Ce travail a été effectué dans le laboratoire de Richard M. Schultz. Les auteurs tiennent également à remercier Michael Lampson pour conceptualiser le dosage centromère comptage et l&#39;accès à son microscope confocal. Teresa Chiang et Francesca Duncan a aidé à optimiser le dosage centromère comptage. Paula Stein est soutenu par HD022681 (RMS) et Karen Schindler est soutenu par HD055822.

1. La collecte des ovocytes de souris <ol><li> Pour maximiser le nombre de follicules antraux isolés les uns des souris, par voie intrapéritonéale d&#39;injecter sexuellement matures des souris femelles (nous utilisons de 6 semaines, âgé de souris CF-1 de Harlan) avec 5 UI de sérum de jument gravide gonadotrophine (PMSG). </li><li> Préparer le milieu de collecte (MEM / PVP) (3 ml / souris) en ajoutant la milrinone à 2,5 um et chaude à 37 ° C. La milrinone est un inhibiteur de la phosphodiestérase qui maintient l&#39;arrêt méiotique fois les ovocytes sont retirés de follicules. Sinon, la 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) (0,2 mM) ou dibutyryl-adénosine monophosphate cyclique (dbcAMP) (100 pg / ml) peuvent être utilisés. Préparer le milieu de culture par l&#39;ajout de glutamine (1 mM) et la milrinone (2,5 M) à 1 ml de CZB et lui permettre de s&#39;équilibrer dans l&#39;incubateur pendant au moins une heure. Mettre en place les microgouttes de chacun dans une boîte de Pétri et la superposition avec l&#39;huile minérale. Le plat CZB est placé dans la couveuse alors que le plat MEM / PVP reste à l&#39;extérieur sur un réchauffement de diapositives. Collecte des autres et de milieu de culture qui sont commercialement disponibles (M2 et M16 du support spécial ou Sigma) sont également utilisés en routine. </li><li> Environ 48 heures après l&#39;amorçage PMSG, le sacrifice de la souris utilisant du CO 2 sédation suivie par dislocation cervicale, disséquer les ovaires et les placer dans un verre de montre contenant préchauffé MEM / PVP + milrinone (MEM / PVP + M). </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml d&#39;insuline, ancre les ovaires à l&#39;antenne et la libération des follicules antraux en perforant plusieurs fois avec de calibre 27 (ou coudre) aiguilles qui sont fixées ensemble. </li><li> Tout en regardant à travers un microscope de dissection, de recueillir complexes cumulus-ovocytes en utilisant un bouche-exploité pipette en verre. Il est utile d&#39;avoir un microscope avec beaucoup de contraste. Alternativement, le support contenant le tissu et les cellules peuvent être pipetés à un couvercle d&#39;une boîte en plastique de Pétri. Ne recueillir grands follicules antraux et non moins pré-antraux follicules ou des ovocytes dénudés. Une fois collectés, les transferts complexes à une microgoutte de MEM / PVP + M qui est sur le réchauffement de diapositives et dans l&#39;huile. </li><li> Avec une pipette de petite taille (légèrement plus grand que le diamètre de l&#39;ovocyte), une pipette de haut en bas les complexes de détacher les cellules du cumulus. Transférer les ovocytes dénudés avec un plus grand pipette dans une microgoutte de CZB + milrinone (CZB + M) et le placer dans l&#39;incubateur. </li><li> Autoriser ovocytes de récupérer au moins 1 h dans l&#39;incubateur avant la manipulation. </li></ol> 2. Microinjection d&#39;ovocytes <ol><li> Faire des pipettes d&#39;injection en tirant verre borosilicate tube capillaire dans un extracteur mécanique. Nous utilisons un Flaming-Brown micropipette extracteur (modèle P-97) avec les paramètres suivants: P = 500, la chaleur = 300, Pull = 150, Vel = 100, temps = 150. </li><li> Préparer la plate-forme de micro-injection en plaçant une goutte 5 ul de MEM / PVP + M aussi près que possible à une baisse de 0,5 pi de matériel d&#39;injection de choix (par exemple siARN, ARNc, oligonucléotides morpholino, etc) sur une lame de chambre 1-bien que a la chambre des médias enlevés. Couvrir avec de l&#39;huile minérale et le placer sur la platine du microscope (fig. 1). </li><li> Placez l&#39;injection et les pipettes de maintien dans les titulaires et la position dans la goutte de MEM / PVP + M. Tournez sur les réservoirs d&#39;azote qui sont connectés à la picoinjector et anti-vibrations table. Ouvrez la pointe de la pipette d&#39;injection en douceur le tapotant contre la pipette de maintien tout en le remplissant avec support. Si l&#39;ouverture est trop grande, la moyenne se déplacer dans et hors vite et l&#39;aiguille va tuer la cellule. Pipettes avec trop peu d&#39;une ouverture se bloquent souvent facilement. </li><li> Ovocytes Transfert (5-10) de l&#39;incubateur à la baisse de MEM / PVP + M sur la plate-forme. Avant d&#39;injecter, la configuration de l&#39;picoinjector. Nous utilisons les paramètres suivants sur notre picoinjector (modèle PLI-100 de Harvard Apparatus): 2.5 à 3.5 psi = PBal, Pinj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, le temps = 3s. Il en résulte un volume d&#39;injection de 5-10 pL. </li><li> Tout en appuyant sur CLEAR, déplacer l&#39;aiguille d&#39;injection à la baisse de matériel et de remplissage. Rapportez-le à la baisse à moyen terme. </li><li> Utilisez la pipette de maintien de capturer un ovocyte et à aligner l&#39;aiguille d&#39;injection, l&#39;ovocyte et pipette de maintien le long de l&#39;axe x. </li><li> Sous un plus fort grossissement, l&#39;avance de la pipette d&#39;injection par l&#39;ovocyte en faisant attention à éviter le noyau. Une fois la membrane plasmique est percé, la presse injecter. Après l&#39;injection, retirer l&#39;aiguille. Communiqué de l&#39;ovocyte et répéter. Une fois que tous les ovocytes sont injectés, les retourner à l&#39;incubateur. Tenez-le dans CZB + M pour la quantité désirée de temps, ce temps dépend de l&#39;objectif expérimental (ie siARN et démontable morpholino (jusqu&#39;à 24 h), la surexpression (3-12 h)). S&#39;il vous plaît noter que les incubations de plus de 24 h compromettrait la maturation