우리는이 프로토콜의 첫 번째 버전으로 우리를 제공할 박사 스티븐 Austad 감사합니다. 이 작품은 NIH와 엘리슨 의료 재단에서 VG에 부여하여 이름으로 지원했습니다

1. 시작하기 전에 <ol><li> 70 % 에탄올과 가위와 집게를 소독. </li><li> 30 ML의 비커 내부에 작은 자기 활동가를 놓고 두 호일의 레이어, 그리고 압력솥로 커버. </li><li> 멸균 물 속에 28 Wunsch 단위 / Liberase Blendzyme 3 ML 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C.에서 0.5 ML aliquots 및 동결 만들기 모든 사용하기 전에 새로운 나누어지는를 녹여. 이 솔루션은 해동 후 흐림 나타날 수 있습니다. 소용돌이 솔루션을 분명히 될 때까지. </li><li> 세포 배양 미디어를 따뜻하게. </li></ol> 2. 동물 샘플 준비 주의 : 야생 동물은 광견병 바이러스로 병원균을 포함할 수 있습니다. 항상 열려있는 샵스 인식합니다. <ol><li> 동물을 안락사 4에서 시체를 배치 ° C. 동물이 분야에서 수집하는 경우로이 같은 실용적하지 않은 경우 그것은 그러나, 바로 시체를 사용하는 것이 가장 좋습니다, 시체는 24 시간 이내에 사용할 수 있습니다. 24시간 세포 항복 거부 후. </li><li> (하지 조직 문화 후드에서) 수술 스위트 또는 화학 후드에있는 동물을 해부하다. </li><li> 암내 지역 암내의 피부가 얇은이므로, 적은 지방이 포함되어 피부 샘플을 수집하는 편리한 사이트이며 털이 덜 조밀한입니다. 70 % 에탄올로 절개 사이트를 청소하십시오. 모피는 에탄올로 적셔 있는지 확인하십시오. </li><li> 날카로운 메스로 절개 사이트 주변의 털이 면도. 원하는 절개 사이트보다 큰 영역을 쉐이브. 피부에 상처를 최소화하기 위해보십시오. 70 % 에탄올로 영역을 스프레이하고 건조하게. </li><li> 피부 샘플 소비세에게 약 1cm 2 조각을 수집합니다. 티슈 포셉로 피부를 꼬집어하고, 가위로 잘라. 지방 collagenase의 소화 방해로, 피부와 지방 레이어를 잘라하지보십시오. 폐 샘플을 수집하기 위해 70 %의 에탄올과 가슴 지역을 세척하고, T - 모양 절개하고 피부의 펄럭를 따로 당기는하여 가위로 가슴에 피부를 엽니다. 70 % 에탄올로 열린 근육 영역을 씻고 건조하게. 무균 집게와 가위 (큰 동물 뼈 절단기를 사용)를 사용하여 갈빗대 컷. 내장 오염을 막기 위해 살균 기술을 사용합니다. 동물 모피를 건드리지 악기와 내부 장기를 만지지 마십시오. 무균 집게와 가위를 사용하여 약 1cm 2의 폐 조각을 잘라 버릴거야. </li><li> 플레이스 조직 조각 멸균 PBS로 50 ML 튜브에 건조하지 않도록합니다. </li><li> 에탄올과 조직의 파편 50 ML 튜브의 외부를 세척하고, 조직 문화 후드에게 가져가라. </li><li> 제대로 동물 시체 처리. </li></ol> 3. 추출 셀 <ol><li> 멸균 메스를 사용하여 10cm의 조직 문화 요리에 조직 조각을 전송합니다. 샘플과 너무 PBS를 전송하지 마십시오. </li><li> 이 scalpels를 사용하여 ~ 1mm의 조각으로 조직을 잘라. 중심부에서 시작 떨어져 당기는 가위 작업을 사용하여 두 날개를 사용하십시오. 조직이 하나 하나를 풀어 보는 게 어때, 잘 고사리 유지. 절단은 피부가 퍼티 유사 충분하면 조각으로 분리되지 않습니다하지만 얇은 스트레치합니다. 폐 조직자를 쉽게이며, 그것은 작은 조각으로 분리됩니다. </li><li> 메스를 사용하여 멸균 저어 바와 무균 30 ML의 비커에 자른 조직을 전송할 수 있습니다. / 0.14 Wunsch 단위 ML Liberase Blendzyme 3, 1X antimycotic / 항생제와 DMEM/F12 미디어 10 ML과 조직을 절단에 사용되는 접시를 씻어하고, 조직의 파편 30 ML의 비커에 솔루션을 추가합니다. </li><li> 무균 호일로 비커를 커버하고, 37 품어 ° C, 천천히 저어, 30-90분하십시오. 부화의 길이는 종 및 조직 유형에 따라 다릅니다. 조직을 덮어 소화 안됩니다. 조직 조각은 소화의 끝에 아직도 존재하는 때 최고의 수익률을 얻을 수 있습니다. 피부는 폐보다 소화 오래 걸립니다. 큰 동물의 피부는 소화 오래 걸립니다. 30 분 후 소화하고 매 10 분 확인합니다. 피부 소화가 완료되면 미디어가 흐리고 서로 별도로 피부 조각되고, 조각의 가장자리는 &quot;퍼지&quot;됩니다. 때 적색에서 흰색과 끈적끈적한 섬유 형성 시작 폐 조각 변경 색상 폐 소화가 중지되어야합니다. </li><li> 대단히 짧은 시간을 휴식하고를 조직 조각을 아래로 포함 Pipet 솔루션입니다. 무균 50 ML 관에 대한 해결책을 전송합니다. 조각은 10 ML의 피펫 절단 및 소화를 통해 쉽게 이동하면 잘 이루어졌다. 15% FBS, antimycotic / 항생제 1X와 함께 따뜻한 DMEM/F12 미디어 10 ML있는 비커에게 3 번 씻어 조직의 파편 50 ML 튜브에 미디어를 추가합니다. 