Este trabalho foi realizado no laboratório de Richard M. Schultz &#39;s. Os autores gostariam também de agradecer Michael Lampson para conceituar o ensaio centrômero-contagem e acesso ao seu microscópio confocal. Teresa Chiang e Francesca Duncan ajudou a otimizar o ensaio centrômero da contagem. Paula Stein é apoiada por HD022681 (para RMS) e Karen Schindler é apoiada por HD055822.

1. Coleta de oócitos do mouse <ol><li> Para maximizar o número de folículos antrais isolados de cada rato, por via intraperitoneal injetar camundongos fêmeas sexualmente maduros (usamos seis semanas de idade CF-1 ratos de Harlan), com 5 UI de égua grávida gonadotrofina sérica (PMSG). </li><li> Prepare o meio de coleta (MEM / PVP) (3 ml / rato), adicionando milrinona para 2,5 mM e aqueça-a 37 ° C. A milrinona é um inibidor da fosfodiesterase que mantém parada meiótica vez ovócitos são retirados os folículos. Alternativamente, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (0,2 mM) ou dibutyryl-monofosfato cíclico de adenosina (dbcAMP) (100 mg / ml) podem ser usados. Preparar o meio de cultura pela adição de glutamina (1 mM) e milrinona (2,5 mM) para 1 ml de CZB e permitir que ele atinja o equilíbrio na incubadora por pelo menos uma hora. Configure o microgotas de cada um em uma placa de Petri e sobreposição com óleo mineral. O prato CZB é colocado na incubadora, enquanto o prato MEM / PVP permanece fora de um aquecedor de slides. Outra coleção e meio de cultura que estão comercialmente disponíveis (M2 e M16 da Especialidade de mídia ou Sigma) também são usados ​​rotineiramente. </li><li> Aproximadamente 48 horas após PMSG priming, sacrificar o mouse usando CO 2 sedação seguido por deslocamento cervical, dissecar os ovários e colocá-los em um vidro de relógio contendo pré-aquecido MEM / PVP + milrinona (MEM / PVP + M). </li><li> Usando uma seringa de insulina 1 ml, âncora dos ovários para o prato e liberar os folículos antrais por punção-los várias vezes com calibre 27 (ou costura) agulhas que são mantidas juntas. </li><li> Ao olhar através de um microscópio de dissecação, recolher complexos cumulus-oócitos utilizando uma boca-operado pipeta de vidro. É útil ter um microscópio com muito contraste. Como alternativa, o meio contendo o tecido e as células podem ser pipetados em uma tampa de uma placa de Petri de plástico. Apenas coletar grandes folículos antrais pequenos e não pré-antral folículos ou oócitos desnudados. Depois de coletados, os complexos de transferência para um microdrop de M + MEM / PVP que está no slide e mais quente sob óleo. </li><li> Com uma pipeta pequeno (pouco maior que o diâmetro do ovócito), pipeta cima e para baixo os complexos de separar as células cumulus. Transferir os oócitos desnudados com maior pipeta em um microdrop de CZB + milrinona (CZB + M) e coloque na incubadora. </li><li> Permitir a recuperação de oócitos por pelo menos 1 h na incubadora antes de manipulação. </li></ol> 2. Microinjeção de oócitos <ol><li> Faça pipetas de injeção puxando de vidro de borosilicato tubo capilar em um extrator mecânico. Nós usamos um Flaming-Brown micropipeta extrator (Modelo P-97) com as seguintes configurações: P = 500, Calor = 300, Pull = 150, Vel = 100 Time, = 150. </li><li> Prepare a plataforma microinjeção colocando uma queda de 5 mL de M + MEM / PVP o mais próximo possível de uma queda de 0,5 mL de material de injecção de escolha (por exemplo, siRNA, cRNA, oligonucleotídeo morfolino, etc) em um slide-câmara de um bem que tem a câmara de mídia removido. Cubra com óleo mineral e lugar no palco microscópio (Fig. 1). </li><li> Injeção local e pipetas holding para a titulares e posição para a queda de M. + MEM / PVP Ligue os tanques de nitrogênio, que estão ligados à picoinjector e anti-vibração mesa. Abra a ponta da pipeta de injeção batendo-o contra a pipeta holding, enquanto enchendo-o com o meio. Se a abertura é muito grande, o meio vai entrar e sair rapidamente ea agulha irá matar a célula. Pipetas com muito pequeno de uma abertura, muitas vezes entopem com facilidade. </li><li> Ovócitos transferência (10/05) da incubadora para o MEM / M + PVP queda na plataforma. Antes de injetar, configurar o picoinjector. Usamos os seguintes parâmetros na nossa picoinjector (Modelo PLI-100 em Harvard Apparatus): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi tempo, = 3s. Isso resulta em um volume de injeção do PL 10/05. </li><li> Enquanto pressiona CLEAR, mover a agulha de injeção para a queda de material e de preenchimento. Devolvê-lo à queda média. </li><li> Use a pipeta holding para capturar um óvulo e alinhar a agulha de injeção, de oócitos e pipeta holding ao longo do eixo-x. </li><li> Sob maior ampliação, o avanço da pipeta de injeção através do óvulo com o cuidado de evitar o núcleo. Uma vez que a membrana plasmática é perfurada, pressione INJECT. Após a injeção, retire a agulha. Liberação do ovócito e repita. Uma vez que todos os ovócitos são injetados, devolvê-los à incubadora. Manter em CZB + M para quantidade desejada de tempo, desta vez é dependente do objetivo experimental (siRNA ie e knockdown morfolino (até 24 h), a superexpressão (3-12 h)). Por favor note que as incubações mais de 24 h irá comprometer a maturação meiótica. </li></ol> 3. Maturação de oócitos <ol><li> Após a incubação, lavar os oócitos através de várias gotas de CZB (meio de maturação) e transferir para um microdrop de meio de maturação sob óleo e coloque na incubadora. </li><li> 16 h para permitir t maturação completa<html> o metáfase da meiose II. </li></ol> 4. Análise de ploidia <ol><li> Prepare CZB monastrol + (100 mM) e coloque 750 mL no poço de uma placa de cultura órgão que tem água no anel externo. </li><li> Lavar os ovos através de várias gotas de CZB + monastrol e transferi-los para a placa de cultura de órgãos. Lugar na incubadora por 1 h. </li><li> Corrigir os ovos, transferindo-os em um vidro de relógio contendo paraformaldeído 2% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Transferência para outro vidro de relógio com solução de bloqueio. Este prato pode ser armazenado a 4 ° C até ser transformado. </li><li> Transferência para solução de permeabilização (PBS + 0,3% BSA + tritonX-100 0,1% + 0,02% NaN 3) em um vidro de relógio por 15 minutos em temperatura ambiente. Enxágüe através de