המשימה הוא סימן מסחרי רשום של Sigma-Aldrich ביוטכנולוגיה LP LentiPlex הוא סימן מסחרי של חברת Sigma-Aldrich ביוטכנולוגיה LP

LentiPlex משולב מסך ההתקנה כדי לזהות רצפי shRNA של עניין, חשוב להגדיר את המסך כך שרוב התאים מקבלים רק אחד shRNA לבנות. באמצעות משרד הפנים נמוך (ריבוי של זיהום), ההסתברות של integrants מרובות לכל תא הוא ירד מאוד. עם זאת, יעילות התמרה, ו MOIs הרצוי ולכן תלוי מאוד בסוג תא היעד. לכן, זוהי חובתו של משרד הפנים להגדרה אופטימלית מתבצעת לפני תחילת המסך בסוג התא החדש. 1. התמרה של תאים יעד LentiPlex עם משלחת משולב shRNA הספריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפועל משרד הפנים להשתמש ישתנו עבור תאים מסוגים שונים. אם הם משכפל הרצוי ואז מספר צלחות יש להגביר בהתאם. בנוסף, בדרך כלל זה לא יהיה יתרון לשלב את subpools שונים. שמירה subpools הנפרד יסייע בתהליך deconvolution. ודא נכסr תיוג של כל מנה רקמה תרבות עם מספר subpool שמוחל במהלך התמרה. נמוך הפנים מומלץ להפחית את ההסתברות integrants מרובות לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 - Seed את המספר המתאים של 60 מ&quot;מ צלחות עם מספיק תאים כדי להשיג ~ 70% confluency ביום המחרת (10 בריכות בסך הכל, כל אחד ביצע בשלושה עותקים = ​​30 מנות בסך הכל). לצורך המחקר שלנו, 60 מנות מ&quot;מ היו זורעים עם 6 x 105 A549 תאים להשיג confluency של 70% לפני התמרה. הדבר מבטיח כי התאים הם עדיין בשלב הצמיחה המעריכית. שיעורי הצמיחה משתנה בהתאם לסוג התא צריכה להיקבע לפני תחילת המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים לדבוק דוגרים על ידי לילה ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified באווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) כלילת שני נוסף 60 מ&quot;מ מנות עבור התמרה עם shRNAs בקרה שלילית. לייבל את הכלים &quot;שליטה&quot; על SHC001H ו &quot;בקרת B&quot; עבור SHC002H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 - ה Transduceדואר תאים עם חלקיקי LentiPlex ויראלי. ביום של התמרה, להפשיר את חלקיקי lentiviral על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקיקי מופשר אל מכסה המנוע זרימה למינרית ולשמור על הקרח, אם לא בשימוש מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב כמה כל אחד בבריכה תת אדם ויראלי להוסיף את התאים כדי לקבל את משרד הפנים של 1 בכל הכלים תרבית תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמה: 1 x 10 6 תאים / תבשיל; titer ויראלי = 5 x 10 8 TU / מ&quot;ל; הרצוי של משרד הפנים 1. ט) 1 x 10 6 תאים / תבשיל x (של משרד הפנים 1) = 1 x 10 6 יחידות transducing (TU) צריך ב.) 1 x 10 6 TU / (5.0 x 10 8 TU / מ&quot;ל) המתקבל C של = 2 μL של פתרון מניות lentiviral יש להוסיף את המנה המתאימה. לדלל את כמות מחושבת של הנגיף μL 100-300 התקשורת להשלים כדי להבטיח חלוקה טובה יותר של הנגיף כאשר הוסיף בצלחת תרבית תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה מן התאים מראש seeded. הוסף להשלים התקשורת containing ברומיד hexadimethrine פתרון כל מנה. הריכוז הסופי של ברומיד מומלץ hexadimethrine בתקשורת הוא 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל. השתמש ברומיד hexadimethrine פחות אם אתה מוצא את זה כדי להיות רעיל לתאים היעד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חלקיקים shRNA lentiviral אל הכלים המתאימים בהתאם לעיצוב הניסוי מראש. בעדינות מערבולת הצלחות כדי לפזר באופן שווה על פני הנגיף לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 18-20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified באווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) חזור על 3-8 על זהות משרד הפנים עם SHC001H (ריק וקטור shRNA הבקרה) בכלי בקרה A ו SHC002H (מקושקשות shRNA שליטה) בחוק הפיקוח דיש ב התייחס הכלים האלה זהה את הכלים ניסיוני לאורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 - שנה את התקשורת. לשאוב וירוס המכילים מדיה להוסיף מדיה שלם טרי (ללא ברומיד hexadimethrine). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 2. התייחס מצופהתאים עם רכיב טיפולי מגיב / <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4 - מדיה לשאוב מבארות ולהוסיף התקשורת טרי המכיל מרכיב טיפולי בריכוז האופטימלי. כמו עם התנאים תרבות, טיפולים ישתנו ריכוזי נכונה המשכים צריך להיקבע מראש. במחקר זה, השתמשנו באפשרות 100 ng / mL של TRAIL ו 1 מיקרומטר של פקליטקסל. תאים שטופלו במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים שורדים צריך להיות מחדש seeded לתוך צלוחיות T75 ואיפשר להרחיב עד כמעט 100% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) בסוף הבחירה, לבדוק בקרה צלחת ואת צלחת בקרה דיש ב A ו-B צריך צלחת לכל אחד מאיתנו יש מושבות פחות מ לפחות אחת המנות ספריה נקווה. אם יש מספר גבוה באופן בלתי צפוי של מושבות בצלחת, מאשר כל אחד את תהליך התמרה השפיע על מסלול הקשורים הפנוטיפ הרצוי או לחץ סלקטיבי אינו חזק מספיק מחדש אופטימיזציה של assay ייתכן שתידרש. אם B מהודרת מכיל מושבות רבות מדיאז הביטוי של shRNA ומעורבות של מסלול RNAi עלול להיות בעל השפעה על הפנוטיפ של עניין. אם זה לחזור על המקרה עם SHC001H, על מנת להבטיח כי ההשפעה אינה ספציפית SHC002H. </li></ol> 3. Deconvolution מן האוכלוסייה תא polyclonal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר האוכלוסייה הטרוגנית של תאים subpool כל לבודד הדנ&quot;א הגנומי. בניסוי שלנו, תאים נשטפו בקצרה PBS ו trypsinized לפני הדנ&quot;א הגנומי היה מבודד באמצעות GenElute היונקים הגנום Miniprep ערכת וסיפקה פרוטוקול (Sigma-Aldrich, G1N70). לחלופין, טיהור אחרים כל גנומית ערכות הזמינים כעת בשוק יכול לשמש לבידוד DNA. חשוב לעקוב אחר ההמלצות פרוטוקול בסכום התחלתי של תאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR הגברה של מטרות. הליך ההתאוששות shRNA תבנית המאפשרת הגברה של הבריכה כולה מוסיף shRNA מן האוכלוסייה התא הנבחר, או שליפה של indiviכפול shRNA תבניות ממושבות כי נאספו בנפרד מורחבת. לאחר הגברה של מוסיף shRNA מתוך מלאה תאים היעד הנבחר, מוצרי ה-PCR יכול להיות רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד זה הגברה PCR היה מותאם שימוש Sigma רדימיקס, קטלוג מס &#39;P2893. ריאגנטים אחרים יכולים לשמש הגברה, אבל בתנאי רכיבה על אופניים ו / או ריכוז מגנזיום ייתכן שיהיה צורך לשנות עבור הגברה מוצלח. Primers הגברה ב mM ריכוז 20 כלולים בערכה LentiPlex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת PCR, כמתואר בטבלה 1. מוסיפים את המרכיבים לפי הסדר הרשום. הסכומים המתוארים כאן הם עבור one תגובה 50 μL. לתגובות נוספות, בהיקף תערובת רכיבים אמן על ידי המספר הרצוי של תגובות וכוללים overage 10%. כמות של תבנית ה-DNA המומלץ הוא 5-10 ng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ מאוד כי התגובה תבנית אחת מורכבת של וקטור המשימה shRNA האדם בקרה חיובית מדולל כדי appropriate ריכוז. הגברה מוצלחת עם תבנית זו מציינת כי הרכיבים assay PCR ותנאי הרכיבה מספיקות. הערה: כדי למנוע זיהום שריד של דגימות חומרים כימיים ניסיוניים, הוא הציע כי שליטה חיובי להיות מדולל במיקום נפרד מהמקום שבו עוקבים PCR תגובות מוגדרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את תוכנית ה-PCR המפורטים בטבלה 2 לתוך thermocycler שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדגם זה, משלבים 3 תגובה PCR μL עם μL 1 של צבע ו electrophorese לצד μL 5 של DirectLoad ™ PCR 100 נ&quot;ב סולם נמוך, מס &#39;קטלוגי D3687 על 1% agarose ג&#39;ל כדי לאשר את קיומו של amplicon 309 נ&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subcloning של PCR amplicons: מוצרי PCR היו Topo משובטים באמצעות ערכת Topo ת&quot;א שיבוט, בעקבות פרוטוקול של היצרן (Invitrogen, K4575-01). התוצאה היא מוצר אחד PCR הכלול וקטור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מושבות חיידקים בודדים (שכל אחת מהן מכילה יחיד PCR amplicon) היו מבודדים לגדולn ב 2 תרבויות מ&quot;ל של LB עם 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אמפיצילין. פלסמיד דנ&quot;א הופק אז באמצעות פלסמיד GenElute Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטוהרים DNA פלסמיד היה מתעכל עם EcoRI ו electrophoresed כדי לאשר את קיומו של הכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות DNA פלסמיד היו רצף ואז להכניס shRNA מזוהה באמצעות shRNA LentiPlex רצף חיפוש במסד הנתונים המסופק עם הספרייה LentiPlex. </li></ol> 4. יעד זיהוי ואימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף shRNA יוזם עם 5&#39;-GAAACACCGG-3 &quot;. הזן לפחות הבא 10 אך פחות מ 21 נוקלאוטידים כמו רצף שאילתה בתיבת החיפוש ב חיפוש המצורפת shRNA טופס רצף מסד נתונים של Access. