MISSION est une marque déposée de Sigma-Aldrich Biotechnology LP LentiPlex est une marque de Sigma-Aldrich Biotechnology LP

Configuration de l&#39;écran LentiPlex Pooled Pour identifier des séquences shRNA d&#39;intérêt, il est essentiel de mettre en place l&#39;écran de telle sorte que la majorité des cellules ne reçoivent qu&#39;une seule shRNA construire. En utilisant une faible MOI (multiplicité d&#39;infection), la probabilité d&#39;intégrants multiples par cellule est grandement diminué. Cependant, l&#39;efficacité de transduction, et donc MOI désiré, dépendent fortement du type de cellule cible. Par conséquent, il est impératif que la détermination de la MOI optimale est effectué avant de commencer l&#39;écran dans un type cellulaire nouvelle. 1. Transduction des cellules cibles avec la mission LentiPlex Pooled shRNA Bibliothèque <ol><li> La réelle MOI utilisée varie en fonction des différents types cellulaires. Si désiré, puis répétitions sont le nombre de plaques doit être augmenté en conséquence. De plus, généralement il ne sera pas avantageux de combiner les sous-pools différents. Garder le sous-pools distincts seront une aide dans le processus de déconvolution. Assurez-vous proper étiquetage de chaque plat culture tissulaire avec le nombre sous-pool qui est appliquée lors de la transduction. Un peu MOI est conseillé de réduire la probabilité d&#39;intégrants multiples par cellule. </li><li> Jour 1 - Seed le nombre approprié de 60 mm de plats avec suffisamment de cellules pour obtenir environ 70% de confluence le jour suivant (10 piscines au total, chacun réalisés en triple = 30 plats au total). Pour notre étude, boîtes de 60 mm ont été ensemencées avec 6 x 105 cellules A549 pour atteindre un confluence de 70% avant de transduction. Cela garantit que les cellules sont encore en phase de croissance exponentielle. Les taux de croissance varient selon le type de cellules et doit être déterminé avant de commencer l&#39;écran. </li><li> Permettent aux cellules d&#39;adhérer par une nuit d&#39;incubation à 37 ° C dans un incubateur humidifié dans une atmosphère de 5% de CO 2. </li><li> (Facultatif) Inclure deux autres de 60 mm plats pour la transduction des shRNA contrôle négatif. Étiquette les plats &quot;Contrôle A&quot; pour SHC001H et &quot;Control B» pour SHC002H. </li><li> Jour 2 - ème transduirecellules e avec les particules virales LentiPlex. Le jour de la transduction, le dégel des particules lentiviraux sur la glace. </li><li> Transfert des particules décongelés à une hotte à flux laminaire et de garder sur la glace si elle n&#39;est pas utilisée immédiatement. </li><li> Calculez combien de chacun des sous-virale piscine d&#39;ajouter aux cellules pour obtenir le MOI de 1 dans toutes les boîtes de culture cellulaire. <ol><li> Exemple: 1 x 10 6 cellules / boîte; titre viral = 5 x 10 8 TU / ml; une MOI de 1 désiré. i.) 1 x 10 6 cellules / boîte x (MOI de 1) = 1 x 10 6 unités de transduction (TU) nécessaires ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) obtenue à partir du C A = 2 pi de solution stock lentiviraux devrait être ajouté à l&#39;antenne appropriée. Diluer le montant calculé du virus à raison de 100-300 ul de milieu complet afin d&#39;assurer une meilleure répartition du virus lorsqu&#39;il est ajouté à la boîte de culture cellulaire. </li></ol></li><li> Retirez le support à partir des cellules pré-ensemencés. Ajouter complète des médias ContaMINIER solution de bromure hexadiméthrine à chaque plat. La concentration finale recommandée de bromure hexadiméthrine dans les médias est de 8 pg / ml. Utilisez moins de bromure de hexadiméthrine si vous trouvez qu&#39;il soit toxique pour les cellules de votre cible. </li><li> Ajouter particules shRNA Lentiviral aux plats appropriés conformément à la conception prédéterminé expérimental. Mélanger délicatement les plaques pour répartir uniformément le virus à travers les cellules. </li><li> Incuber 18-20 heures à 37 ° C dans un incubateur humidifié dans une atmosphère de 5% de CO 2. </li><li> (Facultatif) Répétez 3-8 à l&#39;identique avec MOI SHC001H (vide vecteur de shRNA Control) dans un plat de contrôle A et SHC002H (brouillés shRNA contrôle) dans un plat de contrôle B. Traiter ces plats à l&#39;identique aux plats expérimentaux durant l&#39;expérience. </li><li> Jour 3 - Changer les médias. Aspirer contenant le virus des médias et ajouter Fresh Media complète (sans bromure hexadiméthrine). Incuber les cellules à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 2. Traiter plaquéscellules avec composante thérapeutique / réactif <ol><li> Jour 4 - Aspirer les médias à partir des puits et ajouter milieu frais contenant composante thérapeutique à la concentration optimale. Comme avec les conditions de culture, les traitements varient et les concentrations et les durées appropriées doivent