méiotique. </li></ol> 3. La maturation des ovocytes <ol><li> Après incubation, laver les ovocytes travers plusieurs gouttes de CZB (milieu de maturation) et le transfert à une microgoutte de milieu de maturation dans l&#39;huile et le placer dans l&#39;incubateur. </li><li> Prévoir 16 h pour t maturation complète<html> o métaphase de la méiose II. </li></ol> 4. Analyse de ploïdie <ol><li> Préparer CZB + monastrol (100 pM) et le lieu 750 ul dans le puits d&#39;une boîte de culture organe qui a de l&#39;eau dans l&#39;anneau extérieur. </li><li> Laver les œufs à travers plusieurs gouttes de CZB + monastrol et les transférer dans la boîte de culture d&#39;organes. Placer dans l&#39;incubateur pendant 1 h. </li><li> Fixer les œufs en les transférant dans un verre de montre contenant 2% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Transfert dans un autre verre de montre avec une solution de blocage. Ce plat peut être conservé à 4 ° C jusqu&#39;à leur transformation. </li><li> Transfert à la solution de perméabilisation (PBS + 0,3% de BSA + TritonX-100 0,1% + 0,02% NaN 3) dans un verre de montre pendant 15 minutes à température ambiante. Rincer à travers plusieurs grands volumes de solution de blocage (PBS + 0,3% de BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> Le reste de la procédure est exécutée sur le couvercle d&#39;une plaque de 96 puits dans une chambre humidifiée à température ambiante qui est protégé de la lumière. Les gouttes (~ 25 pl) sont placés à l&#39;intérieur des empreintes circulaires. Transfert des œufs à la solution de blocage pendant 15 minutes. </li><li> Pour centromères étiquette, oeufs transfert à une goutte de solution de blocage contenant CREST anti-sérum à 1:40. Incuber pendant au moins 1 h. Laver à 3 gouttes de solution de blocage, l&#39;incubation de 15 minutes chacune. </li><li> Transfert des œufs d&#39;une goutte de solution de blocage contenant Cy5 ou Alexa Fluor-594-conjugué anti-IgG humaine (1:200) et incuber pendant 1h. Répétez des étapes de lavage comme ci-dessus, sauf pour la dernière étape, notamment Sytox vert (1:5.000) dans la solution de blocage afin de détecter les chromosomes. Mont de 5 pi d&#39;Vectashield. Pour éviter l&#39;écrasement des oeufs, mettre 4 petits points de gelée de pétrole dans les coins de l&#39;endroit où la lamelle sera. Placer une lamelle sur le dessus et sceller avec du vernis à ongles. Conserver dans une boîte à lames à 4 ° C jusqu&#39;à leur traitement par microscopie confocale. </li><li> Alors que l&#39;imagerie avec un objectif 100X, la capture 0,4 um étapes dans le plan Z et l&#39;image de toute la région de la broche en métaphase. Comptez centromères en utilisant le logiciel d&#39;imagerie telles que Image J (NIH). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: La figure 2 est une projection de Z-à partir d&#39;un oeuf euploïde. A la métaphase de MII, des œufs de souris euploïde contiennent 20 paires de chromosomes et donc avoir 40 centromères. Parfois les chromosomes ne parviennent pas à propager malgré un traitement monastrol. Cette situation rend difficile la fiabilité comptent centromères et nous ne comprennent donc pas ces œufs dans nos analyses. Occasionnellement, il peut être difficile de déterminer si une CREST-immunoréactive «spot» est 1 ou 2 centromères. En utilisant des programmes tels que Image J est utile car on peut analyser chaque Z-section tout en notant soigneusement l&#39;orientation des chromosomes, le nombre de sections dans lesquelles une «tache» est détectée et l&#39;intensité du pixel «spots» ont. Selon l&#39;endroit où la broche méiotique est positionné par rapport au corps polaires, les régions de l&#39;ADN peuvent se chevaucher et ces échantillons ne devraient pas être inclus dans l&#39;analyse. Non manipulée, in vivo chez la souris oeufs ovulés reproductivement jeunes ont de faibles taux d&#39;aneuploïdie (~ 1-2%). Toutefois, pour des raisons de ne pas comprendre, microinjection et dans les procédures de maturation in vitro peut augmenter cette hausse de taux de 10%. Par conséquent, il est essentiel que les ovocytes injectés de contrôle sont inclus dans une étude micro-injection. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Vaisselle microinjection mis en place. Une diapositive de chambre avec 5 gouttes ul de MEM / PVP + M juste au-dessus des chutes 0.5μl solution injectable. Couvrir avec de l&#39;huile minérale. Dans cet exemple il ya 3 gouttes pour 3 solutions d&#39;injection différents et la lame est assis sur la scène d&#39;un microscope. Pour la gauche est l&#39;aiguille de microinjection et à droite est la pipette de maintien. Notez qu&#39;il ya un reflet de la porte-aiguilles. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Résultats de ploïdie. Un Z-projection d&#39;un oeuf euploïde métaphase II. L&#39;ADN est coloré en vert et kinétochores sont colorés en rouge. Les flèches indiquent les deux bras distincts chromatides indiquant que kinétochores (# 17 et # 18) se chevauchent. Des œufs de souris euploïde contiennent 20 paires kinétochore (40 au total &quot;spots&quot;). Un œuf aneuploïdes contiendrait toute variation de ce nombre. Si cette procédure ont été réalisées sur les ovocytes MI métaphase, il y aurait 40 paires kinétochore (80 au total &quot;spots&quot;). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tableau 1"/> Tableau 1. Recette pour les moyennes de collecte et de la micro-injection (MEM / PVP + M). Tous les matériaux sont l&#39;embryon de culture de qualité et de Sigma-Aldrich. Stériliser par filtration à travers des filtres PVDF 0.22μm (nous utilisons Stericups Milipore) et stocker à 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg &quot;alt =&quot; Tableau 2 &quot;/&gt; Tableau 2. Recette pour les moyennes CZB. Tous les matériaux sont l&#39;embryon de culture de qualité et de Sigma-Aldrich. Stériliser par filtration à travers des filtres PVDF 0.22μm (nous utilisons Stericups Milipore) et stocker à 4 ° C.