vários grandes volumes de solução de bloqueio (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> O resto do procedimento é realizado na tampa de uma placa de 96 poços em câmara úmida à temperatura ambiente, que é protegido da luz. As gotas (~ mL 25) são colocados dentro do recortes circulares. Transferência de ovos para solução de bloqueio por 15 minutos. </li><li> Para centrômeros rótulo, ovos transferência para uma gota de solução de bloqueio contendo CREST anti-soro a 1:40. Incubar por pelo menos 1 h. Lave a 3 gotas de solução de bloqueio, incubação de 15 minutos em cada. </li><li> Transferência de ovos para uma gota de solução de bloqueio contendo Cy5 ou Alexa-fluor-594-conjugado anti-IgG humana (1:200) e incubar por 1 hora. Repita os passos de lavagem como acima, exceto para o último passo, incluem Sytox Green (1:5.000) na solução de bloqueio para detectar cromossomos. Montar em 5 mL de Vectashield. Para evitar esmagamento dos ovos, colocar 4 pequenas manchas de geléia de petróleo nos cantos do local onde a lamela será. Coloque uma lamela em cima e feche com unha polonês. Armazenar em uma caixa de lâminas a 4 ° C até o processamento através de microscopia confocal. </li><li> Enquanto imagem com um objetivo 100X, captura 0,4 mM passos no Z-plano e imagem de toda a região do eixo metáfase. Contar centrômeros usando software de imagem, como Image J (NIH). </li></ol> 5. Resultados representativos: Figura 2 é uma projeção Z-a partir de um ovo euplóide. Na metáfase da MII, os ovos do mouse euplóide contêm 20 pares de cromossomos e, portanto, tem 40 centrômeros. Ocasionalmente, os cromossomos não se espalhado, apesar do tratamento monastrol. Esta situação torna difícil a contagem confiável centrômeros e, portanto, não incluem estes ovos em nossas análises. Ocasionalmente, pode ser um desafio para determinar se um CREST-imunorreativa &quot;spot&quot; é 1 ou 2 centrômeros. Usando programas como o Image J é útil porque pode-se analisar cada Z-seção, enquanto cuidadosamente observando a orientação dos cromossomos, o número de seções em que um &quot;spot&quot; é detectado ea intensidade de pixels de &quot;spots&quot; tem. Dependendo de onde o fuso meiótico é posicionado em relação ao corpo polar, as regiões do DNA podem se sobrepor e estas amostras não devem ser incluídos na análise. Manipulação, in vivo ovularam ovos de ratos jovens reprodutivamente têm baixas taxas de aneuploidia (~ 1-2%). No entanto, por razões não compreendidas microinjeção, e nos procedimentos de maturação in vitro pode aumentar essa taxa para cima de 10%. Portanto, é fundamental que oócitos injetados são incluídos em qualquer estudo microinjeção. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Prato microinjeção configurar. Um slide de câmara com 5 gotas mL de MEM / PVP + M cai logo acima 0.5μl de solução injectável. Cubra com óleo mineral. Neste exemplo, existem 3 gotas por 3 soluções diferentes de injeção eo slide está sentado no palco de um microscópio. À esquerda é a agulha microinjeção e para a direita é a pipeta holding. Observe que há um reflexo do porta-agulhas. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Resultados ploidia. A Z-projeção de um ovo euplóide II metáfase. DNA é colorida em verde e cinetócoros são coloridos em vermelho. As setas apontam para duas distintas braços cromátides indicando que cinetócoros (# 17 e # 18) se sobrepõem. Ovos do mouse euplóide contêm 20 pares cinetocoro (40 total &quot;spots&quot;). Um ovo aneuplóides conteria qualquer variação neste número. Se este procedimento foram realizados em oócitos metáfase MI, haveria 40 pares cinetocoro (80 total &quot;spots&quot;). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabela 1"/> Tabela 1. Receita para o meio de coleta e microinjeção (MEM / PVP + M). Todos os materiais são de cultura do embrião-grade e da Sigma-Aldrich. Filtro de esterilizar através 0.22μm filtros PVDF (usamos Stericups Milipore) e armazenar a 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg &quot;alt =&quot; Tabela 2 &quot;/&gt; Tabela 2. Receita para o meio CZB. Todos os materiais são de cultura do embrião-grade e da Sigma-Aldrich. Filtro de esterilizar através 0.22μm filtros PVDF (usamos Stericups Milipore) e armazenar a 4 ° C.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Microinjeção de ovócitos é um método poderoso para estudar mecanismos que regulam a maturação meiótica 10,11, 12, 13. Este método oferece um modo econômico para testar hipóteses antes de fazer um grande investimento no desenvolvimento de modelos de ratos transgênicos e orientada. Coleta de oócitos e técnicas de microinjeção exigem mais tempo para dominar do que os procedimentos típicos de biologia celular. Obstáculos específicos com a coleta de vezes incluem controlar a pipeta na boca, puxando a pipeta de vidro tamanho adequado para a coleta e remoção das células somáticas e aumentando a velocidade de coleta para minimizar o tempo em que os oócitos estão fora da incubadora. Recomendamos a prática muitas vezes antes de fazer experimentos. Transferência entre oócitos microgotas, mantendo o mesmo número de células é uma ótima maneira de tornar-se confortável com este método. A morte celular ocorre comumente enquanto aprende microinjeção. Isso poderia ocorrer por uma série de razões, incluindo a injecção de demasiado grande de um volume de material (ou seja, a abertura de agulha é muito grande), atingindo o núcleo com a agulha de injeção, piercing no lado oposto do oócito ou que o material injetado é tóxico para o ovócito. Praticando com injeção de tampão em oócitos até a sua taxa de sobrevivência é, pelo menos, 50% é a chave para dominar esta técnica. Se oócitos maduros não é provável que a milrinona não foi diluída o suficiente. Recomendamos enxaguar os oócitos através de muitos grandes gotas de milrinona livre CZB antes da maturação. A microinjeção seguintes ploidia análise é um dos muitos testes para avaliar a maturação meiótica. Análises de rotina que usamos no laboratório incluem o monitoramento da cinética pelo qual o progresso através de oócitos meiose, imunofluorescência para analisar a formação do fuso e alinhamento de cromossomos e ativação ovo ou a fertilização in vitro para avaliar as conseqüências do desenvolvimento da manipulação de oócitos 14,15, 16, 17.