être déterminées au préalable. Dans notre étude, nous avons utilisé 100 ng / mL de TRAIL et 1 uM de Paclitaxel. Les cellules ont été traitées pendant 48 heures. </li><li> Cellules survivantes devraient être ré-ensemencées dans des flacons T75 et a permis d&#39;étendre jusqu&#39;à près de 100% de confluence. </li><li> (Facultatif) A la fin de la sélection, inspecter contrôle vaisselle A et B. Contrôle vaisselle vaisselle A et B de chaque plat doit avoir moins de colonies que au moins un des plats les bibliothèques mises en commun. S&#39;il ya un nombre étonnamment élevé de colonies dans un plat, que ce soit le processus de transduction a affecté une voie liée au phénotype désiré ou la pression sélective n&#39;est pas suffisamment forte et ré-optimisation de l&#39;essai peut être nécessaire. Si B plat contient trop de colonies, Alors l&#39;expression de shRNA et l&#39;engagement de la voie de l&#39;ARNi peut avoir un effet sur le phénotype d&#39;intérêt. Si c&#39;est le cas avec SHC001H répéter, afin de s&#39;assurer que l&#39;effet n&#39;est pas spécifique à SHC002H. </li></ol> 3. Déconvolution d&#39;une population cellulaire polyclonale <ol><li> Récolte de la population hétérogène de cellules de chaque sous-pool et d&#39;isoler l&#39;ADN génomique. Dans notre essai, les cellules ont été lavées brièvement dans du PBS et la trypsine avant d&#39;ADN génomique a été isolé en utilisant la génomique des mammifères GenElute Miniprep kit et fourni protocole (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativement, d&#39;autres kits de purification toute génomiques qui sont actuellement disponibles sur le marché peuvent être utilisés pour l&#39;isolation d&#39;ADN. Il est important de suivre les recommandations du protocole pour le montant de départ de cellules cultivées. </li><li> L&#39;amplification par PCR de cibles. La procédure de récupération shRNA modèle permet l&#39;amplification de l&#39;ensemble du pool d&#39;inserts shRNA de la population de cellules sélectionnées, ou pour la récupération des indideux modèles de shRNA de colonies ont été individuellement pris et élargi. Après amplification d&#39;encarts shRNA du contrôle et de cellules cibles sélectionnées, les produits de PCR peut être séquencé. </li><li> Cette étape d&#39;amplification PCR a été optimisé en utilisant Sigma Readymix, Catalogue n ° P2893. D&#39;autres réactifs peuvent être utilisés pour l&#39;amplification, mais les conditions du vélo et / ou la concentration de magnésium peut être nécessaire de modifier pour l&#39;amplification réussie. Amorces d&#39;amplification à la concentration 20 mM sont inclus avec le kit LentiPlex. </li><li> Mettre en place la réaction PCR comme décrit dans le tableau 1. Ajoutez les composants dans l&#39;ordre indiqué. Les montants sont décrits pour une réaction de 50 ul. Pour plus de réactions, de l&#39;échelle des composants master mix par le nombre souhaité de réactions et notamment surconsommation de 10%. Le montant de la matrice d&#39;ADN recommandée est de 50-100 ng. </li><li> Il est fortement recommandé que pour une réaction du modèle se compose de la MISSION shRNA Vector Control humain positif dilué au approprIATE concentration. Amplification réussie avec ce modèle indique que les composants PCR et les conditions du vélo sont adéquates. REMARQUE: Pour éviter des contaminations croisées des échantillons expérimentaux et des réactifs, il est suggéré que le témoin positif peut être diluée dans un endroit séparé de l&#39;endroit où ultérieures réactions de PCR sont mis en place. </li><li> Enregistrer le programme PCR énumérés dans le tableau 2 dans votre thermocycleur. </li><li> Pour chaque échantillon, mélanger réaction 3 uL PCR avec 1 ul de colorant et électrophorèse côtés 5 pi de DirectLoad ™ PCR de 100 bp Ladder bas, D3687 Numéro de catalogue sur un gel à 1% d&#39;agarose pour confirmer la présence d&#39;un amplicon 309 pb. </li><li> Sous-clonage des amplicons PCR: Les produits de PCR ont été clonés TOPO utilisant le kit de clonage TOPO-TA, après le protocole du fabricant (Invitrogen, K4575-01). Le résultat est que l&#39;on produit de PCR est contenue dans chaque vecteur. </li><li> 250 colonies bactériennes individuelles (contenant chacun un individu amplicon de PCR) ont été isolés et grandirn dans 2 ml de cultures de LB avec 100 mg / ml d&#39;ampicilline. L&#39;ADN plasmidique a ensuite été extrait en utilisant la GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> Purifié ADN plasmidique a été digéré par EcoRI et électrophorèse pour confirmer la présence de l&#39;insert. </li><li> Les échantillons d&#39;ADN plasmidique ont ensuite été séquencés et l&#39;insert de shRNA identifiées en utilisant la séquence shRNA LentiPlex Recherche base de données fournie avec la bibliothèque LentiPlex. </li></ol> 4. Identification de la cible et la validation <ol><li> La séquence shRNA initie avec 5&#39;-GAAACACCGG-3 &#39;. Saisissez au moins les 10 prochaines, mais moins de 21 nucléotides que la séquence requête dans le champ de recherche sur la séquence ci-jointe shRNA Recherche base de données Access. </li><li> Sélectionner les espèces du shRNA commun. En option, sélectionnez le sous-pool à partir duquel la séquence a été trouvée. </li><li> Maintenant, cliquez sur «Trouver tubes potentiels&quot; pour effectuer la recherche. Cela devrait identifier les correspondants TRC shRNA de séquence (s) qui correspondent èmee séquençage des données. Plus d&#39;informations sur la séquence shRNA TRC (s) identifié et les objectifs gène correspondant peut être facilement trouvé chez Sigma-Aldrich votre gène favoris: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Gènes cibles identifiés devraient être validées en répétant le test de dépistage d&#39;origine avec le clone original TRC et au moins deux shRNA supplémentaires qui ciblent le même gène en utilisant un shRNA 1-1 format bien. Frappe True afficher le même phénotype dans la majorité des puits. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple d&#39;un workflow d&#39;écran LentiPlex groupée est détaillé dans la Figure 1. Cellules transduites qui ont proliféré dans la présence de TRAIL et Paclitaxel ont été autorisés à étendre jusqu&#39;au flacons sont confluentes. L&#39;ADN génomique a été récoltée et soumise à l&#39;amplification par PCR et le clonage, comme illustré dans la figure 1 A, avant d&#39;être soumis pour l&#39;identification et le séquençage shRNA comme décrit dans Figure 1 C 250 clones ont été séquencés, de ces 25 étaient représentés par des clones multiples et les 225 restants ont été représentés par seulement 1 clone et n&#39;ont pas été poursuivies à ce moment. Comme le montre la figure 2, plusieurs gènes candidats dont TBX3, PPP2CA et AKT2 étaient représentés par des clones multiples. Le facteur de transcription T-box, TBX3 apparu dans un total de quatre clones et a été impliquée dans la migration tumorale 5. Downregulation PPP2CA a été démontré pour maintenir la croissance des cellules LNCaP cultivées dans des conditions déficientes androgènes en soulageant le blocage androgénique induite par arrêt du cycle cellulaire et l&#39;apoptose prévention 6. AKT2 est une sérine-bêta CAR / thréonine protéine kinase-oncogène et putatifs démontré à jouer plusieurs rôles dans le cancer de développement 7, 8. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tableau 1" /> * Concentration finale de Mg 2 + en solution va être de 3 mm;1,5 mm est versé du Readymix Taq et 1,5 mm de la solution de chlorure de magnésium. Tableau 1. Conditions Lentiplex réaction PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tableau 2" /> Tableau 2. Lentiplex Programme d&#39;amplification par PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Figure 1b" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Figure 1c" /> Figure 1. (A) LentiPlex regroupés écran, (B) workflow déconvolution polyclonaux, et (C) l&#39;identification des cibles shRNA. LentiPlex A. regroupés écran. Abord, les cellules de semence, puis ajouter sous-pools shRNA, (10 piscines au total, chacune réalisée en trois exemplaires, pour les 30 plats au total). Ensuite, traiter avec composante thérapeutique / réactif (dans notre cas, TRAIL et Paclitaxel, respectivement). Puis, réensemencer les cellules survivantes dans des fioles et permettent de se développer. Récolte de la population hétérogène de cellules de chaque sous-pool et d&#39;isoler l&#39;ADN génomique. B. déconvolution polyclonaux. Effectuer la PCR pour amplifier l&#39;ADN contenant l&#39;insert de shRNA. Le produit de PCR est de taille uniforme, mais polyclonaux en séquence depuis l&#39;ADNg modèle a également été polyclonaux. Produit de PCR est cloné dans le vecteur et ensuite transformés dans des bactéries compétentes. C. Identification de cibles shRNA. Colonies individuelles sont isolées et l&#39;ADN plasmidique est extrait. Chaque clone contient le vecteur de clonage avec un fragment de PCR individuels. L&#39;ADN plasmidique est digéré pour confirmer la présence de l&#39;insert et séquencé. L&#39;insert de shRNA est identifié en utilisant le shRNA LentiPlex Recherche de séquence en base. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Identifiés peuventLes gènes didate. 25 gènes candidats ont été identifiés qui avait de multiples coups. 225 gènes candidats avaient seulement 1 coup et n&#39;ont pas été poursuivies. S&#39;il vous plaît voir le tableau 1 pour une ventilation supplémentaire des clones individuels par gène candidat. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tableau 1" /> 1 Tableau complémentaire. Individuels TRC clones identifiés à partir de la bibliothèque ID séquençage des gènes polyclonaux Clics clones détectés.