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מינים של shRNA נקווה. לחלופין, בחר את subpool שממנו רצף נמצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת לחץ על כפתור &quot;מצא כניסות פוטנציאל&quot; כדי לבצע את החיפוש. זה אמור לזהות את הרצף המקביל TRC shRNA (ים) התואמים הדואר רצף נתונים. מידע נוסף על רצף TRC shRNA (ים) לזהות את יעדי הגן המקביל ניתן למצוא בקלות ב Sigma-Aldrich של ג&#39;ין מועדף: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגנים שזוהו היעד צריך להיות מאומת על ידי חזרה על assay ההקרנה המקורי עם המשובט TRC המקורי בתוספת לפחות שני shRNAs נוספים היעד הגן אותו באמצעות 1 shRNA לעצב היטב 1. להיטים אמנם יציג את פנוטיפ זהה ברוב של בארות. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה עבודה ונקווה LentiPlex מסך מפורט באיור 1. תאים transduced כי התרבו בנוכחות TRAIL ו פקליטקסל הורשו להרחיב עד צלוחיות היו ומחוברות. הדנ&quot;א הגנומי היה לקצור נתון הגברה ו PCR שיבוט כפי שמודגם באיור 1, בטרם הוגשה לזיהוי רצף shRNA כמתואר Figuמחדש 1 ג 250 היו שיבוטים רצף, של 25 היו אלה המיוצגים על ידי מספר רב של שיבוטים ואת 225 הנותרים היו מיוצגים על ידי שיבוט רק 1 ולא נרדפו בשלב זה. כפי שניתן לראות בתרשים 2, גנים מועמדים מספר כולל TBX3, PPP2CA ו AKT2 היו מיוצגים על ידי כפילים מרובים. הגורם T-box שעתוק, הופיע TBX3 בסך הכל של ארבעה שיבוטים כבר מעורב הגירה הגידול 5. Downregulation PPP2CA הודגמה לשמר את הצמיחה של תאים בתרבית בתנאים LNCaP חסר אנדרוגן על ידי להקלת אנדרוגן, מניעת המושרה תא מחזור מעצר ומניעת אפופטוזיס 6. AKT2 הוא סרין RAC-beta / תראונין חלבון קינאז ו oncogene המשוערת הפגינו לשחק מספר תפקידים בסרטן הפיתוח 7, 8. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="טבלה 1" /> * ריכוז סופי של Mg 2 + בתמיסה יהיה 3 מ&quot;מ;1.5 מ&quot;מ הוא תרם מן רדימיקס תקי ו 1.5 mM מפתרון מגנזיום כלוריד. 1. טבלת Lentiplex תגובת PCR תנאי <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="טבלה 2" /> 2. טבלה Lentiplex PCR תוכנית הגברה <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="איור 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="איור 1b" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="איור 1 ג" /> באיור 1. (א) LentiPlex ונקווה המסך, (ב) עבודה deconvolution polyclonal, ו (ג) זיהוי של מטרות shRNA. LentiPlex א ונקווה המסך. ראשית, תאים Seed, ולאחר מכן להוסיף subpools shRNA, (10 בריכות בסך הכל, כל אחד ביצע בשלושה עותקים, עבור 30 מנות בסך הכל). בשלב הבא, לטפל עם רכיב טיפולי מגיב / (במקרה שלנו, שביל אבאclitaxel, בהתאמה). ואז, ולזרוע מחדש תאים לשרוד צלוחיות ולאפשר להרחיב. קציר אוכלוסייה הטרוגנית של תאים subpool כל לבודד הדנ&quot;א הגנומי. Deconvolution ב polyclonal. בצע PCR להגביר DNA המכיל את הכנס shRNA. מוצר ה-PCR אחיד בגודל, אבל polyclonal ברצף מאז gDNA תבנית גם polyclonal. מוצר ה-PCR משובטים לתוך וקטור והפך לאחר מכן לתוך חיידקים המוסמכות. ג זיהוי מטרות shRNA. מושבות בודדים מבודדים פלסמיד דנ&quot;א מופק. כל כפיל מכיל את וקטור שיבוט עם פיסה PCR בודדים. פלסמיד דנ&quot;א מתעכל כדי לאשר את קיומו של הכנס ועל רצף. הכנס את shRNA מזוהה באמצעות shRNA LentiPlex רצף הנתונים חיפוש. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="איור 2" /> באיור 2. שזוהו יכולגנים didate. 25 גנים מועמדים שזוהו שהיו להיטים רבים. 225 גנים מועמדים רק 1 פגע לא נרדפו. אנא ראה לוח 1 משלים עבור התמוטטות של שיבוטים בודדים לכל גן מועמד. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="טבלה 1" /> משלים טבלה 1. הפרט TRC שיבוטים ספריית שזוהו מתוך סידור polyclonal ID Gene כניסות המשובטים זוהה.