50 ML 튜브와 역전 몇 배 혼합을 닫습니다. 미디어 FBS는 Liberase 소화를 중지합니다. </li><li> 5 분 스윙 버킷 조직 문화 원심 분리기에서 524g에 스핀. 뜨는을 제거합니다. 15% FBS, 1X antimycotic / 항생제와 함께 따뜻한 DMEM/F12 미디어 10 ML에서 펠렛을 Resuspend. Pipet 정지와 함께조직 조각을 깰 최대 힘. </li><li> 15% FBS, 1X 5 분 스윙 버킷 조직 문화 원심 분리기에서 524g에 antimycotic / 항생제, 혼합과 원심 분리기와 DMEM/F12 미디어의 다른 30 ​​ML을 추가합니다. Liberase의 흔적을 제거하는 한 더 많은 시간을 반복합니다. </li><li> 15% FBS와 DMEM/F12 미디어 10 ML에서 펠렛을 Resuspend, 1X antimycotic / 항생제 37에서 조직 문화 인큐베이터에서 10cm 조직 문화 요리와 장소 ° C 5 % CO 2로 전송 3퍼센트 O 2 . </li><li> 접시 섬유아 세포 및 미디어 색상 매일 확인합니다. 격리가 성공했다면, 섬유아 세포는 조직 조각에서 크롤 링 플레이트 (그림 1)에 첨부합니다. fibroblast은 2-5 일 이내에 조직 조각을 종료 시작합니다. </li><li> 노란색으로 미디어의 변화 색면, 이것은 잠재적인 오염이나 세포의 인구 과잉을 나타냅니다. 높은 배율의 현미경으로 번호판을 검사합니다. 박테리아, 곰팡이, 또는 웜 현재 번호판을 (이것은 거의 실험실 동물에 문제가 없다, 그러나 샘플이 야생에서 수집한 경우 발생할 수 있습니다) 폐기하는 경우. 더 오염이 존재 없지만, 미디어가 색상을 변경하는 경우, 이것은 너무 많은 세포 또는 같은 접시에 배치 너무 많은 조직 파편에 의해 발생합니다. 접시의 60 % 이상이 첨부 섬유아 세포에 의해 덮여있는 경우, 접시에있는 미디어를 변경하고 새로운 미디어가있는 새 접시에 조직 조각을 전송할 수 있습니다. 아니 많은 섬유아 세포가 판에 부착된 경우, 미디어를 변경하고 2-4 접시에 조직 조각을 분할. </li><li> 미디어 이전 변경되지 않았다면 7 일 후, 미디어를 변경하고 새로운 미디어가있는 새 접시에 조직 조각을 전송할 수 있습니다. </li><li> 추가 7 일 동안 세포와 조직 조각을 품어. 일 14 모두 가능한 섬유아 세포는 조직 조각을 종료합니다. </li><li> 세포 격리의 시작 부분부터 14 일 후, 기존의 미디어 조직 조각을 폐기 15% FBS, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신이 아닌 필수 아미노산과 5x10 5 셀 / 플레이트 EMEM에서 새 접시에 세포와 플레이트를 수확 그리고 나트륨 pyruvate 있습니다. EMEM 미디어는 다른 세포 유형을 죽게하거나 proliferating 중지합니다 섬유아 세포의 성장을 지원합니다. </li><li> 세포 80~90%의 합류에 도달 후, 나중에 사용할 세포의 나누어지는을 동결. </li><li> 세포 80~90%의 합류에 도달했을 때 5x10 5 셀 / 슬라이딩 분할 그들에 의해 culturing 세포를 계속합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 정상 섬유아 세포가 유명 라고나할까요 (lamellipodia) (그림 2) 대형 세포 수 있습니다. 섬유아 세포는 monolayer 성장. 건강한 성장 문화는 접시의 표면을 통해 강화된 세포를 반올림하지만 플레이트 (그림 3)에서 분리하지 인정 M 단계에서 10-10% 세포를 포함하고 있습니다. 일반적으로 5x10 5 세포와 씨앗 10cm 요리 3-4 일 이내에 합류된다. 복제 시간은 종 사이에 크게 차이, 그리고 긴 쥐 종 1 일부 큰 수 있습니다. 세포들이 G1 단계에서 증식을 체포 접시를 채울 때. 섬유아 세포의 전형적인 합류 플레이트는 세포 (그림 4)의 단단히 포장 레이어를 포함하고 있습니다. 세포가 90 % 합류에 도달하면 그들은 분리를위한 준비가되어 있습니다. 원하는 경우, 전지가 일반 매체의 변화 (한 일주일에 두 번)와 오랜 기간 동안 체포 합류 접시에 유지하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 마우스 피부 (A)와 폐 (B)에서 Fibroblast 절연. 미디어 데이 7 사진을 찍을하기 전에 무소속 세포와 이물질을 제거하기 위해 변경되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 마우스 폐 섬유아 세포. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 10X 확대 사진 M - 단계에서 세포를 포함하는 마우스 섬유아 세포의 분야. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 10X 확대 사진 마우스 섬유아 세포의 합류 접시.

