La misión es una marca registrada de Sigma-Aldrich Biotecnología LP LentiPlex es una marca comercial de Sigma-Aldrich Biotecnología LP

LentiPlex pantalla de configuración agrupados Para identificar las secuencias del shRNA de interés, es fundamental para configurar la pantalla de tal manera que la mayoría de las células reciben una sola ARNhc construir. Mediante el uso de una baja MOI (multiplicidad de infección), la probabilidad de que varios integrantes de cada célula es mucho menor. Sin embargo, la eficiencia de la transducción, y por lo tanto, las MOI deseado, dependerá en gran medida del tipo de célula diana. Por lo tanto, es imperativo que la determinación del momento de inercia óptimo se lleva a cabo antes de iniciar la pantalla en un nuevo tipo de células. 1. Transducción de las células diana con la Misión LentiPlex agrupados ARNhc Biblioteca <ol><li> El actual momento de inercia utilizados variarán para diferentes tipos de células. Si se desea se replica entonces el número de placas debe ser aumentado. Además, por lo general no va a ser ventajoso combinar los diferentes subpools. Mantener el subpools separado la ayuda en el proceso de deconvolución. Garantizar proper el etiquetado de cada plato de cultivo de tejidos con el número de subagrupación que se aplica durante la transducción. Una baja MOI se recomienda para reducir la probabilidad de que varios integrantes por celda. </li><li> Día 1 - Alimentar la semilla del número apropiado de 60 mm platos con cantidad suficiente de células para obtener ~ 70% de confluencia en el día siguiente (10 piscinas en total, cada uno realizado por triplicado = 30 platos en total). Para nuestro estudio, placas de 60 mm fueron sembradas con 6 x 105 células A549 para lograr una confluencia del 70% antes de transducción. Esto asegura que las células están todavía en fase de crecimiento exponencial. Las tasas de crecimiento varían según el tipo celular y debe ser determinado antes de comenzar la pantalla. </li><li> Permiten a las células a adherirse mediante la incubación de la noche a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de CO2 al 5%. </li><li> (Opcional) Incluya otros dos de 60 mm para la transducción de platos con shRNAs control negativo. Etiqueta de los platos &quot;Control A&quot; para SHC001H y &quot;Control B&quot; para SHC002H. </li><li> Día 2 - º transducirlas células con las partículas e LentiPlex viral. En el día de la transducción, descongelar las partículas lentiviral en el hielo. </li><li> La transferencia de las partículas de descongelado a una campana de flujo laminar y mantener en hielo si no se utilizan inmediatamente. </li><li> Calcular cuánto de cada individuo viral sub-grupo que añadir a las células para obtener el MOI de 1 en todos los platos de cultivo celular. <ol><li> Ejemplo: 1 x 10 6 células / plato, título viral = 5 x 10 8 TU / ml, un deseado MOI de 1. i.) 1 x 10 6 células / plato x (MOI de 1) = 1 x 10 6 unidades de transducción (TU) necesarios ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) obtenidos de la C de A = 2 l de solución de reserva lentiviral se debe agregar al plato apropiado. Diluir la cantidad calculada del virus en 100-300 l de medio completo con el fin de asegurar una mejor distribución de los virus cuando se añade a la placa de cultivo celular. </li></ol></li><li> Retire los medios de comunicación de las células pre-semilla. Añadir completa conta los medios de comunicaciónHexadimetrina nando una solución de bromuro de cada plato. La concentración final recomendada de bromuro Hexadimetrina en los medios de comunicación es de 8 mg / ml. Use menos bromuro de Hexadimetrina si usted encuentra que sea tóxico para las células de su objetivo. </li><li> Añadir partículas ARNhc lentiviral a los platos apropiados de acuerdo con el diseño predeterminado experimental. Remover con suavidad las placas para distribuir uniformemente el virus a través de las células. </li><li> Incubar 18-20 horas a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de 5% de CO 2. </li><li> (Opcional) Repita 3-8 en el momento de inercia con idéntica SHC001H (vector vacío del shRNA de control) en el plato de control A y SHC002H (revueltos siRNA control) en el plato de control B. Tratar estos platos de forma idéntica