MISSION è un marchio registrato di Sigma-Aldrich Biotecnologie LP LentiPlex è un marchio di Sigma-Aldrich Biotecnologie LP

LentiPlex schermata di configurazione pool Per identificare le sequenze shRNA di interesse, è fondamentale per impostare lo schermo in modo tale che la maggior parte delle cellule ricevono un solo shRNA costruire. Utilizzando un basso MOI (molteplicità di infezione), la probabilità di integrants multipli per cella è notevolmente diminuita. Tuttavia, l&#39;efficienza di trasduzione, e per questo vuol MOIS, dipendono fortemente dal tipo di cellula bersaglio. Pertanto, è imperativo che la determinazione del MOI ottimale si effettua prima di iniziare lo schermo in un nuovo tipo di cellula. 1. Trasduzione delle cellule bersaglio con la LentiPlex Missione Pooled shRNA Biblioteca <ol><li> L&#39;attuale MOI utilizzati variano per diversi tipi di cellule. Se si replica desiderata, quindi il numero dei piatti deve essere aumentato di conseguenza. Inoltre, di solito non sarà vantaggioso per combinare i subpools diversi. Mantenere la subpools separato sarà di aiuto nel processo di deconvoluzione. Garantire proper l&#39;etichettatura di ogni piatto di coltura con il numero di lotto secondario che viene applicato durante la trasduzione. Un basso MOI si consiglia di ridurre la probabilità di integrants multipli per cella. </li><li> Giorno 1 - Seed il numero appropriato di 60 mm, piatti a base di cellule sufficiente per ottenere circa il 70% confluenza il giorno successivo (10 piscine in totale, ciascuno eseguito in triplice copia = 30 piatti in totale). Per il nostro studio, 60 mm sono stati seminati i piatti con 6 x 105 cellule A549 per ottenere una confluenza del 70% prima di trasduzione. Questo assicura che le cellule sono ancora nella fase di crescita esponenziale. I tassi di crescita variano in base al tipo di cellula e deve essere determinato prima di iniziare lo schermo. </li><li> Consentono alle cellule di aderire incubando overnight a 37 ° C in un incubatore umidificato in una atmosfera di 5% CO 2. </li><li> (Facoltativo) Includere altri due di 60 mm piatti per la trasduzione con shRNAs controllo negativo. Etichetta i piatti &quot;Controllo A&quot; per SHC001H e &quot;Controllo B&quot; per SHC002H. </li><li> Giorno 2 - ° trasdurrele cellule e con le particelle LentiPlex virali. Il giorno della trasduzione, scongelare le particelle lentivirali sul ghiaccio. </li><li> Trasferire le particelle scongelati ad una cappa a flusso laminare e tenere sul ghiaccio, se non utilizzati immediatamente. </li><li> Calcolare la quantità di ogni singolo sub-virale piscina per aggiungere alle cellule per ottenere il MOI di 1 in tutti i piatti della cultura delle cellule. <ol><li> Esempio: 1 x 10 6 cellule / piatto; titolo virale = 5 x 10 8 TU / ml, un MOI desiderato di 1. i.) 1 x 10 6 cellule / piatto x (MOI di 1) = 1 x 10 6 unità di trasduzione (TU) necessari ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) ottenuto dalla C A 2 = microlitri di soluzione madre lentivirali deve essere aggiunto al piatto appropriato. Diluire l&#39;importo calcolato del virus in 100-300 ml di mezzi di comunicazione completo in modo da garantire una migliore distribuzione del virus se aggiunto al piatto di coltura cellulare. </li></ol></li><li> Rimuovere i supporti dal pre-seminato cellule. Aggiungi multimediale completo Contaesaminando la soluzione di bromuro di hexadimethrine per ogni piatto. La concentrazione finale che si raccomanda di bromuro hexadimethrine nei media è di 8 mg / ml. Utilizzare meno bromuro hexadimethrine se lo trovate ad essere tossico per le cellule bersaglio. </li><li> Aggiungi particelle shRNA lentivirali ai piatti appropriati secondo il prestabilito disegno sperimentale. Mescolare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente il virus attraverso le cellule. </li><li> Incubare per 18-20 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato in un clima di 5% di CO 2. </li><li> (Facoltativo) Ripetere 3-8 al identico MOI con SHC001H (vuoto vettore shRNA di controllo) nel Piatto di controllo A e SHC002H (strapazzate shRNA di controllo) nel Piatto B. Controllo Trattare questi piatti in modo identico ai piatti sperimentale per tutto l&#39;esperimento. </li><li> Giorno 3 - Modifica i media. Aspirare il virus contenente i media e aggiungere nuovi mezzi di comunicazione completo (senza bromuro hexadimethrine). Incubare le cellule a 37 ° C durante la notte. </li></ol> 2. Trattare placcatocellule con componente terapeutico / reagente <ol><li> Giorno 4 - supporti Aspirare da pozzi e aggiungere mezzi freschi contenenti componente terapeutica alla concentrazione ottimale. Come nel caso di condizioni di coltura, i trattamenti e le concentrazioni variano corretta e la durata dovrebbe essere determinata in anticipo. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato 100 ng / ml di TRAIL e 1 microM di Paclitaxel. Le cellule sono state trattate per 48 ore. </li><li> Cellule sopravvissute devono essere ri-seminate in fiasche T75 e ha permesso di espandersi fino a quasi il 100% confluenti. </li><li> (Opzionale) Al termine della selezione, ispezione e controllo Dish Un Piatto Piatto di controllo B. A e B Piatto dovrebbero avere un minor numero di colonie di almeno uno dei piatti biblioteca pool. Se ci sono un numero inaspettatamente alto di colonie in un piatto, rispetto al processo di trasduzione ha colpito un percorso legati al fenotipo desiderato o la pressione selettiva non è sufficientemente forte e ri-ottimizzazione del dosaggio può essere richiesto. Se B Piatto contiene troppi colonie, Allora espressione di shRNA e di impegno della via RNAi può avere un effetto sul fenotipo di interesse. Se questo è il caso di ripetere SHC001H, per garantire che l&#39;effetto non è specifico per SHC002H. </li></ol> 3. Deconvoluzione da una popolazione di cellule policlonali <ol><li> Raccolta la popolazione eterogenea di cellule di ogni pool secondario e isolare DNA genomico. Nel nostro studio, le cellule sono state lavate in PBS e brevemente trypsinized prima di DNA genomico è stato isolato utilizzando il GenElute mammiferi Genomic Miniprep kit e fornito protocollo (Sigma-Aldrich, G1N70). In alternativa, tutti gli altri kit di purificazione genomiche che sono attualmente disponibili sul mercato possono essere utilizzati per l&#39;isolamento del DNA. E &#39;importante seguire le raccomandazioni del protocollo per l&#39;importo iniziale di cellule in coltura. </li><li> Amplificazione degli obiettivi. La procedura di shRNA modello di recupero consente l&#39;amplificazione del l&#39;intero pool di inserti shRNA dalla popolazione cella selezionata, o il recupero delle persone fisichedue modelli shRNA da colonie che sono state raccolte individualmente e ampliato. Dopo l&#39;amplificazione di inserti shRNA dal controllo e le cellule bersaglio selezionato, i prodotti PCR può essere sequenziato. </li><li> Questo passo di amplificazione è stato ottimizzato utilizzando Sigma Readymix, n. di catalogo P2893. Altri reagenti possono essere utilizzati per l&#39;amplificazione, ma le condizioni in bicicletta e / o concentrazione di magnesio può essere necessario modificare per l&#39;amplificazione di successo. Primer di amplificazione alla concentrazione mM 20 sono inclusi nel kit LentiPlex. </li><li> Impostare la reazione PCR come descritto nella Tabella 1. Aggiungere i componenti nell&#39;ordine elencato. Gli importi descritti sono per una reazione di 50 microlitri. Per ulteriori reazioni, scala i componenti master mix dal numero desiderato di reazioni e comprendono il 10% eccedenza. La quantità di DNA consigliato è di 50-100 ng. </li><li> E &#39;fortemente raccomandato che per una reazione del modello è costituito dalla Vector missione umana shRNA controllo positivo diluito al approprIATE concentrazione. Amplificazione di successo con questo modello indica che i componenti PCR e le condizioni di ciclismo sono adeguate. NOTA: Per prevenire la contaminazione riporto di campioni sperimentali e reagenti, si suggerisce che il controllo positivo essere diluito in un luogo diverso da dove successive reazioni di PCR sono impostati. </li><li> Salvare il programma PCR elencati nella tabella 2 nel termociclatore. </li><li> Per ogni campione, combinare 3 microlitri di reazione PCR con 1 ml di colorante e elettroforesi accanto a 5 ml di DirectLoad ™ PCR 100 bp Low Ladder, numero di catalogo D3687 su un 1% gel per confermare la presenza di un amplicone 309 bp. </li><li> Subcloning ampliconi della PCR: prodotti di PCR sono stati clonati utilizzando il TOPO TOPO-TA kit di clonazione, seguendo il protocollo del produttore (Invitrogen, K4575-01). Il risultato è che un prodotto di PCR è contenuto in ciascun vettore. </li><li> 250 colonie batteriche individuali (contenenti ognuno un individuo amplicone PCR) sono stati isolati e cresceren in 2 ml di LB culture con 100 mg / ml di ampicillina. DNA plasmidico è stato poi estratto utilizzando il GenElute plasmidi Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> Purificato il DNA plasmide è stato digerito con EcoRI e elettroforesi per confermare la presenza dell&#39;inserto. </li><li> Campioni di DNA plasmidico sono stati poi sequenziati e l&#39;inserto shRNA identificati utilizzando la banca dati LentiPlex shRNA sequenza di ricerca fornita con la libreria