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Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sagou, et John Swarthout sont employés par Sigma-Aldrich, ce qui rend les outils et les réactifs utilisés dans cet article.

Dans cette étude, nous présentons un écran l&#39;échelle du génome pour identifier les gènes impliqués dans la cytotoxicité des cellules A549 après le paclitaxel / TRAIL traitement. L&#39;utilisation d&#39;une approche groupée dans un écran à l&#39;échelle du génome réduit le temps, de coût et d&#39;investissement d&#39;équipement normalement associées aux écrans conventionnels vêtu. Essentiel à la réussite de l&#39;écran sont des expériences d&#39;optimisation effectué au préalable. Conditions de transduction et MOI doit être déterminée empiriquement. La méthode de sélection doit permettre une sélection robuste de cellules présentant le phénotype souhaité (par exemple, la survie, l&#39;expression des protéines de surface, etc.) L&#39;optimisation de ces paramètres permettra de réduire le nombre de faux positifs détectés. Ici, ADNg a été récolté auprès de la population majeure partie des cellules sélectionnées, puis cloné à identifier TOPO inserts shRNA individuels. Une amélioration possible pour cette expérience aurait été de sélectionner pour les cellules vivantes en utilisant FACS pour assurerque seules les cellules vivantes sont collectées. Les cibles identifiées seront validés par transduction avec l&#39;objectif spécifique des shRNA dans un test de dépistage. Frappe True afficher le phénotype dans la majorité des puits. La Bibliothèque LentiPlex Pooled est souple dans son application. Il est compatible avec un large éventail d&#39;applications en aval et peut être utilisé avec des stratégies de sélection positive ou négative. Selon les conditions de dépistage, déconvolution des inserts shRNA est accompli par PCR / clonage, puces à ADN, ou séquençage de nouvelle génération 9, 10. Alors que la puissance et la vitesse de ces techniques pour déconvoluer écrans ARNi est bien établie, un souci de puces à ADN et la prochaine génération de méthodes de séquençage est la disponibilité des ressources bio-informatique et les connaissances nécessaires pour analyser et interpréter correctement les résultats expérimentaux. Les coûts associés à ces techniques peuvent souvent être un obstacle à la réalisation d&#39;écrans échelle du génome entier. APCR / clonage approche basée, tout en n&#39;étant pas aussi puissant que les microréseaux et de séquençage de nouvelle génération est une alternative rentable et inférieure. Agilent propose maintenant un tableau personnalisé basé sur la librairie shRNA TRC d&#39;une aide supplémentaire dans les écrans LentiPlex. Ces options permettent aux chercheurs d&#39;utiliser LentiPlex pour étudier un large éventail de fonctions cellulaires.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Tableau LentiPlex Pooled</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> Cellules A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = fr &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = Spec &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> TOPO TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>% ONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = Spec &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute kit Plasmid Miniprep</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadiméthrine bromure de</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