Tabela de reagentes específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Milrinona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Ressuspender em DMSO a 2,5 mm </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Apenas uso de embriões testados, estéril filtrado </td></tr><tr><td> CREST autosoroterapia </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Ressuspender em DMSO, de 100 mm </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela de equipamentos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome do Equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Bocal </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Vidro de relógio </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 milímetros Petri Dish </td><td> Falcão </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur de vidro pipetas </td><td> Fisher científica </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lado mais quente </td><td> Fisher científica </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td></td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Deslize Câmara </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação capilar </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> Pipeta Puller </td><td> Flaming-Brown micropipeta extrator </td><td></td><td> Modelo P-97 </td></tr><tr><td> Microscópio invertido </td><td> Nikon </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modelo de PLI-100 </td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> CO 2 tanques </td><td></td><td></td><td> Para incubadora </td></tr><tr><td> N2 tanque </td><td></td><td></td><td> Para a tabela e injetor </td></tr><tr><td> Anti-vibração tabela </td><td> Produção Técnica </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td></td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Pipetas segurando </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Ferramentas de dissecção </td><td> Multa ferramentas da ciência </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Câmara úmida </td><td></td><td></td><td> Usamos tupperware </td></tr><tr><td> Tampa da placa de 96 poços </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de microscópio </td><td> Fisher científica </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> Thomas científica </td><td> 6663-F10 </td><td> Espessura pode variar para microscópios especial </td></tr><tr><td> Centro de placa de cultura bem órgãos </td><td> Fisher científica </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15 milímetros </td></tr></tbody></table>

mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment

Erros na segregação cromossômica levar a células aneuplóides. Em células somáticas, aneuploidia é associado com o câncer, mas nos gametas, aneuploidia leva à infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Gametas haplóides por meio de formulário específico da espécie programas de desenvolvimento que são acoplados a meiose. A primeira divisão meiótica (MI) é exclusivo para a meiose porque cromátides irmãs permanecem ligados enquanto cromossomos homólogos são separados. Por razões ainda não totalmente compreendidas, esta divisão reducional é propenso a erros e é mais comumente a fonte de aneuploidia do que erros na meiose II (MII) ou de erros na meiose masculina 1,2. Nos mamíferos, os oócitos prisão em prófase da MI com um grande, vesícula intacta germinal (GV; núcleo) e só retomar a meiose quando recebem estímulos ovulatórios. Uma vez que retoma a meiose, oócitos MI completo e passar por uma divisão celular assimétrica, prendendo novamente na metáfase da MII. Ovos não completa MII até que sejam fertilizados por esperma. Oócitos também pode sofrer maturação meiótica utilizando estabelecidos em condições de cultura in vitro 3. Porque a geração de mutantes de camundongos transgênicos e gene-alvo é caro e pode demorar longos períodos de tempo, manipulação de gametas femininos in vitro é uma estratégia mais econômica e economia de tempo. Aqui, descrevemos métodos para isolar prófase detido oócitos de camundongos e por microinjeção. Qualquer material de escolha pode ser introduzido no óvulo, mas porque meiotically-oócitos competentes são transcricionalmente silenciosos cRNA 4,5, e não DNA, deve ser injetado para estudos de expressão ectópica. Para avaliar a ploidia, descrevemos nossas condições para maturação in vitro de oócitos MII aos ovos. Historicamente, o cromossomo espalhando técnicas são usadas para contar o número de cromossomos 6. Este método é tecnicamente desafiadora e está limitado a apenas identificar hyperploidies. Aqui, descrevemos um método para determinar hipo e hyperploidies usando ovos intactos 7-8. Este método usa monastrol, um inibidor cinesina-5, que entra em colapso o eixo bipolar em um eixo monopolar cromossomos 9 separando assim de tal forma que cinetócoros individuais podem ser facilmente detectadas e contadas usando um soro anti-CREST auto-imunes. Porque este método é realizado em ovos intactos, cromossomos não são perdidos devido a erro do operador.

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Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

29.6K visualizações.  University of Pennsylvania. Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

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Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

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Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Geração de Transgênicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinjeção de embriões

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Um protocolo para o uso de Gene definir análise de enriquecimento para identificar o modelo Animal adequado para investigação de translação

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolamento de Cardiomiócitos de Corações Fixos para Imunocitoquímica e Análise ploidy

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...