LentiPlex. </li></ol> 4. Obiettivo Identificazione e validazione <ol><li> La sequenza inizia con shRNA-GAAACACCGG 5&#39;-3 &#39;. Inserire almeno i prossimi 10 ma meno di 21 nucleotidi come la sequenza query nella casella di ricerca sul modulo allegato sequenza shRNA database di ricerca di accesso. </li><li> Selezionare le specie del shRNA pool. Facoltativamente, selezionare il pool secondario da cui è stata trovata la sequenza. </li><li> Ora clicca sul pulsante &quot;Trova Hits potenzialità&quot; per eseguire la ricerca. Questo dovrebbe individuare le corrispondenti sequenze shRNA TRC (s) che corrispondono °e la sequenza dei dati. Ulteriori informazioni sulla sequenza TRC shRNA (s) identificati e gli obiettivi gene corrispondente possono essere facilmente trovati a Sigma-Aldrich è il tuo Gene preferito: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Geni bersaglio individuata dovrebbe essere convalidata ripetendo il test di screening originale con il clone originale TRC, più almeno due shRNAs aggiuntive che colpiscono lo stesso gene con un 1 a 1 shRNA formato bene. Colpisce vero visualizza lo stesso fenotipo nella maggior parte dei pozzi. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Un esempio di un flusso di lavoro in pool LentiPlex schermo è illustrato dalla Figura 1. Cellule trasdotte che proliferano in presenza di TRAIL e Paclitaxel è stato permesso di espandersi fino fiaschi erano confluenti. Il DNA genomico è stato raccolto e sottoposto alle amplificazione PCR e la clonazione, come illustrato nella figura 1 A, prima di essere presentato per l&#39;identificazione e shRNA sequenza come descritto nella Figure 1 c. 250 cloni sono stati sequenziati, di questi 25 erano rappresentate da più cloni ed i restanti 225 sono rappresentati da 1 solo clone e non sono stati perseguiti in questo momento. Come mostrato nella Figura 2, tra cui diversi geni candidati TBX3, PPP2CA e AKT2 erano rappresentate da cloni diversi. Il T-box fattore di trascrizione, TBX3 apparso in un totale di quattro cloni ed è stato implicato nel tumore della migrazione 5. Downregulation PPP2CA ha dimostrato di mantenere la crescita delle cellule LNCaP androgeno coltivate in condizioni carenti dal alleviare i androgeno-privazione indotta arresto del ciclo cellulare e prevenire l&#39;apoptosi 6. AKT2 è un RAC-beta serina / treonina chinasi-proteina e oncogene putativo dimostrato di giocare diversi ruoli nel cancro dello sviluppo 7, 8. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tabella 1" /> * Concentrazione finale di Mg 2 + in soluzione sarà 3 mm;1,5 mm contributo del Readymix Taq e 1,5 mm di soluzione di cloruro di magnesio. Tabella 1. Lentiplex PCR Reazione Condizioni <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tabella 2" /> Tabella 2. Lentiplex PCR di amplificazione del programma <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Figura 1c" /> Figura 1. (A) LentiPlex pool schermo, (B) del flusso di lavoro deconvoluzione policlonale, e (C) individuazione di obiettivi shRNA. LentiPlex A. pool schermo. In primo luogo, le cellule di semi, quindi aggiungere subpools shRNA, (10 piscine in totale, ciascuno eseguito in triplice copia, per 30 piatti in totale). Quindi, trattare con componente terapeutico / reagente (nel nostro caso, TRAIL e Paclitaxel, rispettivamente). Poi, reseed cellule sopravvissute in fiaschi e permettere ad espandersi. Harvest popolazione eterogenea di cellule di ogni pool secondario e isolare DNA genomico. Deconvoluzione B. policlonali. Eseguire la PCR per amplificare il DNA che contiene l&#39;inserto shRNA. Il prodotto di PCR è uniforme nelle dimensioni, ma policlonali in sequenza in quanto il modello è stato anche gDNA policlonali. Prodotto di PCR è clonato in un vettore e poi trasformato in batteri competenti. C. Identificazione di bersagli shRNA. Individuali sono colonie isolate e DNA plasmidico viene estratto. Ogni clone contiene il vettore di clonazione con un frammento particolare PCR. DNA plasmidico è digerito per confermare la presenza dell&#39;inserto e sequenziato. L&#39;inserto shRNA viene identificato con il shRNA LentiPlex database di sequenza di ricerca. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Può identificatoI geni didati. 25 geni candidati sono stati identificati che erano colpi multipli. 225 geni candidati aveva solo 1 colpo e non sono stati perseguiti. Vedere tabella di complemento 1 per la ripartizione dei cloni individuali per gene candidato. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tabella 1" /> Supplementare Tabella 1. Individuale TRC cloni Biblioteca identificato da ID policlonali Gene Sequencing Hits cloni rilevato.

