MISSION ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP LentiPlex ist ein Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP

LentiPlex Pooled Screen Setup Zur Identifizierung shRNA-Sequenzen von Interesse ist es wichtig, die Einrichtung des Bildschirms, so dass die Mehrzahl der Zellen erhalten nur eine shRNA konstruieren. Durch die Verwendung einer niedrigen MOI (Multiplizität der Infektion), ist die Wahrscheinlichkeit, mehrere Integranten pro Zelle deutlich verringert worden. Allerdings hängen Transduktion Effizienz und damit gewünschte MOIs, stark auf der Zielzelle aus. Daher ist es unerlässlich, dass die Bestimmung der optimalen MOI aus ist, bevor der Bildschirm in einer neuen Zelltyp durchgeführt. 1. Transduktion von Zielzellen mit der Mission LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek <ol><li> Die tatsächliche MOI verwendet werden für verschiedene Zelltypen variieren. Wenn Wiederholungen sind erwünscht dann die Anzahl der Platten müssen entsprechend erhöht werden. Darüber hinaus, in der Regel ist es nicht vorteilhaft, die verschiedenen Unterpools kombinieren. Keeping the Unterpools separaten wird in der Entfaltung zu unterstützen. Stellen Sie sicher, proper Kennzeichnung jedes Gewebe Kulturschale mit dem Teilpool Zahl, die während der Transduktion angewendet wird. Eine niedrige MOI wird empfohlen, die Wahrscheinlichkeit einer multiplen Integranten pro Zelle zu reduzieren. </li><li> Tag 1 - Seed die entsprechende Anzahl von 60-mm-Platten mit genügend Zellen zu ~ 70% Konfluenz am folgenden Tag (10 Pools insgesamt, jeweils in dreifacher Ausfertigung = 30 Gerichte insgesamt durchgeführt) erhalten. Für unsere Studie wurden 60 mm Platten mit 6 x 105 A549-Zellen ausgesät zu einer Konfluenz von 70% vor der Transduktion zu erreichen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellen noch in der exponentiellen Wachstumsphase. Die Wachstumsraten werden von Zelltyp variieren und müssen vor dem Start des Bildschirms bestimmt werden. </li><li> Lassen Zellen durch Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5% CO 2 zu halten. </li><li> (Optional) Fügen Sie zwei zusätzliche 60-mm-Platten für die Transduktion mit Negativ-Kontrolle shRNAs. Beschriften Sie die Gerichte &quot;Control A&quot; für SHC001H und &quot;Control B&quot; für SHC002H. </li><li> Tag 2 - transduzieren the-Zellen mit dem LentiPlex Viruspartikel. Am Tag der Transduktion, tauen die lentiviralen Partikeln auf Eis. </li><li> Übertragen Sie die aufgetauten Partikel zu einer Laminar-Flow-Haube und halten auf dem Eis, wenn nicht sofort verwendet wird. </li><li> Berechnen Sie, wie viel von jedem einzelnen viralen sub-Pool, um die Zellen hinzufügen, um den MOI von 1 in allen Zellkulturschalen zu bekommen. <ol><li> Beispiel: 1 x 10 6 Zellen / Schale; virale Titer = 5 x 10 8 TU / ml; eine gewünschte MOI von 1. i.) 1 x 10 6 Zellen / Schale x (MOI von 1) = 1 x 10 6 transduzierende Einheiten (TU) benötigt ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) aus der C erhalten A = 2 ul des lentiviralen Stammlösung sollte an die entsprechende Gericht hinzugefügt werden. Verdünnen Sie die berechnete Menge des Virus in 100-300 ul kompletter Medien, um eine bessere Verteilung des Virus, wenn die Zelle Kulturschale gegeben gewährleisten. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Medium aus der Vor-ausgesäten Zellen. Add komplette Medien-containing Hexadimethrinbromid Lösung zu jedem Gericht. Die empfohlene Endkonzentration von Hexadimethrinbromid in Medien liegt bei 8 pg / ml. Verwenden Sie weniger Hexadimethrinbromid, wenn Sie es als toxisch für Ihre Zielzellen zu finden. </li><li> Add shRNA Lentivirale Partikel geeignete Gerichte in Übereinstimmung mit den vorgegebenen experimentellen Design. Vorsichtig schwenken die Platten gleichmäßig zu verteilen das Virus in den Zellen. </li><li> Inkubieren 18-20 Stunden bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li><li> (Optional) Wiederholen Sie 3-8 an der gleichen MOI mit SHC001H (Leervektor shRNA Control) in der Systemsteuerung Dish A und SHC002H (Rührei shRNA control) in Control Dish B. Behandeln Sie diese Gerichte identisch mit dem experimentellen Speisen während des ganzen Experiments. </li><li> Tag 3 - Ändern Sie die Medien. Saugen Sie Virus-haltigen Medien und fügen frische komplette Medien (ohne Hexadimethrinbromid). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 2. Gönnen vernickeltZellen mit therapeutischen Komponente / Reagenz <ol><li> Tag 4 - absaugen Medien aus Brunnen und fügen neue Medien mit therapeutische Komponente in der optimalen Konzentration. Wie bei Kulturbedingungen wird Behandlungen variieren und richtige Konzentration und Dauer sollte vorher bestimmt werden. In unserer Studie haben wir 100 ng / ml TRAIL und 1 uM Paclitaxel. Die Zellen wurden für 48 Stunden behandelt. </li><li> Die überlebenden Zellen sollten in T75 Flaschen erneut ausgesät werden und dürfen bis fast 100% konfluent zu erweitern. </li><li> (Optional) Am Ende der Auswahl, inspizieren Steuerung Dish A and Control Dish B. Dish A und B Dish sollte jeder haben weniger Kolonien als mindestens einer der zusammengefassten Bibliothek Gerichte. Wenn es eine unerwartet hohe Anzahl von Kolonien in Dish sind A, als entweder die Transduktion Prozess hat einen Weg im Zusammenhang mit dem gewünschten Phänotyp oder den selektiven Druck beeinflusst nicht intensiv genug ist und re-Optimierung des Assays kann erforderlich sein. Wenn Dish B enthält zu viele Kolonien, Dann Expression von shRNA und das Engagement der RNAi-Weg kann einen Einfluss auf den Phänotyp des Interesses. Wenn dies der Fall wiederholen mit SHC001H, um sicherzustellen, dass die Wirkung nicht spezifisch für SHC002H. </li></ol> 3. Dekonvolution von einer polyklonalen Zellpopulation <ol><li> Ernten Sie die heterogene Population von Zellen, die aus jedem Teilpool und zu isolieren, genomische DNA. In unserer Studie wurden die Zellen kurz in PBS gewaschen und trypsiniert vor genomische DNA wurde unter Verwendung der GenElute Mammalian Genomic Miniprep Kit und versorgt Protokoll (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativ kann auch jede andere genomische Aufreinigungskits, die derzeit auf dem Markt für DNA-Isolierung verwendet werden. Es ist wichtig zu Protokoll Empfehlungen für den Grundbetrag von kultivierten Zellen folgen. </li><li> PCR-Amplifikation von Zielen. Die shRNA Vorlage Recovery-Prozedur ermöglicht Amplifikation des gesamten Pool von shRNA-Einsätze von der ausgewählten Zelle Bevölkerung oder das Abrufen von indiviDual shRNA Vorlagen aus Kolonien, die einzeln aufgenommen und erweitert worden. Nach der Verstärkung der shRNA Einsätze aus Kontrolle und ausgewählte Zielzellen kann die PCR-Produkte sequenziert werden. </li><li> Das PCR-Amplifikation Schritt wurde optimiert mit Sigma ReadyMix, Katalog-Nr P2893. Andere Reagenzien können zur Verstärkung eingesetzt