<ol>
	<li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+vs.+shRNA:+similarities+and+differences.">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li><li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library.">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li><li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li><li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity.">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li><li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF/Tbx3+signaling.">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li><li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells:+therapeutic+implications.">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li><li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT2,+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine/threonine+kinases,+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas.">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li><li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1+and+Akt2:+differentiating+the+aktion.">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li><li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li></ol>

מתיו ג&#39;Coussens, קורטני קורמן, ל אשלי פישר, ג&#39;ק סאגו, וג&#39;ון Swarthout מועסקים על ידי חברת Sigma-Aldrich, מה שהופך את הכלים ריאגנטים שימוש במאמר זה.

במחקר זה, אנו מציגים מסך הגנום כולו כדי לזהות גנים המעורבים cytotoxicity של תאים A549 בעקבות הטיפול פקליטקסל / TRAIL. השימוש בגישה נקווה מסך הגנום כולו מפחיתה את הזמן, עלות ההשקעה בציוד הקשורים בדרך כלל עם מסכי ערוכים קונבנציונאלי. קריטי להצלחה של המסך הם ביצעו ניסויים אופטימיזציה מראש. התנאים התמרה ואת משרד הפנים צריכה להיקבע באופן אמפירי. שיטת הבחירה צריך לאפשר בחירה חזקים של תאים המציג את הפנוטיפ הרצוי (למשל, הישרדות, ביטוי חלבון פני השטח, וכו &#39;). אופטימיזציה של הפרמטרים הללו יהיה לצמצם את מספר תוצאות חיוביות שגויות שאותרו. כאן, gDNA היה שנקטפו מן האוכלוסייה עיקר התאים הנבחרים ולאחר מכן Topo משובטים לזהות מוסיף shRNA בודדים. אחת שיפור אפשרי עבור ניסוי זה היה כדי לבחור עבור תאים חיים באמצעות FACS על מנת להבטיחרק תאים חיים נאספים. מטרות זיהו יהיה תוקף על ידי התמרה עם יעד ספציפי shRNAs ב assay הקרנה. להיטים אמנם יציג את הפנוטיפ ברוב הבארות. ספריית LentiPlex משולב גמישה בבקשתו. זה תואם עם מגוון רחב של יישומים הזרם וניתן להשתמש באסטרטגיות בחירה חיובי או שלילי. בהתאם לתנאי ההקרנה, deconvolution של מוסיף shRNA מושגת באמצעות PCR / שיבוט, microarray, או הדור הבא של רצף 9, 10. בעוד הכוח והמהירות של טכניקות אלה deconvolute מסכי RNAi היא מבוססת היטב, דאגה אחת עם microarray ו הדור הבא של שיטות ריצוף הוא הזמינות של ביואינפורמטיקה המשאבים והידע הדרושים כדי לנתח ולפרש נכונה תוצאות הניסוי. העלויות הכרוכות טכניקות אלה יכולים לעתים קרובות פעמים להיות מכשול ההתחייבות של מסכי הגנום רחב. APCR / שיבוט הגישה מבוססת, בעוד לא חזק כמו microarrays ואת הדור הבא סידור מהווה חלופה העלות האפקטיבית נמוכה יותר. Agilent מציעה כעת מערך מותאם אישית המבוסס על ספריית TRC shRNA לסיוע נוסף מסכי LentiPlex. אפשרויות אלה לאפשר לחוקרים להשתמש LentiPlex ללמוד מגוון רחב של תפקודים תאיים.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex מערך משולב</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> תאים A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = he &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">פקליטקסל</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo ת&quot;א שיבוט Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart תקי רדימיקס</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute ערכת פלסמיד Miniprep</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadimethrine ברומיד</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