<ol>
	<li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+vs.+shRNA:+similarities+and+differences.">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li><li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library.">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li><li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li><li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity.">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li><li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF/Tbx3+signaling.">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li><li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells:+therapeutic+implications.">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li><li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT2,+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine/threonine+kinases,+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas.">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li><li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1+and+Akt2:+differentiating+the+aktion.">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li><li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li></ol>

Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago, e John Swarthout sono impiegati da Sigma-Aldrich, che rende gli strumenti e reagenti utilizzati in questo articolo.

In questo studio, presentiamo un genoma a livello di schermo per identificare i geni coinvolti nella citotossicità delle cellule A549 seguenti paclitaxel / TRAIL trattamento. L&#39;uso di un approccio raggruppati in una genome-wide a schermo riduce il tempo, costi e investimenti in attrezzature normalmente associati ai tradizionali schermi disposti. Fondamentale per il successo dello schermo ci sono esperimenti di ottimizzazione eseguiti in anticipo. Condizioni di trasduzione e MOI devono essere empiricamente determinato. Il metodo di selezione dovrebbe permettere una selezione solida di cellule visualizzazione del fenotipo desiderato (ad esempio, la sopravvivenza, l&#39;espressione della proteina di superficie, ecc.) Ottimizzazione di questi parametri ridurrà il numero di falsi positivi rilevati. Qui, gDNA è stato raccolto dalla maggior parte della popolazione di cellule selezionate e poi TOPO clonato per identificare inserti shRNA individuali. Un possibile miglioramento per questo esperimento sarebbe stato quello di selezionare per le cellule vive usando FACS per assicurareche solo le cellule vive sono raccolti. Gli obiettivi individuati saranno convalidati da trasduzione con mirate ad un shRNAs in un test di screening. Colpisce vero mostrerà il fenotipo nella maggior parte dei pozzi. La Biblioteca LentiPlex pool è flessibile nella sua applicazione. È compatibile con una vasta gamma di applicazioni a valle e può essere utilizzato con le strategie di selezione sia positiva che negativa. A seconda delle condizioni di screening, deconvoluzione degli inserti shRNA avviene tramite PCR / clonazione, microarray, o sequenziamento di prossima generazione 9, 10. Mentre la potenza e la velocità di queste tecniche per deconvolute schermi RNAi è ben definito, una preoccupazione con microarray e metodi di sequenziamento di nuova generazione è la disponibilità di risorse bioinformatica e le conoscenze necessarie per analizzare e interpretare correttamente i risultati sperimentali. I costi associati a queste tecniche possono essere spesso un ostacolo per l&#39;impresa di schermi genoma di larghezza. APCR / clonazione approccio, anche se non potente come microarray e sequenziamento di prossima generazione è un&#39;alternativa conveniente e più bassi. Agilent offre ora una gamma personalizzata basata sulla libreria TRC shRNA di ulteriori aiuti nelle schermate LentiPlex. Queste opzioni consentono ai ricercatori di utilizzare LentiPlex per studiare una vasta gamma di funzioni cellulari.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex Array pool</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> Le cellule A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = it &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F SPEC = &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F SPEC = &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute kit Miniprep plasmidi</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadimethrine bromuro</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

