MISSÃO é uma marca registrada da LP Biotecnologia Sigma-Aldrich LentiPlex é uma marca comercial da LP Biotecnologia Sigma-Aldrich

LentiPlex Configuração da Tela de Pooled Para identificar seqüências shRNA de interesse, é fundamental para configurar a tela de tal forma que a maioria das células recebem apenas um shRNA construir. Usando uma baixa MOI (multiplicidade de infecção), a probabilidade de vários integrantes por célula é diminuído substancialmente. No entanto, a eficiência de transdução, e, portanto, MOIS desejado, depende fortemente do tipo de célula-alvo. Portanto, é imperativo que a determinação do MOI ideal é realizado antes de iniciar a tela em um novo tipo de célula. 1. Transdução de células alvo com o LentiPlex Missão Pooled shRNA Biblioteca <ol><li> O real MOI utilizado irá variar para diferentes tipos de células. Se replica são desejados, em seguida, o número de placas deve ser aumentado em conformidade. Além disso, normalmente, não será vantajoso para combinar a subpools diferentes. Mantendo o subpools separado auxiliar no processo de deconvolução. Garantir Proper rotulagem de cada prato de cultura de tecidos com o número subpool que é aplicada durante a transdução. A baixa MOI é aconselhado a reduzir a probabilidade de vários integrantes por célula. </li><li> Dia 1 - Semente do número apropriado de 60 mm de pratos com células suficientes para obter ~ 70% confluência no dia seguinte (10 piscinas no total, cada um realizado em triplicata = 30 pratos total). Para o nosso estudo, 60 pratos mm foram semeados com 6 x 105 células A549 para alcançar uma confluência de 70% antes de transdução. Isso garante que as células ainda estão em fase de crescimento exponencial. Taxas de crescimento variam de acordo com tipo de célula e deve ser determinado antes de iniciar a tela. </li><li> Permitem que as células a aderir pela incubação overnight a 37 ° C em uma incubadora umidificada em uma atmosfera de 5% CO 2. </li><li> (Opcional) Incluir mais dois pratos de 60 mm para a transdução com shRNAs controle negativo. Rotular os pratos &quot;Controle A&quot; para SHC001H e &quot;Control B&quot; para SHC002H. </li><li> Dia 2 - ª transduçãocélulas e com as partículas LentiPlex viral. No dia da transdução, descongelar as partículas lentiviral no gelo. </li><li> Transferir as partículas descongelado para uma capela de fluxo laminar e manter em gelo, se não ser utilizado imediatamente. </li><li> Calcular o quanto de cada indivíduo viral sub-pool para adicionar as células para obter o MOI de 1 em todas as placas de cultura de célula. <ol><li> Exemplo: 1 x 10 6 células / prato; título Viral = 5 x 10 8 TU / ml, um desejado MOI de 1. i.) 1 x 10 6 células / prato x (MOI de 1) = 1 x 10 6 unidades de transdução (TU) necessários ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) obtidos a partir do C da A = 2 mL da solução de reserva lentiviral deve ser adicionado ao prato apropriado. Diluir o montante calculado do vírus em 100-300 mL de mídia completa, a fim de assegurar uma melhor distribuição do vírus quando adicionado ao prato de cultura de células. </li></ol></li><li> Remova a mídia a partir de células pré-semeado. Adicionar completa media Contasolução de brometo Ining Hexadimetrina para cada prato. A concentração final recomendada de brometo de Hexadimetrina nos meios de comunicação é de 8 mg / ml. Use menos o brometo Hexadimetrina se você achar que ele seja tóxico para as células-alvo. </li><li> Adicionar Particulas de Lentivirus shRNA aos pratos apropriados, em conformidade com o projeto pré-determinado experimental. Agite suavemente as placas para distribuir uniformemente o vírus através de células. </li><li> Incubar 18-20 horas a 37 ° C em uma incubadora umidificada em uma atmosfera de 5% CO 2. </li><li> (Opcional) Repita 3-8 na idênticos MOI com SHC001H (vazio vetor shRNA Control) em Dish Controle A e SHC002H (mexidos shRNA controle) em Dish Controle B. Tratar estes pratos de forma idêntica para os pratos experimentais durante o experimento. </li><li> Dia 3 - Troque a mídia. Aspirar-vírus contendo mídia e adicionar novos media completo (sem brometo de Hexadimetrina). Incubar as células a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 2. Tratar platedcélulas com componente terapêutica / reagente <ol><li> Dia 4 - Aspirar media de poços e adicionar novas mídias contendo componente terapêutica na concentração ideal. Tal como acontece com as condições de