a los platos experimentales en todo el experimento. </li><li> Día 3 - Cambiar los medios de comunicación. Aspirar virus que contienen los medios de comunicación y añadir nuevos medios de comunicación completo (sin bromuro de Hexadimetrina). Se incuban las células a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 2. El tratamiento de chapadocélulas con componentes terapéuticos y / o reactivos <ol><li> Día 4 - Aspirar los medios de comunicación de los pozos y añadir medio fresco que contiene componente terapéutico en la concentración óptima. Al igual que con las condiciones de cultivo, los tratamientos varían y las concentraciones adecuadas y la duración debe ser determinado de antemano. En nuestro estudio, hemos utilizado 100 ng / ml de TRAIL y 1 M de paclitaxel. Las células fueron tratadas durante 48 horas. </li><li> Las células supervivientes deben ser re-sembradas en frascos T75 y se permite que se expanda hasta confluir casi el 100%. </li><li> (Opcional) Al final de la selección, inspección de control de un plato y plato de control del plato B. A y B del plato debe tener cada pocas colonias que por lo menos uno de los platos de la biblioteca común. Si hay un número inesperadamente alto de colonias en un plato, ya sea que el proceso de transducción ha afectado a una vía de relación con el fenotipo deseado o la presión selectiva no es lo suficientemente fuerte y volver a la optimización de la prueba pueden ser requeridos. Si B plato contiene demasiadas colonias, Entonces la expresión de shRNA y el compromiso de la vía de RNAi puede tener un efecto sobre el fenotipo de interés. Si este es el caso de repetir con SHC001H, para asegurarse de que el efecto no es específico de SHC002H. </li></ol> 3. Deconvolución de una población de células policlonales <ol><li> Cosecha de la población heterogénea de células de cada subagrupación y aislar el ADN genómico. En nuestro estudio, las células fueron lavadas brevemente en PBS y trypsinized antes de ADN genómico se aisló utilizando el GenElute mamíferos Genómica Miniprep kit y el protocolo suministrado (Sigma-Aldrich, G1N70). Por otra parte, los kits de purificación genómica otros que están actualmente disponibles en el mercado puede ser utilizado para el aislamiento de ADN. Es importante seguir las recomendaciones del protocolo de la cantidad a partir de células cultivadas. </li><li> Amplificación por PCR de los objetivos. La plantilla del shRNA procedimiento de recuperación permite la amplificación de todo el conjunto de inserciones del shRNA de la población de células seleccionadas, o la recuperación de los individos plantillas del shRNA de las colonias que fueron recogidos de forma individual y ampliado. Después de la amplificación de las inserciones del shRNA de control y celdas seleccionadas de destino, los productos de PCR puede ser secuenciado. </li><li> Este paso de amplificación de PCR fue optimizada utilizando Sigma Readymix, Catalog No. P2893. Otros reactivos pueden ser utilizados para la amplificación, pero las condiciones de la bicicleta y / o concentración de magnesio puede ser necesario modificar para la amplificación de éxito. Amplificación de los primers en la concentración de 20 mM se incluyen con el kit LentiPlex. </li><li> Establecer la reacción de PCR como se describe en la Tabla 1. Agregue los componentes en el orden indicado. Las cantidades descritas son para una reacción de 50 mL. Para más reacciones, la escala de los componentes de mezcla principal por el número deseado de reacciones e incluyen 10% de exceso. La cantidad de ADN plantilla recomendada es de 50 a 100 ng. </li><li> Se recomienda encarecidamente que por una reacción de la plantilla se compone de los vectores MISIÓN ARNhc Humanos control positivo diluido el parámetro adecuadoIATE concentración. Amplificación de éxito con esta plantilla indica que los componentes y las condiciones de ensayo de PCR en bicicleta son las adecuadas. NOTA: Para evitar la contaminación remanente de las muestras experimentales y reactivos, se sugiere que el control positivo se diluye en un lugar separado del lugar donde las posteriores reacciones de PCR se establezcan. </li><li> Guarde el programa de PCR en la Tabla 2 en el termociclador. </li><li> Para cada muestra, se combinan