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Microinjection d&#39;ovocytes est une méthode puissante pour étudier les mécanismes qui régulent la maturation méiotique 10,11, 12, 13. Cette méthode offre un moyen économique pour tester les hypothèses avant de faire un investissement important dans le développement de modèles de souris transgéniques et ciblée. La collecte des ovocytes et des techniques de micro-injection nécessitent plus de temps à maîtriser que les procédures typiques de biologie cellulaire. Obstacles spécifiques à la collecte comprennent souvent le contrôle de la pipeter à la bouche, tirer la pipette en verre taille appropriée pour la collecte et le décapage des cellules somatiques et augmente la vitesse de collecte afin de minimiser le temps pendant lequel les ovocytes sont en dehors de l&#39;incubateur. Nous vous recommandons de pratiquer plusieurs fois avant de faire des expériences. Transfert entre les ovocytes microgouttes tout en conservant le même nombre de cellules est une excellente façon de se familiariser avec cette méthode. La mort cellulaire survient fréquemment, tout en apprenant la microinjection. Cela pourrait se produire pour un certain nombre de raisons, y compris l&#39;injection d&#39;un trop grand d&#39;un volume de matière (c&#39;est à dire l&#39;ouverture de l&#39;aiguille d&#39;injection est trop grand), frapper le noyau avec l&#39;aiguille d&#39;injection, perçant le côté opposé de l&#39;ovocyte ou que le matériau injecté est toxique pour l&#39;ovocyte. Pratiquer avec injection de tampon dans des ovocytes jusqu&#39;à ce que votre taux de survie est d&#39;au moins 50% est la clé pour maîtriser cette technique. Si ovocytes ne parviennent pas à maturité, il est probable que la milrinone n&#39;a pas été diluée suffit. Nous recommandons de rincer à travers de nombreux ovocytes de grosses gouttes de milrinone sans CZB avant la maturation. L&#39;analyse de la micro-injection ploïdie dessous un des nombreux tests pour évaluer la maturation méiotique. Autres analyses de routine que nous utilisons dans le laboratoire incluent la surveillance de la cinétique par lequel le progrès à travers la méiose des ovocytes, l&#39;immunofluorescence pour analyser la formation du fuseau et l&#39;alignement des chromosomes et l&#39;activation d&#39;oeuf ou de fécondation in vitro pour évaluer les conséquences du développement de la manipulation des ovocytes 14,15, 16, 17.