cultura, os tratamentos vão variar e concentrações adequadas e durações deve ser determinada de antemão. Em nosso estudo, foram utilizados 100 ng / mL de TRAIL e 1 mM de Paclitaxel. Células foram tratadas por 48 horas. </li><li> Células sobreviventes devem ser re-semeada em frascos T75 e permitiu expandir até quase 100% confluentes. </li><li> (Opcional) No final da seleção, inspecionar controle Dish A e Controle Dish Dish B. A e B Dish cada um deve ter menos de colônias, pelo menos, um dos pratos biblioteca pool. Se houver um número inesperadamente elevado de colônias em um prato, que qualquer processo de transdução afetou um caminho relacionado com o fenótipo desejado ou a pressão seletiva não é suficientemente forte e re-otimização do ensaio pode ser necessária. Se B Dish contém muitas colônias, Então a expressão de shRNA eo engajamento da via RNAi pode ter um efeito sobre o fenótipo de interesse. Se este for o caso repita com SHC001H, para garantir que o efeito não é específico para SHC002H. </li></ol> 3. Deconvolução a partir de uma população de células policlonais <ol><li> Colheita da população heterogênea de células de cada subconjunto e isolar DNA genômico. Em nosso estudo, as células foram lavadas rapidamente em PBS e tripsinizados antes de DNA genômico foi isolado usando o GenElute mamíferos Genomic Miniprep kit e fornecido protocolo (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativamente, qualquer kits de purificação de genômica outros que estão atualmente disponíveis no mercado podem ser usados ​​para o isolamento de DNA. É importante seguir as recomendações de protocolo para o montante de partida das células em cultura. </li><li> A amplificação de alvos. O procedimento de recuperação shRNA modelo permite a amplificação de todo o pool de inserções shRNA da população de células selecionado, ou a recuperação de individupla modelos shRNA de colônias que foram escolhidos individualmente e expandido. Após a amplificação de insertos shRNA do controle e as células-alvo selecionados, os produtos de PCR pode ser seqüenciado. </li><li> Esta etapa de amplificação por PCR foi otimizada utilizando Sigma Readymix, Catalog No. P2893. Outros reagentes podem ser usados ​​para a amplificação, mas as condições de bicicleta e / ou concentração de magnésio pode precisar ser modificado para amplificação bem sucedida. Primers de amplificação na concentração de 20 mM estão incluídos no kit LentiPlex. </li><li> Configurar a reação de PCR, conforme descrito na Tabela 1. Adicione os componentes na ordem listada. Os montantes descritos são para uma reação de 50 mL. Para mais reacções, escala os componentes master mix pelo número desejado de reações e incluem sobrecarga de 10%. A quantidade de DNA modelo recomendado é de 50-100 ng. </li><li> É altamente recomendável que, para uma reação do modelo consiste na MISSÃO Controle de Vetores shRNA Humanos Positivo diluído para o adequado doiate de concentração. Amplificação de sucesso com este modelo indica que os componentes ensaio de PCR e as condições de ciclismo são adequados. NOTA: Para evitar contaminações de amostras e reagentes experimental, sugere-se que o controlo positivo seja diluído em um local separado, onde as reações posteriores PCR são criados. </li><li> Salve o programa PCR listados na Tabela 2 em seu termociclador. </li><li> Para cada amostra, combine 3 mL de reação de PCR com 1 mL de corante e electroforese juntamente com 5 mL de DirectLoad ™ PCR 100 bp Escada Baixo, número de catálogo D3687 em um gel de agarose 1% para confirmar a presença de um amplicon bp 309. </li><li> Subclonagem de PCR amplicons: produtos de PCR foram clonados TOPO utilizando o kit de clonagem TOPO-TA, seguindo o protocolo do fabricante (Invitrogen, K4575-01). O resultado é que um produto de PCR está contido em cada vetor. </li><li> 250 colônias de bactérias individuais (cada um contendo um indivíduo amplicon PCR) foram isolados e crescern em 2 mL de culturas LB com 100 mg / mL ampicilina. DNA plasmidial foi então extraído usando o GenElute Plasmid Miniprep kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> DNA plasmidial purificado foi digerido com EcoRI e eletroforese para confirmar a presença do inserto. </li><li> Amostras de DNA plasmidial foram seqüenciados ea inserção shRNA identificados utilizando o banco de dados LentiPlex shRNA Pesquisa Sequence fornecido com a biblioteca LentiPlex. </li></ol> 4. Identificação e Validação