werden, aber das Radfahren Bedingungen und / oder Magnesium-Konzentration Möglicherweise müssen Sie für eine erfolgreiche Amplifikation geändert werden. Amplifikationsprimer in der Konzentration 20 mM mit dem LentiPlex Kit enthalten. </li><li> Richten Sie die PCR-Reaktion wie in Tabelle 1 beschrieben. Fügen Sie die Komponenten in der aufgeführten Reihenfolge. Die beschriebenen Mengen sind für einen 50 &amp;mgr; Reaktion. Weitere Reaktionen, Maßstab der Master-Mix-Komponenten durch die gewünschte Anzahl von Reaktionen und beinhalten 10% Überschuss. Die Menge an DNA-Template wird empfohlen 50-100 ng. </li><li> Es wird dringend empfohlen, die für eine Reaktion der Vorlage der MISSION shRNA menschliche Positive Control Vector verdünnt, um die appropr bestehtiate Konzentration. Erfolgreiche Amplifikation mit dieser Vorlage zeigt, dass die PCR-Assay-Komponenten und Radfahren Bedingungen angemessen sind. Hinweis: Um zu verhindern, Verschleppung der experimentellen Proben und Reagenzien, wird vorgeschlagen, dass die positive Kontrolle in einem separaten Ort, von dem anschließenden PCR-Reaktionen sind eingerichtet verdünnt werden. </li><li> Speichern Sie die PCR-Programm in Tabelle 2 in Ihre Thermocycler aufgeführt. </li><li> Für jede Probe kombinieren 3 ul PCR-Reaktion mit 1 ul Farbstoff und Elektrophorese neben 5 ul DirectLoad ™ PCR 100 bp Low Ladder, Catalog Number D3687 auf einem 1% Agarosegel auf das Vorhandensein von einem 309 bp Amplikon zu bestätigen. </li><li> Subklonierung von PCR-Produkte: PCR-Produkte wurden TOPO kloniert mit dem TOPO-TA Cloning Kit nach Protokoll des Herstellers (Invitrogen, K4575-01). Das Ergebnis ist, dass man PCR-Produkt in jedem Vektor enthalten ist. </li><li> 250 Einzel-Bakterienkolonien (jeweils eine individuelle PCR Amplikon) wurden isoliert und wachsenn in 2 mL Kulturen LB mit 100 mg / mL Ampicillin. Plasmid-DNA wurde dann extrahiert mit der GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> Gereinigte Plasmid-DNA wurde mit EcoRI verdaut und elektrophoretisch auf das Vorhandensein des Einsatzes zu bestätigen. </li><li> Plasmid-DNA Proben wurden dann sequenziert und die shRNA einfügen, die anhand des LentiPlex shRNA Sequenz Suche in der Datenbank mit dem LentiPlex Bibliothek zur Verfügung gestellt. </li></ol> 4. Target-Identifizierung und-Validierung <ol><li> Die shRNA-Sequenz initiiert mit 5&#39;-GAAACACCGG-3 &#39;. Geben Sie mindestens die nächsten 10, aber weniger als 21 Nukleotiden, wie die Abfrage-Sequenz in das Suchfeld auf der beiliegenden shRNA Sequenz Search Access-Datenbank zu bilden. </li><li> Wählen Sie die Art der gepoolten shRNA. Optional können Sie das Teilpool aus dem die Sequenz gefunden wurde. </li><li> Jetzt auf &quot;Find Potenzielle Hits&quot;-Taste, um die Suche durchzuführen klicken. Diese sollten die entsprechenden TRC shRNA-Sequenz (en), th Spiele-Sequenzierung Daten. Mehr Informationen über die TRC shRNA Sequenz (en) identifiziert und die entsprechenden Gen-Targets können ohne weiteres bei Sigma-Aldrich Your Favorite Gene gefunden werden: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Identified Zielgene sollte durch Wiederholung der ursprünglichen Screening-Test mit dem Original TRC Klon plus mindestens zwei weitere shRNAs, dass das gleiche Gen mit einem 1 zu 1 shRNA-Well-Format Ziel validiert werden. Echte Hits zeigt den gleichen Phänotyp in der Mehrzahl der Brunnen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine LentiPlex