פרוטוקול זה הוא השיטה מבוססת התא שלנו להפסקת כולסטרול של רפלוקס כולסטרול בפלזמה ceramal. במיוחד בהקרנות. זה עשוי להיות מיושם כדי לאבחן סיכון קרדיווסקולרי, כדי לזהות או להעריך כולסטרול תחזוקה נמוכה יותר.
טכניקה זו מונעת את הסיכון ואת הנטל כבטיחות עם טיפול בחומרים מוקרינים על ידי מתן תוצאות עם רמות איכות דומות, לאלה של כולסטרול reflux דווח לקשר עם כך, פלזמה או כולסטרול ceramal reflux של מקובל ניתן להשוות, לבקרת הייחוס שלנו עשוי לספק את הסיכון לסבול משיטה זו תחול גם על קווי התא כמו קווי תאים אנושיים אחרים או אפילו שלבי מאקרו ראשיים., שלבי מאקרו או ותאי גזע של לחצן ספריי הנגרמים על ידי אדם. כדי להתחיל בהליך זה, להמיס את הכולסטרול NPD באתנול טהור כדי לקבל פתרון מלאי עם ריכוז סופי של שני micromolar.
לדלל 25 microliters של מלאי הכולסטרול NBD ב AR 10 בינוני כדי להגיע לריכוז הסופי של חמישה micromolar. תאים thp-1 תרבות שלנו 10 בינוני ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כל שלושה ימים להתאים את צפיפות התא ל300000 תאים למיליליטר.
לאחר מכן להשיג צלחת 96 היטב עם תחתית ברורה שטוחה. להומוגניזציה טובה יותר, הכינו 10 מיליליטר של תאי thp-1 בצינור של 15 מיליליטר, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מלאי PMA. מערבבים בעדינות וזרעים 100 מיקרוליטרים של התערובת לתוך בארות הצלחת ב 200, 000 תאים לתוך באר.
ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 48 עד 72 שעות כדי להבדיל את תאי thp-1 לתאי DM thp-1. תחילה לדלל גליצין ב 10% PBS עם מים סטריליים, לריכוז של 200 micromolar ב pH 7.4. מוסיפים 40 מיליליטר של גליצין מדולל ל-10 גרם יתד 8000 להכנת תוסף 20%, ומערבבים במרץ להומוגניזציה.
הבא להחיל ארבעה חלקים של 20% לכל 10 חלקים של מדגם על כל סרום או דגימת פלזמה בצינור 1.5 מ"ל. השאירו את התערובת על הקרח למשך 25 דקות. צנטריפוגה אפוליפופרוטאין B יתד ב 13000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
השלך את המשקעים, והעבר את העל-טבעי לצינור חדש. אחזר את הלוח המכיל את תאי ה- thp-1 המובחנים. הסר והשליך את מדיום התרבות ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS 1X.
הוסף 100 microliters של 5 מיקרומולרים MVD כולסטרול AR-10 בינוני לכל באר. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת להשליך, להשליך את המדיום.
לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף 100 MICROLITERS ABDS, או מקבל שומנים מטוהרים מדולל rpmi 1630 בינוני לריכוז הרצוי לכל באר. כלול פקד שלילי אשר אינם מכילים מקבלי כולסטרול בשליטה חיובית, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד שש שעות. בינתיים, להכין מלאי 200 מיליליטר של פתרון תות תא אחד כפי שמתואר בטקסט.
מערבבים פתרון זה עם אתנול, ביחס נפחי של אחד לאחד כדי לקבל פתרון תזה מדי. לגילוי מדיה וכולסטרול BD, הסר את מדיום התא מהצלחות שנאספו בצלחת לבנה חדשה של 96 באר עם תחתית שטוחה אטומה. הוסף 100 מיקרוליטרים של אתנול טהור ל-100 מיקרוליטרים של כל דגימה בינונית כדי להשיג יחס של אחד לאחד בצלחת החדשה.
באמצעות מד חום, למדוד את עוצמת הפלואורסצנט בגירוי של 463 ננומטר, ו פליטה של 536 ננומטר. לגילוי כולסטרול NBD תאי, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תותבת תזה גם לכל באר, ו דגירה בטמפרטורת החדר, תוך טלטול במשך 25 דקות.
לאחר מכן, למדוד את עוצמת הפלואורסצננט תוך התאמת פרמטר הרגישות ל 50 בתוכנה. לאחר מכן לקבוע את שיעור efflux כולסטרול במידה הסופית של כולסטרול efflux כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דילול כולסטרול NBD באתנול טהור מייצר את ערכי העוצמה הגבוהים ביותר של הפלואורסצנט בעוד תוכן גבוה בתספורת מיקווית, מוריד את העוצמה.
הדבר מצביע על כך ש הפליטה הפלואורסצנטית של מולקולה זו תלויה מאוד במדיום, שבו היא כלולה. בעת שימוש בתערובת של מדיה ואתנול ביחס של אחד לאחד, נראה כי עוצמת הפלואורסצנטי גדלה באופן פרופורציונלי, עם ריכוז של אנלוגי כולסטרול, מה שמרמז כי החללית מתנהגת כראוי בתנאים אלה. כדי לקבוע את משך הזמן הנדרש כדי להדגר את התאים טעון עם מקבלי כולסטרול, התקשורת התא נקצר בנקודות זמן שונות.
efflux כולסטרול התפתח באופן ליניארי מאפס עד שש שעות, עם האות המרבי שנתפס שש שעות לאחר ABDS מתווסף לתאים. סף הרוויה והטווח הדינמי נבדקים על ידי מדידת efflux הכולסטרול באחוזים שונים של HDL המכיל מדיה. בנכס תפוקה גבוהה, efflux מתפתח באופן ליניארי מאחד עד 7%ABDS, להגיע לשיא של קיבולת efflux כולסטרול ב 7%בריכוזים גבוהים מ 7%העוצמה של הפלווסנט פוחתת ביחסים הפוכים עם אחוז ה-ABDS.
הביצועים של השיטה המבוססת על פלואורסצנטיות מוערכים לאחר מכן על ידי השוואתה לטכניקת הרדיו הסטנדרטית המסומת. שתי הטכניקות מתואמות מאוד בעת שימוש בריכוזים שונים של ABDS. השיטה המתוארת רגישה לעלייה של ריכוזי מקבל בתוך ערכי efflux כולסטרול בין חמישה ל 15%, חשוב לוודא כי celluarizer אינו מכיל אגרגטים.
נקודה קריטית היא לדרג סביבה המכילה אתנול מצרפי, כדי למדוד את הפלואורסצנטיות במשקל הומוגני ואופטימלי. בעקבות הליך זה, שם כולסטרול טכני ניתן למדוד, ואת ההשפעה של תרופות במסלול efflux כולסטרול ניתן לקבוע. גם בית הספר בסופו של דבר לשמש אבחון כדי התחת סיכון קרדיווסקולרי.
אנו מאמינים כי שיטה זו היא הרבה יותר קלה ובטוחה מאשר השיטה הסטנדרטית הרדיואקטיבית. עם זאת הוא עדיין תלוי תא. אנא זכרו כי אתנול הוא פתי ויש לאחסן אותו ולטפל בו בהתאם.