<ol>
	<li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+.">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li><li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

일반 기본 섬유아 세포 생물 학적 연구에 설립 암 세포 라인에 대한 훌륭한 대안을 제공합니다. 섬유아 세포의 중요한 이점은 그들이 oncogenes 및 종양 진압에 변이를 수행하고 그대로 세포주기 검문소를 유지하지 않는 것이있다. 이것은 정상적인 섬유아 세포 세포주기 조절, DNA 수리 및 apoptosis의 연구 선호하는 시스템이 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 절연 및 기본 섬유아 세포의 유지 보?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM/F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>01437-036</td>
<td>The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15420-096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TM Research Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05401127001</td>
<td>Replacement enzyme.</td>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.</td>
<tr>
<td>EMEM media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-203</td>
<td>The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.</td>
</tr>
<tr>
<td>Feathered #21 disposable, sterile scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Multiple suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Three Gas Control incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Forma or Heraeus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

establishing primary adult fibroblast cultures from rodents

생물 학적 연구, 기본 세포보다는 암 세포 라인을 사용하는의 중요성이 널리 인식되고 있습니다. 차 전지는 세포주기 조절, apoptosis 연구에서 선호하고, DNA의 수리, 암 세포는이 과정에 관련된 유전자에 돌연변이 들고와 같습니다. 차 전지는 무기한 replicative의 노화 또는 aneuploidization의 발병으로 인해 양식 수 없습니다. 따라서, 새로운 문화 정기적으로 설립해야합니다. 쥐 배아 섬유아 세포의 격리에 대한 절차는 잘 구축지만, 종종 도전을 선물 성인 fibroblast 문화를 격리합니다. 인간의 환자에서 섬유아 세포에 비교하면 인간의 질병의 마우스 모델에서 절연 성인 쥐 섬유아 세포가 원하는 컨트롤 수 있습니다. 임신 여성은 쉽게 얻을 수없는 야생 설치류 작업을 할 때뿐만 아니라, 성인 섬유아 세포는 물질에만 사용할 수 있습니다. 여기 쥐 피부와 폐 섬유아 세포에서 성인의 격리와 문화 프로토콜을 제공합니다. 우리는 실험실 마우스 및 쥐에서 같은 비버, 고슴도치, 다람쥐와 같은 야생 및 설치류에 스무 쥐여 종의에서 섬유아 세포를 분리하기 위해 성공적으로이 절차를 사용합니다.

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Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

이 문서는 고립과 야생 설치류 동물의 피부와 폐 조직에서 기본 fibroblast 문화의 유지 관리를위한 프로토콜을 설명합니다.

설치류에서 기본 성인 Fibroblast 문화를 구축

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

49.2K 조회수.  University of Rochester. 이 문서는 고립과 야생 설치류 동물의 피부와 폐 조직에서 기본 fibroblast 문화의 유지 관리를위한 프로토콜을 설명합니다.

비디오: Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

연구

생물학

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

기본 마우스 조골 세포에서 골 세포 배양을 구하는 레티노 산의 적용

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...