tres reacciones de PCR con l 1 l de medio de contraste y la electroforesis junto con 5 L de DirectLoad ™ PCR escalera de 100 pb de baja, número de catálogo D3687 en un 1% en gel de agarosa para confirmar la presencia de un amplicón de 309 pb. </li><li> Subclonación de PCR amplificados: productos de PCR fueron TOPO clonado utilizando el kit de clonación TOPO-TA, siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen, K4575-01). El resultado es que un producto de PCR se encuentra en cada vector. </li><li> 250 colonias bacterianas individuales (cada uno con un individuo amplicón PCR) fueron aislados y crecern en dos culturas ml de LB con 100 mg / ml de ampicilina. Plásmido de ADN fue extraído utilizando el kit Miniprep GenElute plásmido (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> Purificado el plásmido de ADN fue digerido con EcoRI y electroforesis para confirmar la presencia de la inserción. </li><li> Muestras de ADN del plásmido fueron secuenciados y el inserto del shRNA identificarse utilizando la secuencia de bases de datos del shRNA LentiPlex Buscar siempre con la biblioteca LentiPlex. </li></ol> 4. Objetivo la identificación y validación <ol><li> La secuencia se inicia con ARNhc 5&#39;-GAAACACCGG-3 &#39;. Escriba por lo menos los próximos 10 pero menos de 21 nucleótidos en la secuencia de consulta en el cuadro Buscar en la secuencia de forma cerrada del shRNA base de datos de búsqueda de acceso. </li><li> Seleccionar las especies de la shRNA común. Opcionalmente, active la subagrupación de la que se encontró la secuencia. </li><li> Ahora haga clic en &quot;Buscar éxitos potenciales&quot; para realizar la búsqueda. Se deben indicar la correspondiente secuencia de TRC shRNA (s) que coinciden con the secuencia de datos. Más información sobre la secuencia de TRC shRNA (s) identificados y los objetivos gen correspondiente se pueden encontrar fácilmente en Sigma-Aldrich es su gen favorito: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Identificaron los genes diana deberá ser validada por repetición de la prueba de detección original junto con el clon de la CVR y por lo menos dos shRNAs adicionales que se dirigen a un mismo gen con un siRNA 1 a 1 y el formato. Verdaderos hits mostrará el mismo fenotipo en la mayoría de los pozos. </li></ol> 5. Resultados representante Un ejemplo de un flujo de trabajo LentiPlex pantalla agrupados se detalla en la Figura 1. Células transducidas que proliferaron en la presencia de TRAIL y paclitaxel se les permitió expandirse hasta frascos fueron confluentes. ADN genómico fue extraído y sometido a la amplificación por PCR y la clonación, como se ilustra en la Figura 1 A, antes de ser presentado para la identificación de la secuencia y del shRNA como se describe en Figure 1 C 250 clones fueron secuenciados, de estos 25 fueron representados por múltiples clones y los restantes 225 estaban representados por sólo una copia y no se persigue en este momento. Como se muestra en la Figura 2, varios genes candidatos, incluida TBX3, PPP2CA y AKT2 estuvieron representados por múltiples clones. El factor de transcripción T-box, TBX3 apareció en un total de cuatro clones y se ha implicado en el tumor de migración a PHP 5. Regulación a la baja PPP2CA se ha demostrado que mantener el crecimiento de las células LNCaP cultivadas en condiciones deficientes de andrógenos por el alivio de la privación de andrógenos inducidos por el ciclo celular detención y prevención de la apoptosis 6. AKT2 es una serina RAC-beta / treonina proteína quinasa y oncogen putativo demostrado que desempeñan distintas funciones en el desarrollo del cáncer 7, 8. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tabla 1" /> * La concentración final de Mg 2 + en la solución de 3 mm;1,5 mM se aporta desde el Readymix Taq y 1,5 mm de la solución de cloruro de magnesio. Tabla 1. Lentiplex Condiciones de reacción PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tabla 2" /> Tabla 2. Lentiplex programa de amplificación de PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Figura 1c" /> Figura 1. (A) LentiPlex agrupados pantalla, (B) de flujo de trabajo deconvolución policlonales, y (c) la identificación de los objetivos del shRNA. LentiPlex A. agrupados pantalla. En primer lugar, las células de la semilla, a continuación, añadir subpools shRNA, (10 piscinas en total, cada uno realizado por triplicado, de 30 platos en total). A continuación, tratar con los componentes terapéuticos y / o reactivos (en nuestro caso, TRAIL y Paclitaxel, respectivamente). A continuación, sembrar de nuevo las células supervivientes en los frascos y dejar que se expanda. Cosecha heterogénea población de células de cada subagrupación y aislar el ADN genómico. Deconvolución B. policlonales. Realizar PCR para amplificar el ADN que contiene el inserto shRNA. El producto de PCR es uniforme en tamaño, pero policlonales en secuencia desde la ADNg plantilla también policlonales. Producto de PCR se clonaron en el vector y luego se transforma en bacterias competentes. C. Determinación de los objetivos del shRNA. Colonias individuales son aislados y el plásmido de ADN se extrae. Cada clon contiene el vector de clonación con un individuo fragmento de PCR. ADN plásmido se digiere para confirmar la presencia de la inserción y secuenciados. La inserción del shRNA se identifica con la secuencia de bases de datos del shRNA LentiPlex búsqueda. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Identificadas puedenLos genes candidato. 25 genes candidatos se identificaron que había muchos golpes. 225 genes candidatos sólo tenía un golpe y no fueron perseguidos. Por favor, véase la Tabla 1 suplementaria un desglose de los clones individuales por gen candidato. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tabla 1" /> Que complementa el cuadro 1. Individuales TRC clones Biblioteca identificados a partir de la secuenciación de genes ID policlonales Visitas clones detectados.

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Matthew J. Coussens, Corman Courtney, Ashley L. Fischer, Sago, Jack y John Swarthout son empleados por Sigma-Aldrich, lo que hace que las herramientas y los reactivos utilizados en este artículo.

En este estudio, se presenta una pantalla de todo el genoma para identificar genes implicados en la citotoxicidad de las células A549 después del tratamiento con paclitaxel / TRAIL. El uso de un enfoque combinado en una pantalla de todo el genoma reduce el tiempo, el costo y la inversión en equipo que normalmente se asocian con las pantallas convencionales dispuestos. Fundamental para el éxito de la pantalla son experimentos de optimización realizado de antemano. Condiciones de transducción y MOI debe ser determinado empíricamente. El método de selección debe permitir una selección sólida de células que presentan el fenotipo deseado (por ejemplo, la supervivencia, la expresión de proteínas de superficie, etc.) La optimización de estos parámetros se reducirá el número de falsos positivos detectados. Aquí, ADNg fue cosechado de la población mayor parte de las celdas seleccionadas y luego TOPO clonado para identificar inserciones individuales shRNA. Una posible mejora para este experimento habría sido para seleccionar las células en vivo usando FACS para asegurarque sólo las células vivas son recogidos. Los objetivos fijados, será validado por la transducción con el objetivo específico de shRNAs en un ensayo de cribado. Verdaderos hits mostrará el fenotipo de la mayoría de los pozos. La Biblioteca LentiPlex combinados es flexible en su aplicación. Es compatible con una amplia gama de aplicaciones posteriores y puede ser utilizado con las estrategias de selección positiva o negativa. Dependiendo de las condiciones de selección, deconvolución de los insertos del shRNA se lleva a cabo a través de PCR / clonación, microarrays, o secuenciación de próxima generación 9, 10. Aunque la potencia y velocidad de estas técnicas para deconvolute pantallas de RNAi está bien establecida, una preocupación por microarrays y próxima generación de métodos de secuenciación es la disponibilidad de recursos bioinformáticos y los conocimientos necesarios para analizar e interpretar correctamente los resultados experimentales. Los costos asociados con estas técnicas puede muchas veces ser un obstáculo para la realización de las pantallas de todo el genoma. APCR / enfoque basado en la clonación, aunque no tan poderoso como los microarrays y la secuenciación de próxima generación es una alternativa costo efectiva y de menor. Agilent ofrece ahora una gama personalizada basada en la biblioteca del shRNA TRC para ayudar aún más en las pantallas de LentiPlex. Estas opciones permiten a los investigadores a utilizar LentiPlex para estudiar una amplia gama de funciones celulares.