alvo <ol><li> A seqüência inicia com shRNA 5&#39;-GAAACACCGG-3 &#39;. Digite pelo menos nos próximos 10, mas menos de 21 nucleotídeos como a seqüência de consulta na caixa de pesquisa na sequência shRNA fechado Pesquisa forma banco de dados Access. </li><li> Selecionar as espécies do shRNA em pool. Opcionalmente, selecione o subconjunto a partir do qual a seqüência foi encontrado. </li><li> Agora clique em &quot;Find hits em potencial&quot; para realizar a pesquisa. Isto deve identificar o correspondente TRC seqüência shRNA (s) que correspondem ªe seqüenciamento de dados. Mais informações sobre a seqüência shRNA TRC (s) identificados e as metas gene correspondente pode ser facilmente encontrada no Sigma-Aldrich é o seu favorito Gene: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Genes-alvo identificados devem ser validados pela repetição do ensaio de rastreio original com o clone TRC original mais pelo menos duas shRNAs adicionais que visam o mesmo gene usando um shRNA 1-1 formato bem. Bate verdade irá exibir o mesmo fenótipo na maioria dos poços. </li></ol> 5. Resultados representante Um exemplo de um fluxo de trabalho da tela LentiPlex pooled é detalhado na Figura 1. Transduzidas células que proliferaram na presença de TRAIL e Paclitaxel foram autorizados a se expandir até frascos foram confluentes. DNA genômico foi colhida e submetida à amplificação por PCR e clonagem como ilustrado na Figura 1 A, antes de ser submetido à identificação e seqüenciamento shRNA como descrito no FIGUre 1 C. 250 clones foram seqüenciados, destes 25 foram representados por clones múltiplos e os 225 restantes foram representados por apenas um clone e não foram perseguidos neste momento. Conforme mostrado na Figura 2, vários genes candidatos, incluindo TBX3, PPP2CA e AKT2 foram representados por clones múltiplos. O fator de transcrição T-box, TBX3 apareceu em um total de quatro clones e tem sido implicado na migração do tumor 5. Downregulation PPP2CA tem sido demonstrado para manter o crescimento de células cultivadas em LNCaP andrógeno condições deficientes, aliviando o andrógeno-privação induzida por parada do ciclo celular e impedindo a apoptose 6. AKT2 é uma serina RAC-beta / treonina proteína-quinase e oncogene putativo demonstrado que desempenhar vários papéis em câncer de desenvolvimento 7, 8. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tabela 1" /> * Concentração final de Mg 2 + em solução será de 3 mM;1,5 mM é uma contribuição do Readymix Taq e 1,5 mM de solução de cloreto de magnésio. Tabela 1. Reaction Lentiplex Condições PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tabela 2" /> Tabela 2. Lentiplex Programa de Amplificação PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Figura 1c" /> Figura 1. (A) LentiPlex pooled tela, (B) deconvolução workflow policlonais, e (C) identificação de alvos shRNA. LentiPlex A. pooled tela. Primeiro, as células de sementes, em seguida, adicione subpools shRNA, (10 piscinas no total, cada uma feita em triplicado, por 30 pratos total). Em seguida, tratar com componente terapêutica / reagente (no nosso caso, TRAIL e Paclitaxel, respectivamente). Então, reseed células sobreviventes em frascos e deixe crescer. População heterogênea colheita de células de cada subconjunto e isolar DNA genômico. B. deconvolução policlonais. Perform PCR para amplificar DNA contendo a inserção shRNA. O produto da PCR é uniforme em tamanho, mas policlonais em seqüência desde o gDNA modelo também foi policlonais. Produto de PCR é clonado no vetor e depois transformado em bactérias competentes. C. Identificação de alvos shRNA. Colônias individuais são isolados e plasmídeo de DNA é extraído. Cada clone contém o vetor de clonagem com um fragmento de PCR individual. Plasmídeo de DNA é digerido para confirmar a presença da inserção e seqüenciados. A inserção shRNA é identificado usando o banco de dados LentiPlex shRNA Pesquisa Sequence. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Pode identificadosGenes didatos. 25 genes candidatos foram identificados, que tinha vários hits. 225 genes candidatos tiveram apenas 1 hit e não foram perseguidos. Por favor, consulte a Tabela Complementar 1 para a repartição dos clones individuais por gene candidato. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela Suplementar 1. Clones individuais TRC Biblioteca identificados a partir de ID policlonais Seqüenciamento Gene hits Clones detectado.