gebündelt Bildschirm Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt sind. Transduzierten Zellen, die in Gegenwart von TRAIL und Paclitaxel vermehrt durften expandieren, bis Kolben wurden konfluent. Genomische DNA wurde geerntet und die PCR-Amplifikation und Klonierung, wie in Abbildung 1 dargestellt A, bevor sie für die Sequenzierung und shRNA Identifizierung vorgelegt, wie in Figu beschriebenre 1 C. 250 Klone wurden sequenziert, von diesen 25 wurden durch mehrere Klone vertreten und die restlichen 225 wurden nur um 1 Klon vertreten und wurden zu dieser Zeit nicht verfolgt. Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurden mehrere Kandidatengene einschließlich TBX3, PPP2CA und AKT2 durch mehrere Klone vertreten. Die T-box-Transkriptionsfaktor, erschien TBX3 in insgesamt vier Klone und hat in der Tumor-Migration 5 in Verbindung gebracht. PPP2CA Herunterregulation wurde gezeigt, dass das Wachstum von LNCaP-Zellen in Androgen-Mangel Bedingungen kultiviert durch Entlastung der Androgen-Deprivation-induzierten Zellzyklusarrest und Verhinderung von Apoptose 6 zu halten. AKT2 ist ein RAC-beta Serin / Threonin-Proteinkinase und vermeintlichen Onkogen nachgewiesen, dass mehrere Rollen in der Entwicklung von Krebs 7, 8 zu spielen. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> * Final Konzentration von Mg 2 + in Lösung 3 mm betragen;1,5 mm von der Taq ReadyMix und 1,5 mm von der Magnesiumchlorid-Lösung beigetragen. Tabelle 1. Lentiplex PCR-Reaktionsbedingungen <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tabelle 2" /> Tabelle 2. Lentiplex PCR Amplification Programm <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Abbildung 1c" /> Abbildung 1. (A) LentiPlex Bildschirm gebündelt, (B) Polyklonale Dekonvolution Workflow und (C) Identifizierung von shRNA Ziele. A. LentiPlex gebündelt Bildschirm. Erstens Seed-Zellen, dann fügen Sie shRNA Unterpools, (10 Pools insgesamt, jeweils in dreifacher Ausführung durchgeführt, für 30 Gerichte insgesamt). Als nächstes mit therapeutischen Komponente / Reagenz (in unserem Fall, TRAIL und Pa behandelnclitaxel jeweils). Dann reseed überlebenden Zellen in Flaschen und damit zu erweitern. Ernte heterogene Population von Zellen, die aus jedem Teilpool und zu isolieren, genomische DNA. B. Polyklonale Entfaltung. Führen Sie die PCR, DNA, welche die shRNA einfügen zu verstärken. Das PCR-Produkt ist eine einheitliche Größe, sondern polyklonalen in Folge seit der Vorlage gDNA wurde auch polyklonal. PCR-Produkt wird in den Vektor kloniert und anschließend in kompetente Bakterien transformiert. C. Identifizierung von shRNA Ziele. Einzelne Kolonien werden isoliert und Plasmid-DNA wird extrahiert. Jeder Klon enthält den Klonierungsvektor mit einer einzelnen PCR-Fragment. Plasmid-DNA wird verdaut, um die Anwesenheit des Inserts sequenziert und zu bestätigen. Die shRNA Einsatz ist, die anhand des LentiPlex shRNA Sequenz Suche in der Datenbank. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Identifiziert werden könnenKandidatengene. 25 Kandidatengene identifiziert, hatte mehrere Treffer. 225 Kandidaten-Gene hatte nur 1-Hit und wurden nicht weiter verfolgt. Bitte beachten Sie Ergänzende Tabelle 1 für eine Aufschlüsselung der einzelnen Klone pro Kandidatengen. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Ergänzende Tabelle 1. Individuelle TRC-Bibliothek Klone aus polyklonalen Sequencing Gene ID identifizierte Hits Detected Clones.