RNA interference (RNAi) è un meccanismo intrinseco cellulare per la regolazione dell&#39;espressione genica. Sfruttando la potenza innata di questo sistema ci permette di livelli di espressione genica knockdown la perdita di studi la funzione del gene. Ci sono due metodi principali per l&#39;esecuzione di RNAi. Il primo è l&#39;uso di piccoli RNA interferenti (siRNA) che sono sintetizzati chimicamente, e il secondo utilizza breve hairpin RNA (shRNAs) codificato all&#39;interno plasmidi 1. Quest&#39;ultimo può essere trasfettate in cellule direttamente o confezionato in replica particelle lentivirali incompetenti. I principali vantaggi dell&#39;utilizzo di shRNAs lentivirali è la facilità di introduzione in una grande varietà di tipi di cellule, la loro capacità di integrarsi stabilmente nel genoma di knockdown lungo termine e la selezione genetica, e la loro efficacia nella conduzione di high-throughput perdita di schermi funzione. Per facilitare questo abbiamo creato il pool LentiPlex biblioteca shRNA. Il MISLentiPlex SION umani shRNA Biblioteca pool è un genome-wide piscina lentivirale prodotto utilizzando un processo brevettato. La biblioteca è costituito da oltre 75.000 costrutti shRNA dalla collezione TRC targeting 15.000 geni umani 2. Ogni libreria è testato per la rappresentanza shRNA prima del rilascio del prodotto per garantire una copertura robusta biblioteca. La biblioteca è fornita in un pronto per l&#39;uso-lentivirale formato a titolazioni di almeno 5 x 10 8 TU / ml tramite test p24 ed è già diviso in dieci subpools di circa 8.000 shRNA costruisce ciascuno. Primer di amplificazione e sequenziamento sono forniti anche per l&#39;identificazione del bersaglio a valle. Precedenti studi istituito una attività sinergica antitumorale di TRAIL in combinazione con Paclitaxel in cellule A549, un essere umano carcinoma polmonare a cellule linea 3, 4. In questo studio dimostriamo l&#39;applicazione di una biblioteca LentiPlex pool shRNA per condurre rapidamente una schermata di selezione positiva per i geni coinvolti nella citotossicità of A549 cellule quando esposte a TRAIL e Paclitaxel. Uno degli ostacoli spesso incontrato con high-throughput schermi è il costo e la difficoltà di deconvoluzione, abbiamo anche dettaglio un costo-efficace approccio policlonali che utilizza il sequenziamento tradizionali.

Watch this Scientific Journal Video about MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells at JoVE.com

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Qui usiamo una libreria umano LentiPlex raggruppati e tradizionali metodi di sequenziamento per identificare gli obiettivi gene promuovere la sopravvivenza delle cellule. Dimostriamo come impostare e deconvolute uno schermo LentiPlex e convalidare i risultati.

LentiPlex MISSIONE pool di screening Biblioteca shRNA in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  Sigma-Aldrich. Qui usiamo una libreria umano LentiPlex raggruppati e tradizionali metodi di sequenziamento per identificare gli obiettivi gene promuovere la sopravvivenza delle cellule. Dimostriamo come impostare e deconvolute uno schermo LentiPlex e convalidare i risultati.

Video: MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Trapianto cellule di mammifero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Ricerca

Biologia

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...