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Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago, e John Swarthout são empregados pela Sigma-Aldrich, o que torna ferramentas e reagentes utilizados neste artigo.

Neste estudo, apresentamos uma tela de todo o genoma para identificar genes envolvidos na citotoxicidade de células A549 seguinte paclitaxel / TRAIL tratamento. O uso de uma abordagem conjunta em uma tela do genoma reduz o tempo, custo e investimento em equipamentos normalmente associados com telas convencionais vestiu. Fundamental para o sucesso da tela são experimentos de otimização realizado com antecedência. Condições de transdução e MOI deve ser determinado empiricamente. O método de selecção devem permitir a seleção robusta de células exibindo o fenótipo desejado (por exemplo, a sobrevivência, a expressão de proteínas de superfície, etc). Otimização destes parâmetros irá reduzir o número de falsos positivos detectados. Aqui, gDNA foi colhida da população em massa de células selecionadas e depois TOPO clonado para identificar insere shRNA individual. Uma possível melhora para este experimento teria sido selecionar para células vivas usando FACS para garantirque apenas as células vivas são coletadas. Os alvos identificados serão validados por transdução com destino-específico shRNAs em um ensaio de rastreio. Bate verdade irá exibir o fenótipo na maioria dos poços. A Biblioteca LentiPlex Pooled é flexível na sua aplicação. É compatível com uma ampla gama de aplicações a jusante e pode ser usado com estratégias de seleção positiva ou negativa. Dependendo das condições de triagem, deconvolução das inserções shRNA é realizado através de PCR / clonagem, microarray, ou a próxima geração de sequenciamento de 9, 10. Enquanto a potência ea velocidade destas técnicas para deconvolute telas RNAi está bem estabelecida, uma preocupação com microarray e próxima geração de métodos de seqüenciamento é a disponibilidade de recursos de bioinformática e conhecimentos necessários para analisar e interpretar corretamente os resultados experimentais. Os custos associados a estas técnicas podem muitas vezes ser uma barreira para a empresa de telas de genoma de largura. APCR / clonagem abordagem baseada, embora não tão poderoso como microarrays e sequenciamento de última geração é uma alternativa de custo eficaz e de menor. Agilent oferece agora um conjunto personalizado baseado na biblioteca shRNA TRC para ajudar ainda mais em telas LentiPlex. Essas opções permitem que os pesquisadores de usar LentiPlex para estudar uma grande variedade de funções celulares.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Matriz LentiPlex Pooled</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> Células A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = en &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>% ONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute kit Miniprep Plasmid</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Hexadimetrina brometo</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo intrínseco de celular para a regulação da expressão gênica. Aproveitar o poder inato deste sistema nos permite níveis knockdown expressão gênica em perda de estudos da função gênica. Existem dois métodos principais para a realização de RNAi. O primeiro é o uso de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que são sintetizados quimicamente, eo segundo utiliza-hairpin RNAs curtos (shRNAs) codificado dentro plasmídeos 1. Este último pode ser transfectados em células direta ou embalados em replicação de partículas lentiviral incompetentes. As principais vantagens de usar shRNAs lentiviral é a facilidade de introdução em uma grande variedade de tipos de células, a sua capacidade de integrar de forma estável no genoma para knockdown do gene longo prazo e seleção, e sua eficácia na condução de alto rendimento perda de telas de função. Para facilitar isso criamos o LentiPlex pooled shRNA biblioteca. O MISSION LentiPlex Biblioteca shRNA Humanos Pooled é um pool genome-wide lentiviral produzidos usando um processo patenteado. A biblioteca é constituída por mais de 75.000 construções shRNA da coleção alvo TRC + 15.000 genes humanos 2. Cada biblioteca é testada para a representação shRNA antes do lançamento do produto para garantir a cobertura da biblioteca robusta. A biblioteca é fornecida em um formato pronto-to-use lentiviral em títulos de pelo menos 5 x 10 8 TU / ml via ensaio p24 e é pré-dividido em dez subpools de aproximadamente 8.000 shRNA constrói cada um. Primers de amplificação e sequenciamento também são fornecidos para a identificação do alvo a jusante. Estudos anteriores estabeleceram uma atividade antitumoral sinérgica de TRAIL, quando combinado com paclitaxel em células A549, um ser humano de pulmão linha de células de carcinoma 3, 4. Neste estudo demonstramos a aplicação de um pool biblioteca LentiPlex shRNA rapidamente conduzir uma tela de seleção de positivo para genes envolvidos na citotoxicidade of A549 células quando expostas a TRAIL e Paclitaxel. Uma barreira muitas vezes encontrados com telas de alto rendimento é o custo ea dificuldade de deconvolução; detalhamos também uma abordagem custo-benefício policlonais utilizando sequenciamento tradicional.

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MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Aqui usamos uma biblioteca LentiPlex humanos agrupados e tradicionais métodos de seqüenciamento de genes para identificar alvos promover a sobrevivência celular. Demonstramos como configurar e deconvolute uma tela LentiPlex e validar os resultados.

LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.6K visualizações.  Sigma-Aldrich. Aqui usamos uma biblioteca LentiPlex humanos agrupados e tradicionais métodos de seqüenciamento de genes para identificar alvos promover a sobrevivência celular. Demonstramos como configurar e deconvolute uma tela LentiPlex e validar os resultados.

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biologia

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...