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex agrupados matriz</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> Las células A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = es &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA y N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA kit de clonación </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;P2893&gt; </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Kit GenElute plásmido Miniprep</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Hexadimetrina bromuro</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo intrínseco celular de la regulación de la expresión génica. Aprovechar el poder innato de este sistema nos permite niveles de caída expresión de genes en la pérdida de los estudios de la función del gen. Hay dos métodos principales para la realización de RNAi. La primera es el uso de pequeños ARN de interferencia (siRNAs) que son sintetizados químicamente, y la segunda utiliza a corto horquilla RNAs (shRNAs) codificados en plásmidos 1. Estos últimos pueden ser transfectadas en células directa o empaquetados en la replicación lentiviral partículas incompetente. Las principales ventajas de la utilización de shRNAs lentiviral es la facilidad de introducción en una amplia variedad de tipos de células, su capacidad de integrar de manera estable en el genoma de caída a largo plazo y la selección de genes, y su eficacia en la conducción de alto rendimiento de las pantallas de la pérdida de función. Para facilitar esto hemos creado la biblioteca del shRNA LentiPlex agrupados. El SIGBiblioteca SION LentiPlex Humanos del shRNA agrupado una piscina lentiviral genoma producido utilizando un proceso patentado. La biblioteca consta de más de 75.000 construcciones de la colección del shRNA TRC dirigidos 15,000 genes humanos 2. Cada biblioteca es la prueba de la representación del shRNA antes del lanzamiento del producto para asegurar una cobertura sólida biblioteca. La biblioteca se presenta en un formato listo para usar lentiviral en títulos de al menos 5 x 10 8 TU / ml a través de ensayo y p24 es pre-dividido en diez subpools de aproximadamente 8.000 ARNhc construye cada uno. Cebadores de amplificación y secuenciación también están disponibles para la identificación de objetivos intermedios. Estudios previos han establecido una actividad antitumoral sinérgica de TRAIL en combinación con paclitaxel en las células A549, un carcinoma de pulmón humano línea celular 3, 4. En este estudio se demuestra la aplicación de un LentiPlex agrupados biblioteca del shRNA para llevar a cabo rápidamente una pantalla de selección positiva de los genes involucrados en la citotoxicidad of A549 células cuando está expuesta a TRAIL y paclitaxel. Una barrera a menudo encontrados con alto rendimiento de las pantallas es el costo y la dificultad en la deconvolución, también los detalles de un enfoque policlonal rentable la utilización de la secuenciación tradicional.

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MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Aquí se utiliza una biblioteca LentiPlex humano común y tradicionales métodos de secuenciación de genes para identificar los objetivos de promover la supervivencia celular. Demostramos cómo configurar y deconvolute una pantalla LentiPlex y validar los resultados.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.5K vistas.  Sigma-Aldrich. Aquí se utiliza una biblioteca LentiPlex humano común y tradicionales métodos de secuenciación de genes para identificar los objetivos de promover la supervivencia celular. Demostramos cómo configurar y deconvolute una pantalla LentiPlex y validar los resultados.

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Siembra y células de mamífero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Investigación

Biología

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Dirigida Método Evolución en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...