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Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago, und John Swarthout werden von Sigma-Aldrich, welche Werkzeuge und Reagenzien in diesem Artikel verwendet wird eingesetzt.

In dieser Studie präsentieren wir eine genomweite Bildschirm, um Gene in Zytotoxizität von A549-Zellen nach Paclitaxel / TRAIL-Behandlung beteiligt sind. Die Verwendung einer gepoolten Ansatz in einer genomweiten Screen reduziert die Zeit, Kosten und Ausrüstungsinvestitionen in der Regel mit konventionellen angeordnet Bildschirmen verbunden. Entscheidend für den Erfolg des Bildschirms sind die Optimierung Experimente durchgeführt vorher. Transduction Bedingungen und MOI muss empirisch ermittelt werden. Die Auswahl-Methode sollte für robuste Auswahl von Zellen, die den gewünschten Phänotyp (zB Überleben, Oberfläche Proteinexpression, etc) zu ermöglichen. Die Optimierung dieser Parameter wird die Anzahl der Fehlalarme erkannt. Hier wurde gDNA von der Masse der Bevölkerung der ausgewählten Zellen geerntet und dann TOPO kloniert, um individuelle shRNA Einsätze zu identifizieren. Eine mögliche Verbesserung für dieses Experiment wäre es gewesen, für lebende Zellen mit FACS, um sicherzustellen, wählen Sie habendass nur lebende Zellen gesammelt werden. Die identifizierten Ziele werden durch Transduktion mit target-spezifischen shRNAs in einem Screening-Test bestätigt werden. Echte Hits zeigt den Phänotyp in der Mehrzahl der Brunnen. Die LentiPlex Pooled-Bibliothek ist in seiner Anwendung flexibel. Es ist kompatibel mit einer breiten Palette von Downstream-Anwendungen und kann entweder mit positiven oder negativen Selektion Strategien verwendet werden. Abhängig von der Screening-Bedingungen, Entfaltung der shRNA-Einsätze erfolgt über PCR / Klonierung, Microarray-oder Next-Generation-Sequenzierung 9, 10 erreicht. Während die Leistung und Geschwindigkeit dieser Techniken, um RNAi-Screens Dekonvolution gut etabliert ist, eine Beschäftigung mit Microarray-und Next-Generation-Sequencing-Methoden ist die Verfügbarkeit der Bioinformatik Ressourcen und Wissen benötigt, um richtig zu analysieren und zu interpretieren experimentelle Ergebnisse. Die Kosten, die mit diesen Techniken kann oftmals ein Hindernis für die Verpflichtung von genomweiten Screens werden. APCR / Klonen Ansatz, die zwar nicht so leistungsfähig wie Microarrays und der nächsten Generation Sequenzierung ist eine effektive und kostengünstige Alternative. Agilent bietet jetzt ein benutzerdefiniertes Feld auf dem TRC shRNA Bibliothek, um weiter in LentiPlex Bildschirme basieren. Diese Optionen ermöglichen es Forschern, LentiPlex verwenden, um ein breites Spektrum von zellulären Funktionen zu studieren.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex Pooled Array</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> A549-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = en &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq ReadyMix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute Plasmid Miniprep Kit</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Hexadimethrinbromid</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein wesentlicher zellulärer Mechanismus für die Regulation der Genexpression. Die Nutzung der angeborenen Kraft dieses System ermöglicht es uns, Knockdown Genexpression zu einem Verlust der Genfunktion Studien. Es gibt zwei Methoden für die Durchführung von RNAi. Der erste ist der Einsatz von small interfering RNAs (siRNAs), die chemisch synthetisiert werden, und die zweite nutzt kurz-Haarnadel RNAs (shRNAs) innerhalb von Plasmiden 1 kodiert. Letztere können in Zellen transfiziert direkt oder verpackt in Replikation inkompetent lentiviralen Partikeln. Die wichtigsten Vorteile der Verwendung von lentiviralen shRNAs ist die einfache Einführung in eine Vielzahl von Zelltypen, ihre Fähigkeit, stabil in das Genom für die langfristige Gen Knockdown und Auswahl zu integrieren, und ihre Wirksamkeit bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Verlust der Funktion Bildschirme. Um dies zu erleichtern haben wir die LentiPlex gebündelt shRNA Bibliothek erstellt. Die MISSION LentiPlex Menschliche shRNA Pooled Library ist eine genomweite lentiviralen Pool produziert mithilfe eines firmeneigenen Verfahrens. Die Bibliothek besteht aus über 75.000 shRNA Konstrukte aus dem TRC-Sammlung Targeting 15.000 + menschlichen Gene 2. Jede Bibliothek ist für shRNA Vertretung vor Produkt-Release getestet, um robuste Bibliothek Abdeckung zu gewährleisten. Die Bibliothek ist in einem ready-to-use lentiviralen Format bei Titer von mindestens 5 x 10 8 TU / ml über p24-Test zur Verfügung gestellt und ist bereits aufgeteilt in zehn Unterpools von ca. 8.000 shRNA Konstrukte jeder. Amplifikation und Sequenzierung Primer sind auch für Downstream-Target-Identifizierung zur Verfügung gestellt. Frühere Studien wurde eine synergistische Antitumor-Aktivität von TRAIL, wenn sie mit Paclitaxel in A549 Zellen, eine humane Lungenkarzinom-Zelllinie 3, 4 kombiniert. In dieser Studie demonstrieren wir die Anwendung von einer gepoolten LentiPlex shRNA Bibliothek schnell führen eine positive Auswahlbildschirm für Gene in die Zytotoxizität o beteiligtf A549-Zellen, wenn sie TRAIL und Paclitaxel ausgesetzt. Eine Hürde oft mit High-Throughput-Screens angetroffen wird die Kosten und Schwierigkeiten in Dekonvolution, wir haben auch ausführlich eine kostengünstige polyklonalen Ansatz mit traditionellen Sequenzierung.

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MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Hier verwenden wir ein menschliches LentiPlex gebündelt Bibliothek und traditionelle Methoden zur Sequenzierung Gen-Targets zu fördern Überleben der Zelle zu identifizieren. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Dekonvolution ein LentiPlex Bildschirm und Validierung der Ergebnisse.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

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Research

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Biology

18.6K Aufrufe.  Sigma-Aldrich. Hier verwenden wir ein menschliches LentiPlex gebündelt Bibliothek und traditionelle Methoden zur Sequenzierung Gen-Targets zu fördern Überleben der Zelle zu identifizieren. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Dekonvolution ein LentiPlex Bildschirm und Validierung der Ergebnisse.

Serie: MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Forschung

Biologie

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...