Table des réactifs spécifiques: <table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Milrinone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Remettre en suspension dans le DMSO à 2,5 mm </td></tr><tr><td> L&#39;huile minérale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Seule l&#39;utilisation d&#39;embryons testés, filtration stérile </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox vert </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-homme Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine de sérum bovin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Remettre en suspension dans le DMSO à 100 mM </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Table des équipements spécifiques: <table border="1"><tbody><tr><th> Nom de l&#39;équipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Porte-parole </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Verre de montre </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 mm boîte de Pétri </td><td> Falcon </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Verre pipettes Pasteur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Côté chaud </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td></td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> Glissez Chambre </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes capillaires </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> Microcaps </td></tr><tr><td> Pipeter Puller </td><td> Flaming-Brown micropipette extracteur </td><td></td><td> Modèle P-97 </td></tr><tr><td> Microscope inversé </td><td> Nikon </td><td></td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> Micromanipulateurs </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modèle PLI-100 </td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> CO 2 réservoirs </td><td></td><td></td><td> Pour incubateur </td></tr><tr><td> N2 réservoir </td><td></td><td></td><td> Pour le tableau et l&#39;injecteur </td></tr><tr><td> Anti-vibration de table </td><td> Techniques de fabrication </td><td></td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> Incubateur </td><td></td><td></td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> PIPETTES de contention </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica </td><td></td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> Des outils de dissection </td><td> Outils des sciences de beaux </td><td></td><td> Tout modèle standard </td></tr><tr><td> Chambre humide </td><td></td><td></td><td> Nous utilisons tupperware </td></tr><tr><td> Couvercle de la plaque de 96 puits </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles </td><td> Thomas scientifiques </td><td> 6663-F10 </td><td> Epaisseur variera notamment pour les microscopes </td></tr><tr><td> Centre plat bien de la culture d&#39;organe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15mm </td></tr></tbody></table>

mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment

Erreurs dans la ségrégation des chromosomes conduire à des cellules aneuploïdes. Dans les cellules somatiques, l&#39;aneuploïdie est associée au cancer, mais dans les gamètes, conduit à une aneuploïdie infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Gamètes haploïdes forme à travers des espèces spécifiques à des programmes de développement qui sont couplés à la méiose. La première division méiotique (MI) est unique à la méiose parce chromatides sœurs restent attachés tout chromosomes homologues sont séparés. Pour des raisons encore mal comprises, cette division réductionnelle est sujette à des erreurs et est plus communément la source de l&#39;aneuploïdie que les erreurs de la méiose II (MII) ou que les erreurs dans le 1,2 méiose mâle. Chez les mammifères, l&#39;arrestation des ovocytes à la prophase de la MI avec un grand vésicule germinale intacte (GV; noyau) et ne reprendra la méiose quand ils reçoivent des signaux ovulatoire. Reprend la méiose fois, MI ovocytes complet et subir une division cellulaire asymétrique, en arrêtant à nouveau à la métaphase des MII. Oeufs ne sera pas complète MII jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient fertilisés par le sperme. Les ovocytes peuvent également subir une maturation méiotique à l&#39;aide établie dans des conditions de culture in vitro 3. Parce que la génération de mutants de souris transgéniques et le gène ciblé est coûteuse et peut prendre de longues périodes de temps, la manipulation des gamètes femelles in vitro est une stratégie plus économique et gain de temps. Ici, nous décrivons les méthodes pour isoler prophase arrêté ovocytes de souris et pour la microinjection. Tout matériau de choix peut être introduit dans l&#39;ovocyte, mais parce méiose-compétents ovocytes sont transcriptionnellement silencieux ARNc 4,5, et non de l&#39;ADN, doit être injecté pour les études de l&#39;expression ectopique. Pour évaluer la ploïdie, nous décrivons nos conditions pour la maturation in vitro des ovocytes MII aux œufs. Historiquement, les techniques d&#39;épandage du chromosome sont utilisés pour le comptage de 6 le nombre de chromosomes. Cette méthode est techniquement difficile et est limitée à seulement identifier hyperploidies. Ici, nous décrivons une méthode pour déterminer hypo-et hyperploidies utilisant des oeufs intacts 7-8. Cette méthode utilise monastrol, un inhibiteur de la kinésine-5, qui s&#39;effondre fuseau bipolaire dans un fuseau monopolaire 9 chromosomes séparant ainsi de telle sorte que kinétochores individuels peuvent être facilement détectées et comptées en utilisant un sérum anti-CREST auto-immunes. Parce que cette méthode est réalisée dans des oeufs intacts, les chromosomes ne sont pas perdues en raison d&#39;une erreur de l&#39;opérateur.

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Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d&#39;erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l&#39;infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

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Biology

29.7K vues.  University of Pennsylvania. Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

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Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

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Biologie

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Simple mutagenèse bisulfite d&#39;ovocytes

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

La génération d&#39;transgénique<em&gt; Hydra</em&gt; Par micro-injection d&#39;embryons

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocole pour l’utilisation de gènes série d’analyses d’enrichissement pour identifier le modèle Animal approprié de recherche translationnelle

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolement des cardiomyocytes des coeurs fixes pour l’immunocytochimie et l’analyse de ploy

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...