	<li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+.">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li><li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li></ol>

Normal birincil fibroblastlar, biyolojik araştırmalar yılında kurulan kanser hücre hatları için mükemmel bir alternatif sağlar. Fibroblastların önemli bir avantajı, onkogenler ve tümör bastırıcılarının mutasyonlar taşımak ve sağlam hücre döngüsü kontrol noktaları korumak olduğunu. Bu normal fibroblastlar, hücre döngüsü kontrolü, DNA onarımı ve apoptozis çalışmaları için tercih edilen bir sistem yapar. Burada açıklanan protokol birincil fibroblastlar izolasyon ve bakımı için b...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM/F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>01437-036</td>
<td>The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15420-096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TM Research Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05401127001</td>
<td>Replacement enzyme.</td>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.</td>
<tr>
<td>EMEM media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-203</td>
<td>The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.</td>
</tr>
<tr>
<td>Feathered #21 disposable, sterile scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Multiple suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Three Gas Control incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Forma or Heraeus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

establishing primary adult fibroblast cultures from rodents

Biyolojik çalışmalar için, birincil hücreler, kanser hücre hatları yerine kullanmanın önemi, yaygın olarak kabul haline geliyor. Birincil hücreler, hücre döngüsü kontrolü, apoptozis çalışmaları tercih ve DNA onarımı, kanser hücreleri, bu süreçlere dahil genlerindeki mutasyonlar taşıyan. İlköğretim hücreleri süresiz replikatif yaşlanması veya aneuploidization başlangıcı nedeniyle kültür olamaz. Bu nedenle, yeni kültürler, düzenli bir şekilde kurulması gerekmektedir. Kemirgen embriyonik fibroblastlar izolasyonu için prosedür iyi kurulmuş, ama çoğu zaman bir meydan okuma sunuyor yetişkin fibroblast kültürlerinde izole eder. Insan hastalığı fare modelleri izole Yetişkin kemirgen fibroblastlar, insan hasta fibroblastlar karşılaştırarak tercih edilen bir kontrol olabilir. Ayrıca, hamile kadın kolayca elde edilemez yabani kemirgenler ile çalışırken yetişkin fibroblastlar sadece kullanılabilir bir malzeme. Burada kemirgen cilt ve akciğerlerden yetişkin fibroblastlar izolasyonu ve kültürü için bir protokol sağlar. Bu yordamı Biz yirmi kemirgen türleri üzerinde laboratuvarda fareler ve sıçanlar, kunduz, kirpi, sincap gibi yabani kemirgenler fibroblastlar izole etmek için başarıyla kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents at JoVE.com

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Bu makalede, izolasyon ve bakım, cilt ve akciğer dokusunda yaban kemirgenler birincil fibroblast kültürlerinin için bir protokol tanımlamaktadır.

Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

49.1K Görüntüleme.  University of Rochester. Bu makalede, izolasyon ve bakım, cilt ve akciğer dokusunda yaban kemirgenler birincil fibroblast kültürlerinin için bir protokol tanımlamaktadır.

Video: Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Biyoloji

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...