L&#39;interférence ARN (ARNi) est un mécanisme intrinsèque cellulaire pour la régulation de l&#39;expression génique. Exploiter la puissance innée de ce système nous permet d&#39;inactivation génique niveaux d&#39;expression de la perte d&#39;études de la fonction des gènes. Il existe deux méthodes principales pour effectuer l&#39;ARNi. La première est l&#39;utilisation de petits ARN interférents (siRNA) qui sont synthétisés chimiquement, et la seconde utilise des ARN en épingle à cheveux court (shRNA) encodé dans une plasmides. Ces derniers peuvent être transfectés dans des cellules directement ou emballés dans des particules réplication incompétents lentiviraux. Les principaux avantages de l&#39;utilisation de shRNA lentiviraux est la facilité d&#39;introduction dans une grande variété de types de cellules, de leur capacité à intégrer de façon stable dans le génome des gènes knockdown terme de temps et de sélection, et leur efficacité dans la conduite de haut débit de perte d&#39;écrans de fonction. Pour faciliter cela, nous avons créé la librairie shRNA LentiPlex commun. Le SIGLentiPlex SION homme shRNA Bibliothèque Pooled est une piscine à l&#39;échelle du génome lentiviral produites en utilisant un procédé exclusif. La bibliothèque se compose de plus de 75.000 constructions de shRNA de la collection TRC ciblant 15 000 gènes humains + 2. Chaque bibliothèque est testé pour la représentation des shRNA avant la sortie de produits pour assurer une couverture bibliothèque robuste. La bibliothèque est fournie dans un format prêt à utiliser lentiviraux à des titres d&#39;au moins 5 x 10 8 TU / ml par dosage de p24 et est pré-divisée en dix sous-pools d&#39;environ 8000 shRNA construit chacun. Amorces d&#39;amplification et de séquençage sont également fournis pour l&#39;identification des cibles en aval. Des études antérieures établi une activité antitumorale synergique de TRAIL lorsqu&#39;il est combiné avec le paclitaxel dans les cellules A549, une ligne de poumon humain carcinome 3, 4. Dans cette étude, nous démontrons l&#39;application d&#39;une bibliothèque LentiPlex shRNA regroupées pour procéder rapidement à des un écran de sélection positive pour les gènes impliqués dans la cytotoxicité of cellules A549 lorsqu&#39;ils sont exposés à TRAIL et Paclitaxel. Un obstacle souvent rencontré avec des écrans à haut débit est le coût et la difficulté de déconvolution; nous avons aussi en détail une approche rentable polyclonaux utilisant le séquençage traditionnel.

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MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Ici, nous utilisons une bibliothèque LentiPlex humains mis en commun et des méthodes de séquençage d&#39;traditionnelle identifier les gènes cibles de promouvoir la survie cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et de déconvoluer un écran LentiPlex et valider les résultats.

LentiPlex MISSION dépistage sur mélange d&#39;Bibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

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18.5K vues.  Sigma-Aldrich. Ici, nous utilisons une bibliothèque LentiPlex humains mis en commun et des méthodes de séquençage d'traditionnelle identifier les gènes cibles de promouvoir la survie cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et de déconvoluer un écran LentiPlex et valider les résultats.

Vidéo: MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

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Biologie

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Essais Reporter massivement parallèles dans des cellules de mammifères en culture

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Réalisé Evolution Méthode<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Library Création et dépistage

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...