התערבות RNA (RNAi) הוא מנגנון פנימי הסלולר לרגולציה של ביטוי גנים. רתימת העוצמה המולדות של מערכת זו מאפשרת לנו רמת גן מציאה ביטוי בהפסד של מחקרים לתפקד גן. ישנן שתי שיטות עיקריות לביצוע RNAi. הראשונה היא השימוש RNAs התערבות קטנה (siRNAs) כי הם מסונתז כימי, והשני מנצל מכבנה קצר RNAs (shRNAs) מקודד בתוך פלסמידים 1. האחרון יכול להיות transfected ישירות לתוך התאים או ארוזים לחלקיקים שכפול פסול lentiviral. היתרונות העיקריים של שימוש shRNAs lentiviral היא הקלות של הכנסת לתוך מגוון רחב של סוגי תאים, היכולת שלהם להשתלב ביציבות הגנום עבור מציאה גן ארוך טווח הבחירה, ואת יעילותם בניהול תפוקה גבוהה אובדן מסכי לתפקד. כדי להקל על יצרנו את LentiPlex ונקווה ספריה shRNA. MISLentiPlex שיאון אנוש ספריית shRNA משולב הוא בריכה הגנום כולו lentiviral מיוצר באמצעות תהליך קנייני. הספרייה כוללת למעלה מ 75,000 מבנים shRNA מאוסף TRC מיקוד 15000 + גנים אנושיים 2. כל ספריה נבדק לייצוג shRNA לפני שחרור המוצר, כדי להבטיח כיסוי ספריה חזקים. הספרייה היא סיפקה בפורמט מוכן לשימוש lentiviral בבית titers של לפחות 5 מ&quot;ל 10 x 8 / TU באמצעות assay p24 ו מראש מחולקים לעשרה subpools shRNA של כ 8000 מבנים כל אחד. Primers הגברה וסדר ניתנים גם לצורך זיהוי מטרה במורד הזרם. מחקרים קודמים הקימה פעילות antitumor סינרגיסטי של TRAIL בשילוב עם פקליטקסל ב A549 תאים, ריאה אנושית קרצינומה של תאים קו 3, 4. במחקר זה אנו מדגימים את היישום של ספרייה ונקווה LentiPlex shRNA במהירות לנהל מסך הבחירה חיוביות גנים המעורבים o cytotoxicityו A549 תאים כאשר הם נחשפים TRAIL ו פקליטקסל. אחד המחסומים נתקל לעתים קרובות עם תפוקה גבוהה מסכי העלות וקושי deconvolution, אנחנו גם פרט גישה חסכונית polyclonal ניצול סידור המסורתית.

Watch this Scientific Journal Video about MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells at JoVE.com

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

כאן אנו להשתמש בספריית LentiPlex האנושי ונקווה המסורתית רצף שיטות לזיהוי מטרות הגן לקידום הישרדות התא. אנו מדגימים כיצד להגדיר deconvolute מסך LentiPlex ולאמת את התוצאות.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K Views.  Sigma-Aldrich. כאן אנו להשתמש בספריית LentiPlex האנושי ונקווה המסורתית רצף שיטות לזיהוי מטרות הגן לקידום הישרדות התא. אנו מדגימים כיצד להגדיר deconvolute מסך LentiPlex ולאמת את התוצאות.

Video: MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...